W celu oceny funkcji i regulacji genów podczas rozwoju dopaminergicznych neuronów śródmózgowia opisujemy metodę obejmującą elektroporację in ovo konstruktów plazmidowego DNA do embrionalnych progenitorów dopaminergicznych neuronów brzusznej części śródmózgowia kurczaka. Technika ta może być wykorzystana do uzyskania wydajnej ekspresji genów zainteresowania w celu zbadania różnych aspektów rozwoju śródmózgowia i różnicowania neuronów dopaminergicznych.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
In ovo elektroporacja śródmózgowia kurczaka w celu badania funkcji genów w rozwoju neuronów dopaminergicznych
* These authors contributed equally
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Neurony dopaminergiczne zlokalizowane w brzusznej części śródmózgowia kontrolują ruch, zachowania emocjonalne oraz mechanizmy nagrody1-3. Dysfunkcja neuronów dopaminergicznych brzusznej części śródmózgowia jest związana z chorobą Parkinsona, schizofrenią, depresją oraz otępieniem1-5. Zatem badanie regulacji różnicowania neuronów dopaminergicznych śródmózgowia może nie tylko dostarczyć istotnych informacji na temat mechanizmów regulujących rozwój śródmózgowia i specyfikację losów progenitorów neuronalnych, ale także pomóc w opracowaniu nowych strategii terapeutycznych w leczeniu wielu ludzkich zaburzeń neurologicznych.
Neurony dopaminergiczne różnicują się z progenitorów neuronalnych wyścielających strefę komorową embrionalnego brzusznego śródmózwia. Rozwój progenitorów neuronalnych jest kontrolowany przez programy ekspresji genów6,7. Przedstawiamy tutaj techniki wykorzystujące elektroporację do ekspresji genów specyficznie w śródmózwiu embrionów kurzych w stadium Hamburgera-Hamiltona (HH) 11 (trzynaście somytów, 42 godziny)8,9. Zewnętrzny rozwój embrionów kurzych umożliwia wygodne manipulacje eksperymentalne na określonych etapach embrionalnych, z oceną efektów w późniejszych punktach czasowych rozwoju10-13. Czwartkowe cewki neuronalne embrionów kurzych przed stadium HH 13 (dziewiętnaście somytów, 48 godzin) składają się z multipotencjalnych progenitorów neuronalnych, które są zdolne do różnicowania się w odrębne typy komórek układu nerwowego. Wektor pCAG, zawierający zarówno promotor CMV, jak i enhancer β-aktyny kurzej, umożliwia silną ekspresję konstruktów z tagiem Flag lub innymi tagami epitopowymi w embrionalnych cewkach neuronalnych kurcząt14. W niniejszym raporcie kładziemy nacisk na specjalne środki mające na celu uzyskanie regionalnie ograniczonej ekspresji genów w embrionalnych progenitorach neuronów dopaminergicznych śródmózwia, w tym na sposób wstrzykiwania konstruktów DNA specyficznie do obszaru embrionalnego śródmózwia oraz na precyzyjne przeprowadzanie elektroporacji za pomocą małych, wykonanych na zamówienie elektrod. Analiza śródmózwia kurzych w późniejszych stadiach stanowi doskonały system in vivo do badań typu gain-of-function i loss-of-function w rozwoju śródmózwia za pomocą wektorów plazmidowych. Modyfikacja systemu eksperymentalnego może rozszerzyć zastosowanie tej metody na inne części układu nerwowego w celu przeprowadzenia analizy mapowania losów komórek oraz badania regulacji ekspresji genów.
Protokół
1. Przygotowanie odczynników (brak w materiale wideo)
- Przygotować świeże rozcieńczenie 1X penicyliny/streptomycyny (Pen/Strep) w 1X PBS. Wystarczy objętość nieprzekraczająca 50 mL. Przefiltrować za pomocą filtra strzykawkowego 0,22 μm.
