Unieruchomienie wypławków, częściowe napromienianie i przeszczep tkanek

Podsumowanie

Opisana jest skuteczna metoda szczepienia tkanki o określonej i stałej wielkości między płaszczyznami. Dołączono również opis, w jaki sposób technika unieruchamiania stosowana do przeszczepiania może być zaadaptowana, w połączeniu z ołowianymi osłonami, do częściowego napromieniania żywych zwierząt.

Streszczenie

Planarian, płaziniec słodkowodny, okazał się być potężnym systemem do analizowania regeneracji metazoanów i biologii komórek macierzystych^1,2. Wypławkowa regeneracja brakujących lub uszkodzonych tkanek jest możliwa dzięki dorosłym komórkom macierzystym zwanym neoblastami³. Chociaż ostatecznie wykazano, że te komórki macierzyste są pluripotencjalne i wyjątkowo zdolne do odtworzenia całego zwierzęcia⁴, niejednorodność w populacji komórek macierzystych i dynamika ich zachowań komórkowych pozostają w dużej mierze nierozwiązane. Ze względu na dużą liczbę i szerokie rozmieszczenie komórek macierzystych w całym planie ciała wypławka, potrzebne są zaawansowane metody manipulowania subpopulacjami komórek macierzystych do badań molekularnych i funkcjonalnych in vivo.

Przeszczep tkanek i częściowe napromienianie to dwie metody, dzięki którym subpopulacja komórek macierzystych wypławków może zostać wyizolowana do dalszych badań. Każda technika ma odrębne zalety. Przeszczep tkanek pozwala na wprowadzenie komórek macierzystych do naiwnego gospodarza, które są albo z natury genetycznie odrębne, albo były wcześniej leczone farmakologicznie. Alternatywnie, częściowe napromienianie pozwala na wyizolowanie komórek macierzystych w organizmie gospodarza, zestawionych z tkanką pozbawioną komórek macierzystych, bez wprowadzania rany lub jakiegokolwiek naruszenia integralności tkanki. Korzystając z tych dwóch metod, można zbadać autonomiczne i nieautonomiczne czynniki komórkowe, które kontrolują funkcje komórek macierzystych, takie jak proliferacja, różnicowanie i migracja.

Zarówno przeszczep tkanek^5,6, jak i częściowe napromienianie⁷ były historycznie używane do definiowania wielu pytań dotyczących regeneracji wypławków, które są nadal badane. Techniki te pozostały jednak niedostatecznie wykorzystywane ze względu na pracochłonny i niespójny charakter poprzednich metod. Przedstawione tutaj protokoły stanowią duży krok naprzód w zmniejszaniu czasu i wysiłku niezbędnego do powtarzalnego generowania dużej liczby szczepionych lub częściowo napromienianych zwierząt ze skutecznością bliską 100 procent. Zajmujemy się hodowlą dużych zwierząt, unieruchomieniem, przygotowaniem do częściowego napromieniania, przeszczepem tkanek oraz optymalizacją rekonwalescencji zwierząt. Co więcej, opisana tu praca demonstruje pierwsze zastosowanie metody częściowego napromieniania do stosowania z najszerzej badanym wypławkiem, Schmidtea mediterranea. Dodatkowo, skuteczne przeszczepianie tkanek w wypławkach otwiera drzwi do testowania funkcjonalnego subpopulacji naiwnych lub leczonych komórek macierzystych w testach ponownego populacji, co od dawna jest złotym standardem w oznaczaniu potencjału dorosłych komórek macierzystych u ssaków⁸. Szerokie zastosowanie tych technik bez wątpienia doprowadzi do lepszego zrozumienia zachowań komórkowych dorosłych komórek macierzystych podczas homeostazy i regeneracji tkanek.

Protokół

Uwaga: ten protokół sugeruje użycie potencjalnie niebezpiecznych materiałów (ołów i chloreton). Nabierz, przeczytaj i postępuj zgodnie z kartą charakterystyki dla wszystkich potencjalnie niebezpiecznych materiałów.

