Charakterystyka mechanizmów molekularnych zaćmy indukowanej promieniowaniem UVR in vivo

Konstantin Galichanin; Nooshin Talebizadeh; Per Söderberg

doi:10.3791/4016

Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Charakterystyka mechanizmów molekularnych zaćmy indukowanej promieniowaniem UVR in vivo

9.9K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/4016

⸱

28 listopada 2012

Konstantin Galichanin¹^,² , Nooshin Talebizadeh² , Per Söderberg²

¹St. Erik's Eye Hospital, Karolinska Institutet, ²Gullstrand lab, Section for Ophthalmology, Department of Neuroscience, Uppsala University

W tym artykule

Podsumowanie

Katarakta jest główną przyczyną ślepoty na świecie. Promieniowanie ultrafioletowe (UVR) pochodzące ze słońca stanowi główny czynnik ryzyka rozwoju katarakty. Opracowano model zwierzęcy katarakty indukowanej dalekim UVR-B. W niniejszym artykule opisujemy metody badania powstawania katarakty: ekspozycję na UVR, ilościową RT-PCR oraz immunohistochemię.

Streszczenie

Katarakta jest główną przyczyną ślepoty na świecie ¹. Światowa Organizacja Zdrowia definiuje kataraktę jako zmętnienie soczewki oka, które utrudnia przenikanie światła. Katarakta jest chorobą wieloczynnikową, powiązaną z cukrzycą, paleniem tytoniu, promieniowaniem ultrafioletowym (UVR), spożyciem alkoholu, promieniowaniem jonizującym, stosowaniem steroidów oraz nadciśnieniem tętniczym. Istnieją silne dowody eksperymentalne ^2-4 oraz epidemiologiczne ^5,6 wskazujące na to, że UVR wywołuje kataraktę. Opracowaliśmy model zwierzęcy katarakty indukowanej promieniowaniem UVR B zarówno u zwierząt znieczulonych ⁷, jak i nieznieszyczulonych ⁸.

Jedyną metodą leczenia zaćmy jest operacja, jednak nie każda osoba ma do niej dostęp. Szacuje się, że opóźnienie wystąpienia zaćmy o 10 lat mogłoby zredukować zapotrzebowanie na operacje zaćmy o 50% ⁹. Aby opóźnić występowanie zaćmy, konieczne jest zrozumienie mechanizmów jej powstawania oraz znalezienie skutecznych strategii zapobiegawczych. Wśród mechanizmów rozwoju zaćmy apoptoza odgrywa kluczową rolę w inicjowaniu tego procesu u ludzi i zwierząt ¹⁰. W naszych ostatnich badaniach skupiliśmy się na apoptozie w soczewce jako mechanizmie rozwoju zaćmy ^8,11,12. Przewiduje się, że lepsze zrozumienie wpływu UVR na szlak apoptozy otworzy możliwości odkrycia nowych produktów farmaceutycznych zapobiegających zaćmie.

W niniejszym artykule opisujemy, w jaki sposób można eksperymentalnie wywołać zaćmę poprzez ekspozycję in vivo na promieniowanie UVR-B. Ponadto przedstawiamy metodę RT-PCR oraz immunohistochemię jako narzędzia do badania molekularnych mechanizmów zaćmy wywołanej przez UVR-B.

Protokół

1. Ekspozycja na promieniowanie ultrafioletowe

Na 15 min przed naświetlaniem znieczulić samicę szczura Sprague-Dawley za pomocą mieszaniny 90 mg/kg Ketalaru (ketaminy) i 10 mg/kg Rompunu (ksylazyny), podanej w zastrzyku domięśniowym.
Umieścić zwierzę w stabilizatorze dla szczurów i zaciągnąć pasy do momentu unieruchomienia szczura, tak aby nie doszło do nadmiernego ucisku tułowia ¹³.
Podać Mydriacyl (tropikamid), 10 mg/ml, do obu oczu szczura w celu wywołania mydriasis.
Ustawić zwierzę tak, aby jedno oko znajdowało się w wąskiej wiązce UVR o długości fali 300 nm ¹⁴ z szerokością połówkową 10 nm, a oko przeciwległe zasłonić czarną taśmą.
Poddać szczura jednostronnej ekspozycji na podprogową dawkę 1 kJ/m² UVR-B o długości fali 300 nm przez 15 min ¹⁵.

2. Disekcja

Po upływie określonego przedziału czasu po ekspozycji (1, 5, 24 i 120 h), uśmierć sześciotygodniowego szczura (masa < 200 g) poprzez uduszenie dwutlenkiem węgla i zwichnięcie kręgów szyjnych.
Wykonaj enukleację gałek ocznych. Następnie ułóż oko rogówką do dołu, a stroną tylną do góry. Wykonaj niewielki otwór za pomocą kaniuli 27G, przesuwając ją stycznie do twardówki, aby uniknąć uszkodzenia soczewki, która znajduje się bardzo blisko twardówki. Następnie, używając nożyczek do chirurgii okulistycznej, wykonaj cięcie okrężne tuż za limbusie, aż do momentu, gdy tylna część twardówki będzie mogła zostać oddzielona. Następnie wyjmij soczewkę za pomocą tępych pęsety zakrzywionej.
Pod mikroskopem usuń pozostałości ciała rzęsistego z równika soczewki, utrzymując soczewkę w zrównoważonym roztworze soli nie dłużej niż przez 5-10 min.

