Artykuł metodologiczny

In ovo elektroporacja śródmózgowia kurczaka w celu badania funkcji genów w rozwoju neuronów dopaminergicznych

DOI:

10.3791/4017

⸱

3 sierpnia 2012

 ,  , 
1Northwestern University Feinberg School of Medicine, Children's Hospital of Chicago Research Center, 2Departments of Pediatrics, Neurology and Physiology, Northwestern University Feinberg School of Medicine

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W celu oceny funkcji i regulacji genów podczas rozwoju dopaminergicznych neuronów śródmózgowia opisujemy metodę obejmującą elektroporację in ovo konstruktów plazmidowego DNA do embrionalnych progenitorów dopaminergicznych neuronów brzusznej części śródmózgowia kurczaka. Technika ta może być wykorzystana do uzyskania wydajnej ekspresji genów zainteresowania w celu zbadania różnych aspektów rozwoju śródmózgowia i różnicowania neuronów dopaminergicznych.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Neurony dopaminergiczne zlokalizowane w brzusznej części śródmózgowia kontrolują ruch, zachowania emocjonalne oraz mechanizmy nagrody1-3. Dysfunkcja neuronów dopaminergicznych brzusznej części śródmózgowia jest związana z chorobą Parkinsona, schizofrenią, depresją oraz otępieniem1-5. Zatem badanie regulacji różnicowania neuronów dopaminergicznych śródmózgowia może nie tylko dostarczyć istotnych informacji na temat mechanizmów regulujących rozwój śródmózgowia i specyfikację losów progenitorów neuronalnych, ale także pomóc w opracowaniu nowych strategii terapeutycznych w leczeniu wielu ludzkich zaburzeń neurologicznych.

Neurony dopaminergiczne różnicują się z progenitorów neuronalnych wyścielających strefę komorową embrionalnego brzusznego śródmózwia. Rozwój progenitorów neuronalnych jest kontrolowany przez programy ekspresji genów6,7. Przedstawiamy tutaj techniki wykorzystujące elektroporację do ekspresji genów specyficznie w śródmózwiu embrionów kurzych w stadium Hamburgera-Hamiltona (HH) 11 (trzynaście somytów, 42 godziny)8,9. Zewnętrzny rozwój embrionów kurzych umożliwia wygodne manipulacje eksperymentalne na określonych etapach embrionalnych, z oceną efektów w późniejszych punktach czasowych rozwoju10-13. Czwartkowe cewki neuronalne embrionów kurzych przed stadium HH 13 (dziewiętnaście somytów, 48 godzin) składają się z multipotencjalnych progenitorów neuronalnych, które są zdolne do różnicowania się w odrębne typy komórek układu nerwowego. Wektor pCAG, zawierający zarówno promotor CMV, jak i enhancer β-aktyny kurzej, umożliwia silną ekspresję konstruktów z tagiem Flag lub innymi tagami epitopowymi w embrionalnych cewkach neuronalnych kurcząt14. W niniejszym raporcie kładziemy nacisk na specjalne środki mające na celu uzyskanie regionalnie ograniczonej ekspresji genów w embrionalnych progenitorach neuronów dopaminergicznych śródmózwia, w tym na sposób wstrzykiwania konstruktów DNA specyficznie do obszaru embrionalnego śródmózwia oraz na precyzyjne przeprowadzanie elektroporacji za pomocą małych, wykonanych na zamówienie elektrod. Analiza śródmózwia kurzych w późniejszych stadiach stanowi doskonały system in vivo do badań typu gain-of-function i loss-of-function w rozwoju śródmózwia za pomocą wektorów plazmidowych. Modyfikacja systemu eksperymentalnego może rozszerzyć zastosowanie tej metody na inne części układu nerwowego w celu przeprowadzenia analizy mapowania losów komórek oraz badania regulacji ekspresji genów.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Przygotowanie materiałów (brak w materiale wideo)

  1. Przygotować świeże rozcieńczenie 1X penicyliny/streptomycyny (Pen/Strep) w 1X PBS. Wystarczy objętość nieprzekraczająca 50 mL. Przefiltrować roztwór za pomocą filtra strzykawkowego o rozmiarze oczek 0,22 μm.
  2. Przygotować konstrukty do iniekcji, łącząc odpowiednie konstrukty plazmidowe. Wszystkie konstrukty wprowadzono do wektora pCAG-Flag z zachowaniem odpowiedniej stechiometrii do końcowej objętości ~10 μL. W celu monitorowania wydajności elektroporacji oraz komórek poddanych elektroporacji należy dodać pCAG-GFP14 lub pCAG-mCherry. W tym eksperymencie zastosowano pCAG-mCherry. Na koniec do mieszaniny plazmidowego DNA dodać przefiltrowany przez filtr 0,22 μm barwnik Fast Green do końcowego stężenia 0,05%, aby umożliwić wizualizację wydajności iniekcji do śródmózgowia embrionów kurczaka.