1. Hodowla, selekcja i przygotowanie zwierząt

1. Do hodowli zwierząt i obchodzenia się z nimi należy używać wody z wypławkami (1X sole Montjuïc⁹) i plastikowych pipet transferowych.
2. Biotyp płciowy Schmidtea mediterranea może być wykorzystany w warunkach hodowli w laboratorium w normalnych warunkach hodowli¹⁰. Aby wytworzyć bezpłciowe okazy o wymaganej wielkości, S. mediterranea hodowany w temperaturze pokojowej w normalnych warunkach⁹ powinien być karmiony z dwu- lub trzykrotnie większą normalną częstotliwością (2-3 razy w tygodniu) przez jeden do dwóch miesięcy przed użyciem. Alternatywnie, zwierzęta bezpłciowe karmione z normalną częstotliwością mogą być trzymane w temperaturze 10 stopni Celsjusza przez czas nieokreślony w celu zwiększenia ich średniej wielkości.
3. Wybierz zwierzęta, które mają od 1 do 2 cm długości i więcej niż 2 mm, a następnie głodź zwierzęta 3-7 dni przed użyciem.
4. W przypadku wykonywania jakichkolwiek zabiegów farmakologicznych lub radiologicznych na przeznaczonych do tego żywicielach, dawcach lub częściowo napromieniowanych zwierzętach, należy w tym momencie przeprowadzić zabieg(-i).
5. Jeśli przeprowadzono leczenie farmakologiczne, które wymagało karmienia zwierząt, należy je zagłodzić dodatkowo 3 do 7 dni przed użyciem.

2. Przygotowanie roztworów i materiałów

1. Przygotuj roztwór chloretonu, łagodny środek znieczulający miejscowo, rozpuszczając 0,1-0,2% w/v chloretonu w wodzie nakłuwającej i schładzając roztwór na lodzie.
2. W przypadku wykonywania tylko częściowego napromieniania należy przejść do kroku 2.7. W przypadku przeszczepu tkanek przejdź do kroku 2.3.
3. Za pomocą palnika Bunsena zegnij rurki kapilarne o średnicy wewnętrznej 0,75 mm, służącej do cięcia tkanki przeszczepu, oraz o średnicy zewnętrznej 0,7 mm, służącej do tworzenia otworu w żywicielu, który przyjmie przeszczep, rurki kapilarne pod kątem 90° w odległości 1-2 cm od końca każdej rurki. Aby zaoszczędzić materiały, zegnij oba końce każdej rurki kapilarnej i przełam je na pół, aby uzyskać dwa narzędzia. Uważaj, aby nie podpalić samych końców rurek.
4. Przytnij następujące papiery do wskazanych rozmiarów:
   • Bibuła filtracyjna (pocięta na prostokąty ok. 2,5 cm x 1,5 cm)
   • Bibuła filtracyjna Whatman #3 (pocięta na prostokąty ok. 2 cm x 0,5 cm)
   • Kimwipe (złożony i pokrojony w zwitki ok. 3 cm x 0,5 cm x 4 warstwy)
   • Bibułka do skręcania papierosów (usunąć pasek gumy i pokroić na prostokąty o wymiarach ok. 3 cm x 2 cm)
5. Przygotować zmodyfikowany roztwór Holtfretera (3,5 g/l NaCl, 0,2 g/l_NaHCO3, 0,05 g/l KCl, 0,2 g/l_MgSO4, 0,1 g/l CaCl₂, pH 7,0-7,5) i nasycony kazeiną roztwór Holtfretera i schłodzić oba do temperatury 4 °C.
6. Przymocuj złożoną Kimwipe do kwadratu Parafilmu i umieść na płycie chłodzącej Peltiera lub innym urządzeniu chłodzącym umieszczonym pod mikroskopem preparacyjnym. Nasącz Kimwipe schłodzonym roztworem Holtfretera i umieść dwa prostokąty z czarnej bibuły filtracyjnej na Kimwipe.
7. Wyłóż szalki Petriego bibułą filtracyjną Whatman #2. Zwilż bibułę filtracyjną roztworem Holtfretera i schłodzić naczynia na lodzie. Do częściowego napromieniania można użyć większego naczynia i wkładki z bibuły filtracyjnej.