- Przygotować konstrukty do iniekcji, łącząc odpowiednie konstrukty plazmidowe. Wszystkie konstrukty umieściliśmy w wektorze pCAG-Flag z zachowaniem odpowiedniej stechiometrii do końcowej objętości ~10 μL. Należy również dodać pCAG-GFP14 lub pCAG-mCherry w celu monitorowania wydajności elektroporacji oraz identyfikacji elektroporowanych komórek. W tym doświadczeniu zastosowano pCAG-mCherry. Na koniec do mieszaniny plazmidowego DNA dodać przefiltrowany przez filtr 0,22 μm barwnik Fast Green do końcowego stężenia 0,05%, aby zwizualizować wydajność iniekcji do śródmózgowia embrionów kurczaka.
2. Przygotowanie jaj (w materiale wideo)
- Aby uzyskać embriony w stadium 11 HH, jaja należy inkubować w temperaturze 100 °F (37.8 °C) przez około 41 godzin po zapłodnieniu, przy wilgotności 25-40%. Jaja należy ułożyć na boku i zaznaczyć górną część każdego z nich kreską ołówka. Tace należy umieścić w uprzednio ogrzanym, nawilżonym inkubatorze. Jaja należy powoli obracać, ustawiając funkcję obracania platform inkubatora na „Automatic”. Wilgotność i poziom wody należy sprawdzać co 24 godziny.
- Tuż przed rozpoczęciem eksperymentu należy wyjąć jaja z inkubatora i pozostawić je w temperaturze pokojowej. Pomoże to spowolnić rozwój i zapobiegnie jego nadmiernemu postępowi.
- Powierzchnię każdego jaja należy oczyścić 70% etanolem i wytrzeć chusteczką Kimwipe.
- Należy wziąć dwa 4 cm odcinki taśmy klejącej i przykleić je obok siebie na jajku, tworząc duży prostokąt nad zaznaczeniem ołówkowym. Taśmę należy dokładnie wygładzić na powierzchni jaja. W tym miejscu zostanie wykonane okno. Taśma zapobiegnie odpadaniu małych fragmentów skorupki podczas wycinania okna.
- Za pomocą strzykawki 10 mL i igły o rozmiarze 18½ gauge należy odessać z jaja 5 mL albuminy. Po przebiciu skorupki należy skierować igłę z dala od żółtka, aby nie zakłócić rozwoju ani nie uszkodzić embrionu podczas usuwania albuminy. Igłę należy oczyszczać 70% etanolem pomiędzy kolejnymi jajami, upewniając się, że jest ona sucha przed przebiciem następnej skorupki.
3. Przygotowanie szklanej igły do iniekcji (w wideo)
- Igły do iniekcji wykonuje się, stosując następujące ustawienia w wyciągaczu do mikropipet Flaming/Brown (Sutter Instrument Model P-97): Heat 670, Pull 120, Vel 40, Time 165. Do produkcji igieł wykorzystuje się 4-calowe kapilary szklane o cienkiej ściance 1,0 mm firmy World Precision Instruments (API) (API TW100F-4).
- Należy napełnić wyciągniętą szklaną igłę za pomocą pipety P10 i końcówki do napełniania kapilar z długą końcówką (Eppendorf 5242956.003). Należy pobrać od 5-10 μL, w zależności od liczby jaj do iniekcji. Szklaną igłę napełnia się powoli, tworząc ciągłą kolumnę roztworu plazmidu bez pęcherzyków powietrza.
- Napełnioną igłę umieszcza się w uchwycie do igieł przymocowanym do mikromanipulatora (Narishige MM3) i mikroinjektora Picospritzer III. Igłę ogląda się pod mikroskopem sekcyjnym i przycina w punkcie, w którym kończy się zielony płyn. Pomocne jest zastosowanie ciemnego tła w celu lepszej wizualizacji igły. Odpowiednie przycinanie igieł wymaga wprawy.
4. Iniekcja do śródmózgowia/rurki neuralnej (w wideo)
- Za pomocą nożyczek sprężynowych wytnij w jajku okienko o średnicy 2-2,5 cm. Zacznij wycinać okienko od otworu po igle wykonanego podczas pobierania albuminy, obracając jajko w dłoni podczas cięcia. Pamiętaj, aby między kolejnymi jajkami przecierać nożyczki chusteczką Kimwipe nasączoną 70% etanolem.
- Obejrzyj zarodki kurczaka pod mikroskopem sekcyjnym. Może być konieczne przyzwyczajenie wzroku do obrazu. Wizualizację zarodka można ułatwić poprzez wstrzyknięcie pod niego 20% tuszu indyjskiego w PBS, przefiltrowanego przez membranę 0,22 μm. Stwierdziliśmy jednak, że należy unikać tego kroku, jeśli to możliwe, ponieważ ma on tendencję do zmniejszania przeżywalności.