2. Przygotowanie jaj (w materiale wideo)

  1. Aby uzyskać zarodki w stadium HH 11, jaja należy inkubować w temperaturze 100 °F (37.8 °C) przez około 41 godzin po zapłodnieniu, przy wilgotności 25-40%. Jaja należy ułożyć na boku i zaznaczyć górną część każdego z nich kreską ołówka. Tace należy umieścić w uprzednio ogrzanym, nawilżonym inkubatorze. Jaja należy powoli obracać, ustawiając funkcję obrotu platform inkubatora na „Automatic”. Wilgotność i poziom wody należy sprawdzać co 24 godziny.
  2. Tuż przed rozpoczęciem eksperymentu należy wyjąć jaja z inkubatora i pozostawić je w temperaturze pokojowej. Pomoże to spowolnić rozwój i zapobiegnie jego nadmiernemu zaawansowaniu.
  3. Powierzchnię każdego jaja należy oczyścić 70% etanolem i wytrzeć chusteczką Kimwipe.
  4. Należy wziąć dwa 4 cm kawałki taśmy klejącej i przykleić je obok siebie na jajku, tworząc duży prostokąt nad zaznaczeniem ołówkowym. Taśmę należy dokładnie wygładzić na powierzchni jaja. W tym miejscu zostanie wykonane okienko. Taśma zapobiegnie odpadaniu małych fragmentów skorupki podczas wycinania otworu.
  5. Za pomocą strzykawki 10 mL i igły o rozmiarze 18½ G należy odessać z jaja 5 mL albuminy. Po przebiciu skorupki igłę należy skierować pod kątem w stronę przeciwną do żółtka, aby nie zakłócić ani nie uszkodzić zarodka podczas usuwania albuminy. Igłę należy przemywać 70% etanolem pomiędzy kolejnymi jajami, dbając o to, aby była ona sucha przed przebiciem następnego jaja.

3. Przygotowanie szklanej igły do iniekcji (w materiale wideo)

  1. Igły do mikroiniekcji przygotowuje się przy użyciu następujących ustawień w wyciągaczu kapilar Flaming/Brown Micropipette Puller (Sutter Instrument Model P-97): Heat 670, Pull 120, Vel 40, Time 165. Do wykonania igieł wykorzystuje się cienkościenne kapilary szklane 4 calowe 1,0 mm firmy World Precision Instruments (API) (API TW100F-4).
  2. Napełnia się wyciągniętą szklaną igłę za pomocą pipety P10 i specjalnej końcówki do napełniania kapilar z długim czubkiem (Eppendorf 5242956.003). Należy pobrać 5-10 μL roztworu, w zależności od liczby jaj do iniekcji. Szklaną igłę napełnia się powoli, tworząc ciągłą kolumnę roztworu plazmidu bez pęcherzyków powietrza.
  3. Napełnioną igłę umieszcza się w uchwycie przymocowanym do mikromanipulatora (Narishige MM3) i mikroinjektora Picospritzer III. Igłę ogląda się pod mikroskopem stereoskopowym i przycina w miejscu, w którym kończy się zielony płyn. Aby lepiej zwizualizować igłę, zaleca się stosowanie ciemnego tła. Odpowiednie przycinanie igieł wymaga wprawy.

4. Iniekcja do śródmózgowia/cewki neuronalnej (w filmie)

  1. Za pomocą nożyczek sprężynowych wytnij w jajku okienko o średnicy 2-2,5 cm. Zacznij wycinanie od otworu po igle, który powstał podczas pobierania albuminy, i obracaj jajko w dłoni podczas cięcia. Pamiętaj, aby pomiędzy kolejnymi jajkami oczyszczać nożyczki za pomocą chusteczki Kimwipe nasączonej 70% etanolem.
  2. Obejrzyj zarodki kurcząt pod mikroskopem sekcyjnym. Może być konieczne przyzwyczajenie wzroku. Wizualizację zarodka można ułatwić, wstrzykując pod niego 20% tusz indyjski w PBS, przefiltrowany przez membranę 0,22 μm. Stwierdziliśmy jednak, że należy unikać tego kroku, jeśli to możliwe, ponieważ ma on tendencję do obniżania przeżywalności.
  3. Iniekcja przebiega najlepiej, gdy zarodek jest ustawiony równolegle do toru wprowadzenia igły, z głową skierowaną w stronę przeciwną do igły. Powoli przebij rurkę neuronalną pod kątem 45 stopni w obrębie połączenia śródmózgowia z rombemencfalonem. Bardzo ważne jest, aby wypełnić plazmidowym DNA i barwnikiem Fast Green jedynie pęcherzyk neuronalny odpowiadający śródmózgowiu, bez znaczącej dyfuzji do obszarów przodomózgowia i rombomózgowia. Rozpocznij wstrzykiwanie, ustawiając czas trwania impulsu w mikroiniekcji Picospritzer na 25 ms; wartość ta może wymagać zmiany w zależności od przycięcia igły. Zazwyczaj stosuje się przedział od 10-50 ms.