3. Znieczulenie i unieruchomienie

1. Napełnij szalkę Petriego schłodzonym roztworem chloretonu i pipetuj robaki do naczynia. Do przeszczepu należy znieczulać tylko jednego gospodarza i jednego dawcę na raz. W przypadku częściowego napromieniania wiele (n > 10) zwierząt może być znieczulonych jednocześnie.
2. Pozwól robakom zanurzyć się w roztworze chloretonu, aż staną się nieruchome (5-10 min).
3. Opłucz robaki, pipetując je do naczynia wypełnionego schłodzonym roztworem Holtfretera.
4. Unieruchomić zwierzęta, pipetując je na czarną bibułę filtracyjną nasączoną schłodzonym roztworem Holtfretera i ustawić je brzusznie do dołu za pomocą kleszczy. Jeśli zwierzęta są w stanie przemieszczać się, wchłoń nadmiar roztworu Holtfretera, nieznacznie obniż temperaturę Peltiera lub zimnej płytki lub zwiększ czas trwania chloretonu.

4. Częściowe napromieniowanie

Uwaga: Postępuj zgodnie z poniższymi krokami, aby przygotować zwierzęta do częściowego napromieniowania. Jeśli zamiast tego wykonujesz przeszczep, przejdź do sekcji 5.

1. Umieść schłodzoną szalkę Petriego z kroku 2.7 na lodzie w wiaderku na lód, które zmieści się w promienniku promieniowania rentgenowskiego z górnym źródłem promieniowania.
2. Ułóż znieczulone zwierzęta na szalce Petriego, przesuwając czarną bibułę filtracyjną, na której są unieruchomione. Używanie kleszczy do bezpośredniego przenoszenia znieczulonych robaków może je zranić.
3. Przenieś ułożone zwierzęta do promiennika rentgenowskiego z górnym źródłem i ustaw wiadro na lód w taki sposób, aby odległość od lampy katodowej do zwierząt była zminimalizowana, maksymalizując w ten sposób efektywną moc dawki.
4. Umieść osłonę(y) przewodu (rysunki 1) między zwierzętami a lampą katodową zgodnie z potrzebami. Ekrany powinny mieć grubość od 4,5 do 6 mm, aby umożliwić tłumienie wiązki promieniowania rentgenowskiego 325 kV od 97 do 99%¹¹.
5. Dostarczyć dawkę promieniowania rentgenowskiego. Jeśli pożądana jest całkowita ablacja komórek macierzystych z obszarów nieosłoniętych, należy dostarczyć 30 Gy lub więcej za pomocą promiennika rentgenowskiego. Dla porównania, 30 Gy odpowiada 3,6 minuty przy 320 kilowoltach i 10 miliamperach w XRAD320 Precision X-Ray Inc. z odległością pola do źródła wynoszącą 30 centymetrów.
6. Natychmiast po zakończeniu dozowania, dotykając robaków za czarną bibułę filtracyjną, przenieś zwierzęta do schłodzonej wody wypławkowej. Pozwól, aby płaśnik ogrzał się do temperatury pokojowej, a zwierzęta usunęły się z czarnej bibuły filtracyjnej. Procedura częściowego napromieniania została zakończona.