- Iniekcja przebiega najskuteczniej, gdy zarodek jest ustawiony równolegle do toru wprowadzenia igły, z głową skierowaną w stronę przeciwną do igły. Powoli przebij rurkę neuralną pod kątem 45 stopni w miejscu połączenia śródmózgowia z rombencephalonem. Bardzo ważne jest, aby wypełnić plazmidowym DNA i barwnikiem Fast Green wyłącznie pęcherzyk neuralny reprezentujący śródmózgowie, unikając znacznej dyfuzji do obszarów przedmózgowia i rombencephalonu. Rozpocznij iniekcję, ustawiając czas trwania impulsu w mikroinżektorze Picospritzer na 25 ms; wartość ta może wymagać zmiany w zależności od przycięcia igły. Generalnie stosuj zakres od 10-50 ms.
5. Elektroporacja (w materiale wideo)
- Pobrać igłę do iniekcji. Nanieść 3 krople 1X roztworu Pen/Strep w PBS do jaja, bezpośrednio na embrion.
- Sprawdzić ustawienia elektroporatora BTX EMC830:
NAPIĘCIE: 20 V CZAS TRWANIA IMPULSU: 25 ms LICZBA IMPULSÓW: 3 ODSTĘP: 500 ms POLARYZACJA: UNI POLARNA - Umieścić L-kształtne elektrody platynowe o długości 2 mm na tym samym poziomie poziomym co dno rurki neuralnej, tak aby śródmózgowie embrionalne znajdowało się w połowie odległości między dwiema elektrodami rozstawionymi w odstępie 3 mm. Wyrównanie elektrod z dnem rurki neuralnej jest kluczowe dla efektywnej elektroporacji brzusznej części śródmózgowia. Aby uzyskać elektroporację specyficzną dla śródmózgowia, zastąpiono oryginalne elektrody BTX dwiema wykonanymi na zamówienie L-kształtnymi elektrodami platynowymi z krótkimi końcówkami o długości 2 mm. Elektrody platynowe te zostały wykonane z drutów platynowych o średnicy 0,5 mm (Alfa Aesar). Elektrody platynowe mają długość wystarczającą do pokrycia śródmózgowia zarodka kury w stadium 11, które ma około 0,9 mm długości, bez obejmowania znacznej części obszarów przedmózgowia lub ródmózgowia. Nacisnąć raz przełącznik nożny BTX. Przy każdej udanej elektroporacji wokół elektrod powinny powstać pęcherzyki powietrza. Ostrożnie usunąć elektrody z jaja i przetrzeć je chusteczką Kimwipe nasączoną 70% etanolem. Nanieść kolejne 3 krople roztworu 1X Pen/Strep do jaja, na embrion.
- Zakryć okno kawałkiem przezroczystej taśmy pakowej o wymiarach 5 cm x 5 cm. Należy upewnić się, że jajo jest szczelnie zamknięte i że zawartość jaja nie ma kontaktu z taśmą.
6. Inkubacja i zbiór
- Umieścić jaja z powrotem w inkubatorze. Upewnić się, że funkcja obracania platform inkubatora jest WYŁĄCZONA. Inkubować jaja do momentu osiągnięcia pożądanego stadium HH 23.
- Zebrać żywe embriony i umieścić je w osobnych szalkach Petri wypełnionych PBS dla każdego z warunków. Przesiać zebrane embriony pod fluorescencyjnym mikroskopem sekcyjnym, pozostawiając jedynie embriony z ekspresją mCherry.
- Przenieść embriony do pojedynczych dołków płytki 24-dołkowej. Napełnić każdy dołek 1 mL świeżo przygotowanego 2% paraformaldehydu (PFA) i pozostawić do utrwalenia na 2-3 godziny w temperaturze 4 °C.
- Przemyć utrwalone embriony trzy razy po 10 minut w PBS. Umieścić embriony sekwencyjnie w 15% i 30% sacharozie aż do momentu równowagi osmotycznej. Embriony początkowo będą unosić się w sacharozie, a po osiągnięciu równowagi opadną na dno.