5. Elektroporacja (w materiale wideo)

  1. Pobrać igłę do iniekcji. Nanieść 3 krople 1X roztworu Pen/Strep w PBS do jaja, bezpośrednio na embrion.
  2. Sprawdzić ustawienia elektroporatora BTX EMC830:
    NAPIĘCIE:20 V
    DŁUGOŚĆ IMPULSU:25 ms
    LICZBA IMPULSÓW:3
    ODSTĘP:500 ms
    POLARYZACJA:UNI POLARNA
  3. Umieścić L-kształtne elektrody platynowe o długości 2 mm na tym samym poziomie poziomym co dno rurki neuralnej, tak aby śródmózgowie embrionu znajdowało się w połowie odległości między dwiema elektrodami oddalonymi od siebie o 3 mm. Wyrównanie elektrod z dnem rurki neuralnej jest kluczowe dla efektywnej elektroporacji brzusznej części śródmózgowia. Aby uzyskać elektroporację specyficzną dla śródmózgowia, oryginalne elektrody BTX zastąpiono dwiema wykonanymi na zamówienie L-kształtnymi elektrodami platynowymi z krótkimi końcówkami o długości 2 mm. Elektrody platynowe te wykonano z drutów platynowych o średnicy 0.5mm (Alfa Aesar). Elektrody te są wystarczająco długie, aby objąć śródmózgowie embrionu kury w stadium 11, którego długość wynosi około 0.9 mm, bez obejmowania znacznej części przedmózgowia lub rombencephalonu. Nacisnąć raz przełącznik nożny BTX. Przy każdej udanej elektroporacji wokół elektrod powinny pojawić się pęcherzyki powietrza. Ostrożnie wyjąć elektrody z jaja i przetrzeć je chusteczką Kimwipe nasączoną 70% etanolem. Nanieść kolejne 3 krople roztworu 1X Pen/Strep do jaja, na embrion.
  4. Zakryć okno kawałkiem przezroczystej taśmy pakowej o wymiarach 5 cm x 5 cm. Należy upewnić się, że jajo jest szczelnie zamknięte i że jego zawartość nie ma kontaktu z taśmą.

6. Inkubacja i zbiór

  1. Umieść jaja z powrotem w inkubatorze. Upewnij się, że funkcja obracania platform inkubatora jest WYŁĄCZONA. Inkubuj jaja do momentu osiągnięcia pożądanego stadium HH 23.
  2. Zbierz żywe embriony i umieść je w osobnych szalkach Petri wypełnionych PBS dla każdego wariantu badawczego. Przesiej zebrane embriony pod fluorescencyjnym mikroskopem sekcyjnym, pozostawiając jedynie embriony z ekspresją mCherry.
  3. Przenieś embriony do poszczególnych dołków płytki 24-dołkowej. Wypełnij każdy dołek 1 mL świeżo przygotowanego 2% paraformaldehydu (PFA) i pozostaw do utrwalenia na 2-3 godziny w temperaturze 4 °C.
  4. Przemyj utrwalone embriony trzykrotnie przez 10 minut każdy w PBS. Umieść embriony sekwencyjnie w 15% i 30% sacharozie aż do osiągnięcia równowagi. Początkowo embriony będą pływać w sacharozie, ale po osiągnięciu równowagi opadną na dno.
  5. Obejrzyj embriony pod fluorescencyjnym mikroskopem sekcyjnym, odnotowując wzór i poziom ekspresji mCherry dla każdego embrionu. Osadź każdy embrion w OCT. Kluczowe jest prawidłowe zorientowanie embrionów w celu uzyskania optymalnych przekrojów poprzecznych śródmózgowia do późniejszych analiz (Rycina 1).
  6. Przygotuj przekroje śródmózgowia o grubości 18 μm przy użyciu kriotomu Leica CM3050S. Przeanalizuj rozwój śródmózgowia i różnicowanie neuronów dopaminergicznych za pomocą immunobarwienia z zastosowaniem odpowiednich markerów typów komórkowych.