5. Przeszczep tkanek

1. Za pomocą pipety transferowej i kleszczy ułóż znieczulone robaki gospodarza i dawcy na oddzielnych prostokątach czarnej bibuły filtracyjnej na Kimwipe, która została schłodzona na płytce Peltiera lub chłodnicy pod mikroskopem preparacyjnym.
2. Za pomocą rurki kapilarnej o średnicy wewnętrznej 0,75 mm wytnij czop przeszczepu od dawcy i za pomocą kleszczy umieść go na niewidocznej części żywiciela. Jeśli materiał do przeszczepu utknie w rurce kapilarnej, usuń go kleszczami.
3. Za pomocą rurki kapilarnej o średnicy zewnętrznej 0,7 mm usuń zatyczkę z gospodarza i za pomocą kleszczy umieść przeszczep w pozostawionym otworze.
4. Przenieść przeszczepionego żywiciela na jego czarnym prostokącie z bibuły filtracyjnej na szalkę Petriego przygotowaną w kroku 2.7.
5. Zwilż kawałek bibułki roztworem Holtfretera nasączonym kazeiną i umieść go na przeszczepionym żywicielu, jak pokazano na rysunku 2A.
6. Namoczyć cztery kawałki bibuły filtracyjnej w nasyconym kazeiną roztworze Holtfretera i zamknąć przeszczepionego gospodarza, jak pokazano na rysunku 2B.
7. Namocz cztery zwitki pokrojonego Kimwipe w nasyconym kazeiną roztworze Holtfretera i połóż je na bibule filtracyjnej z kroku 5.6 (Rysunek 2B). Załóż pokrywkę i połóż szalkę Petriego na lodzie.
8. Przenieś robaka dawcy do wody wypławkowej, aby wyzdrowieć, wyleczyć i zregenerować się.
9. Po zakończeniu wszystkich przeszczepów należy umieścić przeszczepione robaki na noc w inkubatorze o temperaturze 10 °C.
10. Następnego ranka, uważając, aby nie naruszyć przeszczepu, odkryj robaka i przenieś go (na czarnej bibule filtracyjnej) na szalkę Petriego wypełnioną wodą z wypławków.
11. Pozwól robakowi wysunąć się z bibuły filtracyjnej lub delikatnie usuń go kleszczami.
12. Zmieniaj wodę wypławkową raz na 2-3 dni.

6. Reprezentatywne wyniki

Bezpośrednio po częściowym napromieniowaniu planaria będą wyglądały normalnie i nienaruszone. W zależności od dostarczonej dawki i geometrii zastosowanej osłony, napromieniowana tkanka może ulec regresji, a nawet rozpadnąć^{się 7}. Osłonięta tkanka powinna pozostać nienaruszona. Po regresji tkanki i utracie integralności tkanek utworzy się blastema, a brakujące struktury zostaną zregenerowane (ryc. 3A). Jeśli amputacja zostanie wykonana w obszarze częściowo napromieniowanym, napromieniana tkanka zostanie uratowana (tj. zapobiegnie regresji lub rozpadowi) (ryc. 3B). Zarówno u osób zdrowych, jak i po amputacji regeneracja będzie opóźniona w porównaniu z amputowaną nienapromieniowaną wypławką (ryc. 3C). Jeśli podano dawkę promieniowania rentgenowskiego 30 Gy, a częściowo napromieniowane zwierzę nie było uszkodzone, udana ablacja komórek macierzystych we wzorze odpowiadającym zastosowanej osłonie ołowianej może zostać potwierdzona 2 do 3 dni po częściowym napromieniowaniu przez hybrydyzację in situ dla markera komórek macierzystych Smed-piwi-1¹² (znanego również jako smedwi-1) (Figura 4).

Następnego ranka po przeszczepie, udany przeszczep przeszczepionej tkanki powinien być widoczny w tkance gospodarza, przylegając zarówno do grzbietowej, jak i brzusznej powierzchni gospodarza (Rysunek 5A). Czasami przeszczep przylega tylko do powierzchni brzusznej lub grzbietowej. Jeśli przeszczep zakończył się całkowitym niepowodzeniem, nie będzie widoczny żaden ślad przeszczepu ani na grzbietowej, ani brzusznej powierzchni gospodarza (ryc. 5B). Wkrótce po udanym przeszczepie nienapromieniowanej tkanki do gospodarza, który został ablowany z komórek macierzystych przez śmiertelne napromieniowanie^13,14, hybrydyzacja in situ dla Smed-piwi-1 ujawni, że komórki macierzyste są obecne głównie w przeszczepie (Figura 5C). Dodatkowo, udane przeszczepy nienapromieniowanej tkanki do śmiertelnie napromieniowanych gospodarzy spowodują uratowanie tkanki gospodarza i długoterminowe przeżycie gospodarza¹⁵.