- Sprawdzić embriony pod fluorescencyjnym mikroskopem sekcyjnym, notując wzór i poziom ekspresji mCherry dla każdego embrionu. Osadzić każdy embrion w OCT. Bardzo ważne jest właściwe zorientowanie embrionów w celu uzyskania optymalnych przekrojów poprzecznych śródmózgowia do późniejszych analiz (Rycina 1).
- Przygotować przekroje śródmózgowia o grubości 18 μm przy użyciu kriosztatu Leica CM3050S. Przeanalizować rozwój śródmózgowia i różnicowanie neuronów dopaminergicznych za pomocą immunobarwienia z odpowiednimi markerami typów komórek.
7. Reprezentatywne wyniki
Schematyczne przedstawienie elektroporacji i analizy śródmózgowia embrionu kurczaka pokazano na Rysunku 1. W pomyślnie wstrzykniętych i elektroporowanych embrionach kurczaka ekspresja mCherry powinna być widoczna w obszarze śródmózgowia po dalszym rozwoju (Rysunek 2A, B, C). Zakładając, że mCherry koreluje z ekspresją innych współelektroporowanych genów, embriony wykazujące prawidłową ekspresję mCherry można następnie utrwalić i zablokować w celu przygotowania kriosiekcji śródmózgowia do dalszych badań (Rysunek 2D). Zazwyczaj około 50% progenitorów neuronalnych brzusznej części śródmózgowia można skutecznie przetransfekować za pomocą powyższego protokołu. Specyfikację losu dopaminergicznego w elektroporowanych progenitorach neuronalnych można zbadać poprzez kolokalizację mCherry, genu z tagiem Flag, z markerami neuronów dopaminergicznych, takimi jak hydroksylaza tyrozynowa (TH) (Rysunek 3). Wzorzec domeny progenitorowych w brzusznej części śródmózgowia można badać poprzez podwójne barwienie immunocytochemiczne kriosiekcji z użyciem różnych markerów domen progenitorowych.
Niewystarczająca ekspresja mCherry sugeruje, że geny ektopowe prawdopodobnie nie są ekspresowane w sposób wydajny. Zarodków spełniających ten warunek nie należy wykorzystywać do dalszych badań. Podobnie, zarodki, które nie przeżyły do końca procedury eksperymentalnej, nie mogą zostać użyte do gromadzenia i analizy danych.
Rycina 1. Ilustracja testu elektroporacji in ovo śródmózgowia embrionu kurczaka. Do embrionów kurczaka w stadium HH 11 wstrzykuje się pCAG-mCherry wraz z genami zainteresowania zmieszanymi z barwnikiem fast green w celu wizualizacji procesu iniekcji (A). Po wypełnieniu konstruktami DNA, śródmózgowia poddaje się elektroporacji za pomocą elektroporatora z falą prostokątną. Embriony są następnie inkubowane aż do osiągnięcia pożądanego stadium HH 23. Następnie embriony wykazujące ekspresję mCherry są pobierane, utrwalane i zatapiane (B). Przygotowuje się krioprzekroje śródmózgowia w płaszczyznach cięcia wskazanych białą linią na Rycynie 1B, a następnie analizuje je za pomocą immunobarwienia z markerami śródmózgowia, takimi jak Tyrozynowa Hydroksylaza (TH) (C). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną rycinę.
Rysunek 2. Przygotowanie krioprzekrojów z mózgu średniego zarodka kurczaka. Po 41 godzinach inkubacji zarodki kurczaka w stadium HH 23 wykazujące ekspresję mCherry oraz genów zainteresowania są pobierane (A, B i C), utrwalane w PFA, traktowane sacharozą i zatapiane w OCT w celu wykonania krioprzekrojów. Zarodki kurczaka są starannie orientowane, aby zapewnić przygotowanie przekrojów mózgu średniego. Przedstawiono typową morfologię zarodka oraz płaszczyznę cięcia niezbędną do uzyskania przekrojów mózgu średniego (D). Kliknij tutaj, aby wyświetlić większy rysunek.