7. Reprezentatywne wyniki

Schematyczne przedstawienie procesu elektroporacji i analizy śródmózwia embrionalnego kurczaka pokazano na Rysunku 1. W przypadku pomyślnie wstrzykniętych i poddanych elektroporacji embrionów kur de mCherry ekspresja powinna być widoczna w obszarze śródmózwia po dalszym rozwoju (Rysunek 2A, B, C). Przy założeniu, że mCherry koreluje z ekspresją innych współelektroporowanych genów, embriony wykazujące prawidłową ekspresję mCherry można następnie utrwalić i zablokować w celu przygotowania krioprzekrojów śródmózwia do dalszych badań (Rysunek 2D). Zazwyczaj około 50% brzusznych progenitorów neuronalnych śródmózwia można efektywnie przetransfekować za pomocą powyższego protokołu. Specyfikację losu dopaminergicznego w elektroporowanych progenitorach neuronalnych można zbadać poprzez ko-lokalizację mCherry, genu z znacznikiem Flag, z markerami neuronów dopaminergicznych, takimi jak tyrozynowa hydroksylaza (TH) (Rysunek 3). Wzorowanie domen progenitorowych w brzusznej części śródmózwia można badać poprzez wspólne barwienie immunocytochemiczne krioprzekrojów z zastosowaniem różnych markerów domen progenitorowych.

Niewystarczająca ekspresja mCherry sugeruje, że geny ektopowe prawdopodobnie nie są efektywnie eksprimowane. Zarodki w takim stanie nie powinny być wykorzystywane do dalszych badań. Podobnie zarodki, które nie przeżyły do końca procedury eksperymentalnej, nie mogą być użyte do gromadzenia i analizy danych.

Analiza zarodka: schemat elektroporacji, obraz markera mCherry, fluorescencja ekspresji TH.
Rysunek 1. Ilustracja testu elektroporacji in ovo śródmózgowia zarodka kurczaka. Do zarodków kurczaka w stadium HH 11 wstrzykuje się pCAG-mCherry wraz z genami zainteresowania zmieszanymi z fast green w celu wizualizacji procesu wstrzykiwania (A). Po wypełnieniu konstruktami DNA, śródmózgowia poddawane są elektroporacji za pomocą elektroporatora z falą prostokątną. Zarodki są następnie inkubowane aż do osiągnięcia pożądanego stadium HH 23. Następnie pobiera się zarodki mCherry-dodatnie, utrwala i zatapia (B). Przekroje mrożone śródmózgowia są przygotowywane zgodnie z płaszczyznami cięcia wskazanymi białą linią na Rysunku 1B, a następnie analizowane metodą immunohistochemiczną z użyciem markerów śródmózgowia, takich jak Tyrozyna Hydroksylaza (TH) (C). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększony rysunek.

Mikroskopia w świetle przechodzącym i fluorescencyjna mCherry zarodka; schemat przedstawia strukturę i nałożenie obrazów.
Rycina 2. Przygotowanie krioprzekrojów z mózgu średniego zarodka kurczaka. Po 41 godzinach inkubacji pobiera się zarodki kurczaka w stadium HH 23 wykazujące ekspresję mCherry oraz genów zainteresowania (A, B i C), utrwalane PFA, poddawane działaniu sacharozy i zatapiane w OCT w celu wykonania krioprzekrojów. Zarodki kurczaka są starannie orientowane, aby zapewnić przygotowanie przekrojów mózgu średniego. Przedstawiono typową morfologię zarodka oraz płaszczyznę cięcia służącą do uzyskania przekrojów mózgu średniego (D). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną rycinię.