Rysunek 1. Ogólne rozmieszczenie podstawowych elementów do częściowego napromieniowania. W promienniku rentgenowskim z umieszczonym u góry źródłem promieniowania rentgenowskiego (lampą katodową) znieczulony wypławk jest umieszczony bezpośrednio pod źródłem promieniowania rentgenowskiego w polu napromieniowania. Aby zmaksymalizować szybkość dawki promieniowania rentgenowskiego, należy zminimalizować odległość między wypławkiem a źródłem promieniowania rentgenowskiego. Ołowiana osłona powinna być umieszczona między rurką katodową a znieczulonym ślimakiem, jak najbliżej ślimaka. Ołowiana osłona powinna być zaprojektowana, wyprodukowana i umieszczona tak, aby osłaniała pożądaną tkankę, ale całkowicie odsłaniała resztę robaka. Wielu producentów komercyjnych będzie produkować niestandardowe osłony ołowiane na podstawie prostego schematu projektowego; z powodzeniem korzystaliśmy z usług firmy Alpha Systems Corp. (Bluffdale, UT). Przewód powinien być wystarczająco gruby, aby umożliwić uzyskanie pożądanej ilości ekranu. Na przykład, jeśli pożądane jest prawie całkowite ekranowanie wiązki promieniowania rentgenowskiego 320 kV, przewód powinien mieć grubość od 4,5 do 6 mm. Wypławka i tarcza są umieszczone na nasączonej bibułą filtracyjną szalce Petriego, która spoczywa w wiaderku z lodem. Biorąc pod uwagę wystarczająco duże pole napromieniowania rentgenowskiego i liczbę identycznych osłon ołowianych, wiele próbek może być częściowo napromieniowanych w tym samym czasie (brak na zdjęciu).

Rysunek 2. Budowa komory odzysku. (A) Widok w rozłożeniu na eksplozję komory do odzyskiwania przeszczepów tkanek, pokazujący wszystkie składniki, które są ułożone jeden na drugim po namoczeniu w roztworze Holtfretera nasyconym kazeiną. (B) Prawie ukończona komora regeneracyjna, ilustrująca zazębiające się rozmieszczenie prostokątów z bibuły filtracyjnej Whatman #3, które ściśle otaczają znieczuloną wypławkę, zapobiegając ruchowi podczas gojenia. Staranna konstrukcja komory rekonwalescencji zapobiega przemieszczaniu się i wysuszaniu zwierząt, sprzyjając szybkiemu gojeniu i większej skuteczności przeszczepu tkanek.

Rysunek 3. Reprezentatywne wyniki prostego częściowego napromieniania a posteriori. Jak^opisał Dubois, 7, (A), kiedy tylna połowa wypławków została osłonięta ołowiem, a następnie wystawiona na promieniowanie rentgenowskie, zaobserwowano, że przednia tkanka cofa się z powrotem do granicy między napromieniowaną a osłoniętą tkanką, w którym to momencie utworzyły się niepigmentowane blastemy, a zwierzęta zaczęły się regenerować. (B) Z drugiej strony, gdy zwierzętom odcięto głowy po tym samym częściowym napromieniowaniu, które przeprowadzono w (A), nie zaobserwowano regresji tkanek i pozostała napromieniowana tkanka przednia została uratowana. U zwierząt, którym odcięto głowy, częściowo napromieniowano, zregenerowano głowy (B), jednak regeneracja była znacznie opóźniona w porównaniu z nienapromieniowanymi odciętymi głowami (C).