3. Ilościowa RT-PCR

Umieścić soczewkę w mieszaninie 350 μl buforu lizującego RA1 (zestaw do izolacji całkowitego RNA NucleoSpin RNA II) i 3,5 μl β-merkaptoetanolu w probówce Eppendorfa o pojemności 2 ml.
Przechowywać soczewkę w tej mieszaninie przez 30 min w temperaturze pokojowej.
Homogenizować soczewkę za pomocą igły, aż z soczewki pozostanie jedynie twarde jądro (kora i torebka soczewki ulegają lizie w buforze lizującym). Usunąć jądro z mieszaniny.
Próbki należy niezwłocznie przechowywać w temperaturze -70 °C.
Rozmrozić próbki i postępować zgodnie z protokołem „Oczyszczanie całkowitego RNA z hodowli komórkowych i tkanek” (zestaw do izolacji całkowitego RNA NucleoSpin RNA II).
Próbki RNA przechowywać w temperaturze -70 °C.
Aby zweryfikować wystarczające usunięcie DNA z każdej próbki, przeprowadzić reakcję PCR w następujących warunkach (krok 1: 95 °C przez 2 min; krok 2 przez 40 cykli: 95 °C przez 20 sec, 55 °C przez 20 sec, 72 °C przez 20 sec; krok 3: 72 °C przez 7 min) z wykorzystaniem specyficznych starterów dla DNA p53, naprzód (forward) 5'-ACCCTCTGACCTTTTTCCCA-3' i wstecz (reverse) 5'-TGCTGGGATCTTAGGCACTC-3' oraz polimerazy Taq DNA (dNTPack), zgodnie z protokołem producenta. Oczekiwany produkt PCR ma 243 pary zasad.
Przeprowadzić elektroforezę na 1,5 % żelu agarozowym w celu wykrycia specyficznego produktu PCR DNA o długości 243 par zasad. Aby przygotować 1,5 % żel agarozowy w buforze TBE, odważyć 3,75 g agarozy i rozpuścić ją w 250 ml buforu TBE. Dodać 500 μl bromku etydium (0,5 mg/ml) do 500 ml roztworu 1,5 % żelu agarozowego. Podgrzać mieszaninę w kuchence mikrofalowej i mieszać do całkowitego rozpuszczenia agarozy.

Żadna z próbek nie może wykazywać specyficznych dla DNA produktów PCR w elektroforezie nażelowej na 1,5 % żelu agarozowym.

Zmierz stężenie próbek RNA (1 μl) oraz stosunek absorbancji próbki przy 260 nm (RNA) i 280 nm (białko) w spektrofotometrze NanoDrop ND-1000. Jeśli stosunek absorbancji RNA do białka wynosi 2,0 lub więcej, próbka RNA jest czysta. Jeśli stosunek absorbancji próbki RNA jest niższy niż 2,0, powtórz krok 3.5 oczyszczania RNA.
Odmij dokładnie objętość próbki RNA odpowiadającą 1 μg i przeprowadź syntezę cDNA zgodnie z protokołem zestawu 1^st Strand cDNA synthesis Kit (1^st Strand cDNA synthesis Kit for RT-PCR).
Próbki cDNA przechowuj w temperaturze -20 °C (w przypadku przechowywania przez rok lub dłużej, przechowuj w temperaturze -70 °C).
Przeprowadź ilościową reakcję PCR w czasie rzeczywistym w systemie detekcji iCycler MyiQ Single Color Real Time PCR. Na płytkę 96-dołkową nanieś po trzech powtórzeniach 1 μl próbki cDNA, TaqMan Gene Expression Master Mix oraz TaqMan Gene Expression Assay dla kaspazy 3, zgodnie z instrukcjami producenta. Na kolejną płytkę 96-dołkową nanieś po trzech powtórzeniach 1 μl próbki cDNA, TaqMan Gene Expression Master Mix oraz TaqMan Gene Expression Assay dla 18s, zgodnie z instrukcjami producenta (TaqMan Gene Expression Assay Protocol). Wykonaj szereg rozcieńczeń cDNA z trzech losowo wybranych soczewek niepoddanych ekspozycji. Rozcieńczenia seryjne przeprowadź razem z cDNA z próbek na jednej płytce 96-dołkowej.
Do ilościowego oznaczenia wyników zastosuj metodę krzywej standardowej. Jako pomiar w oprogramowaniu MyiQ przyjmuje się liczbę cykli w punkcie progowym fluorescencji. Dla rozcieńczeń seryjnych na każdej płytce wyznaczono krzywą standardową opisującą liczbę cykli w punkcie progowym jako funkcję względnego stężenia kalibratora. Do kalibracji wykorzystano cDNA z trzech próbek soczewek niepoddanych działaniu czynnika. Odnieś liczbę cykli progowych dla każdej próbki do krzywej standardowej, aby uzyskać względne stężenie zmierzonego cDNA z próbki. Na koniec oblicz poziom ekspresji genów docelowych, odnosząc względne stężenie cDNA genu docelowego do cDNA wewnętrznej kontroli 18s.