Mikroskopia immunofluorescencyjna; znakowanie mCherry, Flag, TH, DAPI; wizualizacja komórkowa; nałożenie obrazów.
Rycina 3. Analiza elektroporowanych przekrojów śródmózgowia. Krioprzekroje z embrionów z wysokim poziomem ekspresji mCherry (A) są przygotowywane i barwione przeciwciałami rozpoznającymi badany gen z etykietą Flag (B) oraz marker dopaminergicznych neuronów śródmózgowia TH (C). Jako kontrolę służą embrionalne śródmózgowia elektroporowane pustym wektorem pCAG-mCherry i pCAG-Flag. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną rycinę.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Elektroporacja in ovo śródmózgowia embrionalnego kurczaka stanowi niskokosztową i szybką alternatywę dla tworzenia zwierząt transgenicznych lub knockout w celu przeprowadzenia badań in vivo funkcji genów w rozwoju dopaminergicznych neuronów śródmózgowia. Kluczem do uzyskania efektywnej ekspresji interesującego genu w progenitorach dopaminergicznych neuronów śródmózgowia jest zastosowanie krótkich, 2 mm długich, L-kształtnych elektrod platynowych wraz z wstrzyknięciem DNA specyficznego dla śródmózgowia e...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają żadnych potencjalnych konfliktów interesów do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dziękujemy dr. Takahiko Matsudzie za udostępnienie konstruktu pCAG-mCherry. YCM otrzymuje wsparcie w ramach Career Development Award z Fundacji Schweppe oraz grantu z Fundacji Whitehall.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Zapłodnione jaja kurzeCharles River Laboratories
Inkubator do jajGQF Manufacturing1502 Sportsman
Elektroporator BTXBTX Harvard ApparatusECM830
ElektrodyBTX Harvard Apparatus45-0162 L-shaped genetrodesDo użytku z elektroporatorem ECM830
Drut platynowo-irydowyAlfa Aesar#10056Średnica 0.5 mm
Do wykonania elektrod o długości 2 mm
Szklana kapilaraWorld Precision InstrumentTW100F-4
Końcówka pipety do mikroładownikaEppendorf5242 956.003
Tusz indyjskiStaplesPrzefiltrować 20% przed użyciem
MikrowstrzykiwaczParker Automation,
Parker Hannifin Cooperation		Picospritzer III
Fluorescencyjny mikroskop do sekcjiLeicaMZ16F
Wytwornica mikropipetSutter InstrumentD-97

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Wightman, R. M., Robinson, D. L. Transient changes in mesolimbic dopamine and their association with 'reward'. J. Neurochem. 82, 721-735 (2002).
  2. Kelley, A. E., Berridge, K. C. The neuroscience of natural rewards: relevance to addictive drugs. J. Neurosci. 22, 3306-3311 (2002).
  3. Moore, D. J., West, A. B., Dawson, V. L., Dawson, T. M. Molecular pathophysiology of Parkinson's disease. Annu. Rev. Neurosci. 28, 57-87 (2005).
  4. Dailly, E., Chenu, F., Renard, C. E., Bourin, M. Dopamine, depression and antidepressants. Fundam. Clin. Pharmacol. 18, 601-607 (2004).
  5. Sesack, S. R., Carr, D. B. Selective prefrontal cortex inputs to dopamine cells: implications for schizophrenia. Physiol. Behav. 77, 513-517 (2002).
  6. Ang, S. L. Transcriptional control of midbrain dopaminergic neuron development. Development. 133, 3499-3506 (2006).
  7. Andersson, E. Identification of intrinsic determinants of midbrain dopamine neurons. Cell. 124, 393-405 (2006).
  8. Hamburger, V., Hamilton, H. L. A Series of Normal Stages in the Development of the Chick Embryo. J. Morphol. 88, 49(1951).
  9. Bellairs, R., Osmond, M. The atlas of chick development. , 2nd edn, Elsevier. (2005).
  10. Itasaki, N., Bel-Vialar, S., Krumlauf, R. 'Shocking' developments in chick embryology: electroporation and in ovo gene expression. Nat. Cell Biol. 1, 203-207 (1999).
  11. Momose, T. Efficient targeting of gene expression in chick embryos by microelectroporation. Dev. Growth Differ. 41, 335-344 (1999).
  12. Muramatsu, T., Mizutani, Y., Ohmori, Y., Okumura, J. Comparison of three nonviral transfection methods for foreign gene expression in early chicken embryos in ovo. Biochem. Biophys. Res. Commun. 230, 376-380 (1997).
  13. Nishi, T. High-efficiency in vivo gene transfer using intraarterial plasmid DNA injection following in vivo electroporation. Cancer Res. 56, 1050-1055 (1996).
  14. Matsuda, T., Cepko, C. L. Electroporation and RNA interference in the rodent retina in vivo and in vitro. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101, 16-22 (2004).
  15. Blank, M. C., Chizhikov, V., Millen, K. J. In Ovo Electroporations of HH Stage 10 Chicken Embryos. J. Vis. Exp. (9), e408(2007).
  16. Chesnutt, C., Niswander, L. Plasmid-based short-hairpin RNA interference in the chicken embryo. Genesis. 39, 73-78 (2004).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

ekspresja gen wHamburger Hamiltonelektrody niestandardowehydroksylaza tyrozynowaekspresja mCherryrozw j r dm zgowiaprogenitorzy neuronalni

Powiązane artykuły