Rysunek 4. Reprezentatywny wynik częściowej ablacji komórek macierzystych po częściowym napromieniowaniu. Hybrydyzacja in situ w całości (WISH) dla markera komórek macierzystych Smed-piwi-1 ujawnia, że wypławki typu dzikiego mają komórki macierzyste rozmieszczone w całym ciele, z wyjątkiem tkanki poprzedzającej fotoreceptory (grot strzały) i gardła właściwego (gwiazdka)¹⁴. (A) ŻYCZENIE dotyczące Smed-piwi-1 w napromieniowanej, ale w pełni osłoniętej wypławki kontrolnej, utrwalonej trzy dni po napromieniowaniu, wykazuje rozmieszczenie komórek macierzystych, które jest nie do odróżnienia od rozmieszczenia wypławków typu dzikiego. (B) Z drugiej strony, badanie WISH for Smed-piwi-1 u zwierząt, które były tylko częściowo osłonięte, pozostawiając odsłoniętą część przednią i tylną, ale również utrwalone trzy dni po napromieniowaniu, pokazuje, że komórki macierzyste są ablowane z obszarów nieosłoniętych. Podziałka ma średnicę 500 mikronów.

Rysunek 5. Przykłady udanego i nieudanego przeszczepu tkanek. (A) Obrazy na żywo widoków grzbietowych i brzusznych pomyślnie przeszczepionego wypławka trzy dni po przeszczepie. Przeszczep (wskazany) jest wyraźnie widoczny zarówno na powierzchni grzbietowej, jak i brzusznej i jest otoczony charakterystyczną niepigmentowaną tkanką na granicy przeszczep-gospodarz. (B) W związku z tym, nieudane przeszczepy nie wykazują widocznej tkanki przeszczepu w miejscu przeszczepu (wskazane), a zamiast tego pokazują zagojoną, niepigmentowaną, boczną ranę po nieudanym przeszczepie. Przeszczep, który przylega tylko do powierzchni grzbietowej lub brzusznej, może przypominać udany przeszczep (A), gdy patrzy się na niego z jednej strony, a nieudany przeszczep (B), gdy patrzy się na niego z drugiej. (C) Gdy tkanka typu dzikiego (wt) jest przeszczepiana do napromieniowanego gospodarza, który został poddany ablacji rezydujących komórek macierzystych, a przeszczepione komórki macierzyste są następnie ujawniane przez WISH for Smed-piwi-1 dwa dni po przeszczepie, powodzenie przeszczepu jest wyraźnie widoczne poprzez specyficzną obecność komórek macierzystych tylko w miejscu przeszczepu lub wokół niego (groty strzałek). Podziałka ma średnicę 500 mikronów.

Dyskusja

Znaczenie unieruchomienia

Unieruchomienie jest zdecydowanie najważniejszym krokiem dla pomyślnego zakończenia któregokolwiek z tych procesów. Jeśli wypławki są nieprawidłowo unieruchomione przed częściowym napromieniowaniem, mogą przesunąć się pod osłonę ołowianą, powodując niespójne i mylące wyniki. Dodatkowo, jeśli zwierzęta są niewystarczająco unieruchomione po przeszczepie, robak gospodarza prawdopodobnie odsunie się od tkanki przeszczepu, co spowoduje niepowodzenie prawidłowego gojenia się p...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Pipeta transferowa ogólnego przeznaczenia	Samco	691
Rurki kapilarne (ID 0,75 mm)	FHC	30-30-0
Rurki kapilarne (OD 0,7 mm)	FHC	30-50-08
Parafilm M	VWR	52858-076
Kimwipes 34155	VWR	500029-891
Bibuła filtracyjna	Schleicher Schuell
Bibuła filtracyjna Whatman #2 1002-055 Bibuła	Fisher Scientific	09-810B
Whatman #3 1003-185	Fisher Scientific	09-820E
Bibułka do skręcania papierosów	Zig-Zag, oryginalna	szalka
	VWR	82050-544
Kleszcze DUMONT, INOX #5	FST	11251-20
Chloretone	Sigma Aldrich	112054
Kazeina	Sigma Aldrich	C3400
Lead Shields	Alpha Systems Corp., Bluffdale, UT	Niestandardowy projekt
XRAD-320 Precyzyjny naświetlacz biologiczny	North Branford, CT	NA