4. Barwienie immunohistochemiczne

Fiksacja
1. Przeprowadzić dysekcję oka w PBS (buforze fosforanowym; pH 7,4).
2. Umieścić oko w probówce wypełnionej 4 % paraformaldehydem (PFA) w temperaturze lodowej na 20 min. PFA 4 % przygotować dzień wcześniej. Przechowywać w temperaturze +4 °C do momentu użycia. PFA zachowuje świeżość przez około jeden tydzień.
3. Usunąć PFA za pomocą mikropipety. Następnie przemyć lodowatym PBS przez 20 min.
4. Umieścić oko w 30 % sacharozie w temperaturze +4 °C przez noc.
5. Umieścić oko w naczyniu wypełnionym medium OCT (Optimal Cutting Temperature) (Tissue-Tek). Ułożyć oko w pozycji odpowiedniej do sekcjonowania.
6. Zamrozić w medium OCT nad suchym lodem.
7. Przechowywać w temperaturze -70 °C do momentu użycia.
Sekcjonowanie
1. Ułożyć oko do kriosekcjonowania w odpowiedniej płaszczyźnie.
2. Wyciąć trzy przekroje strzałkowe o grubości 5 μm z części centralnej każdej soczewki. Odrzucić co najmniej 6 sekcji pomiędzy kolejnymi przekrojami, aby uniknąć barwienia tych samych jąder w różnych sekcjach.
3. Po wycięciu sekcji delikatnie położyć na niej szkiełko. Sekcja powinna wówczas przykleić się do szkiełka.
4. Pozostawić szkiełka do wyschnięcia na powietrzu przed użyciem. Szkiełka można przechowywać w temperaturze -20 °C do momentu zapotrzebowania.
Immunohistochemia fluorescencyjna
1. Pozostawić próbki do osiągnięcia temperatury pokojowej (5-10 min).
2. Obrysować krawędzie wokół preparatów za pomocą PAP-pen (Invitrogen).
3. Pozostawić obramowanie do wyschnięcia (10 min).
4. Opisać szkiełka mikroskopowe.
5. Rehydratować w 1 × PBS przez 15 min.
6. Przeprowadzić permeabilizację w standardowym roztworze blokującym przez 30 min.
7. Dodać przeciwciało pierwszorzędowe (królicze poliklonalne przeciwciało przeciwko cleaved caspase-3 Asp175 9661; Cell Signalling Technology, Inc) rozcieńczone 1:3 000 w standardowym roztworze blokującym.
8. Przechowywać w komorze nawilżonej w temperaturze +4 °C przez noc.
9. Przemyć w PBS za pomocą pipety (3 × 5 min) lub poprzez zanurzenie w dużej kąpieli (>15 min, 1-2 wymiany).
10. Dodać przeciwciało drugorzędowe (przeciwkrólicze przeciwciało drugorzędowe o specyficznym widmie absorpcji/emisji) rozcieńczone 1:300 w standardowym roztworze blokującym.
11. Przemyć w PBS za pomocą pipety (3 × 5 min) lub poprzez zanurzenie w dużej kąpieli (>15 min, 1-2 wymiany).
12. Zetrzeć ślady PAP-pen.
13. Przechowywać w komorze nawilżonej w temperaturze pokojowej przez 3 h. Unikać ekspozycji na światło.
14. Dodać kroplę Vectashield i nałożyć szkiełko cover-slip na preparat. Unikać powstawania pęcherzyków powietrza.
15. Pozostawić Vectashield do stwardnienia (~20 min).
16. Przechowywać sekcje w ciemności do momentu analizy.
17. Wszystkie sekcje kontrolne są przetwarzane bez zastosowania przeciwciała pierwszorzędowego.
18. Analizować wyniki po kilku godzinach pod mikroskopem fluorescencyjnym.
19. Policzyć jądra komórek nabłonkowych od jednego łuku jądrowego do drugiego łuku jądrowego każdej soczewki. Zastosować standardowy filtr niebieski, aby uwidocznić wszystkie jądra nabłonka soczewki na niebiesko, oraz standardowy filtr dopasowany do emisji przeciwciała drugorzędowego, aby uwidocznić jądra dodatnie dla caspase-3 na zielono.
20. Zarejestrować liczbę wszystkich jąder nabłonkowych soczewki oraz liczbę jąder dodatnich. Przeliczyć komórki trzykrotnie dla każdej sekcji.