Rysunek 3. Analiza elektroporowanych przekrojów śródmózgowia. Krioprzekroje z embrionów z wysokim poziomem ekspresji mCherry (A) są przygotowywane i barwione przeciwciałami rozpoznającymi gen docelowy z tagiem Flag (B) oraz marker dopaminergicznych neuronów śródmózgowia TH (C). Jako kontrolę służą embrionalne śródmózgowia elektroporowane pustym wektorem pCAG-mCherry i pCAG-Flag. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększony rysunek.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Elektroporacja in ovo śródmózgowia embrionalnego kurczaka stanowi niskokosztową i szybką alternatywę dla tworzenia zwierząt transgenicznych lub knockout w celu przeprowadzenia badań in vivo funkcji genów w rozwoju dopaminergicznych neuronów śródmózgowia. Kluczem do uzyskania efektywnej ekspresji interesującego genu w progenitorach dopaminergicznych neuronów śródmózgowia jest zastosowanie krótkich, 2 mm długich, L-kształtnych elektrod platynowych wraz z wstrzyknięciem DNA specyficznego dla śródmózgowia e...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy nie mają żadnych potencjalnych konfliktów interesów do ujawnienia.
Podziękowania
Dziękujemy dr. Takahiko Matsudzie za udostępnienie konstruktu pCAG-mCherry. YCM otrzymuje wsparcie w ramach Career Development Award z Fundacji Schweppe oraz grantu z Fundacji Whitehall.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Zapłodnione jaja kurze | Charles River Laboratories | ||
| Inkubator do jaj | GQF Manufacturing | 1502 Sportsman | |
| Elektroporator BTX | BTX Harvard Apparatus | ECM830 | |
| Elektrody | BTX Harvard Apparatus | 45-0162 L-shaped genetrodes | Do użytku z elektroporatorem ECM830 |
| Drut platynowo-irydowy | Alfa Aesar | #10056 | Średnica 0.5 mm Do wykonania elektrod o długości 2 mm |
| Szklana kapilara | World Precision Instrument | TW100F-4 | |
| Końcówka pipety do mikroładownika | Eppendorf | 5242 956.003 | |
| Tusz indyjski | Staples | Przefiltrować 20% przed użyciem | |
| Mikrowstrzykiwacz | Parker Automation, Parker Hannifin Cooperation | Picospritzer III | |
| Fluorescencyjny mikroskop do sekcji | Leica | MZ16F | |
| Wytwornica mikropipet | Sutter Instrument | D-97 |
Bibliografia
- Wightman, R. M., Robinson, D. L. Transient changes in mesolimbic dopamine and their association with 'reward'. J. Neurochem. 82, 721-735 (2002).
- Kelley, A. E., Berridge, K. C. The neuroscience of natural rewards: relevance to addictive drugs. J. Neurosci. 22, 3306-3311 (2002).
- Moore, D. J., West, A. B., Dawson, V. L., Dawson, T. M. Molecular pathophysiology of Parkinson's disease. Annu. Rev. Neurosci. 28, 57-87 (2005).
- Dailly, E., Chenu, F., Renard, C. E., Bourin, M. Dopamine, depression and antidepressants. Fundam. Clin. Pharmacol. 18, 601-607 (2004).
- Sesack, S. R., Carr, D. B. Selective prefrontal cortex inputs to dopamine cells: implications for schizophrenia. Physiol. Behav. 77, 513-517 (2002).
- Ang, S. L. Transcriptional control of midbrain dopaminergic neuron development. Development. 133, 3499-3506 (2006).
- Andersson, E. Identification of intrinsic determinants of midbrain dopamine neurons. Cell. 124, 393-405 (2006).
- Hamburger, V., Hamilton, H. L. A Series of Normal Stages in the Development of the Chick Embryo. J. Morphol. 88, 49(1951).
- Bellairs, R., Osmond, M. The atlas of chick development. , 2nd edn, Elsevier. (2005).
- Itasaki, N., Bel-Vialar, S., Krumlauf, R. 'Shocking' developments in chick embryology: electroporation and in ovo gene expression. Nat. Cell Biol. 1, 203-207 (1999).
- Momose, T. Efficient targeting of gene expression in chick embryos by microelectroporation. Dev. Growth Differ. 41, 335-344 (1999).
- Muramatsu, T., Mizutani, Y., Ohmori, Y., Okumura, J. Comparison of three nonviral transfection methods for foreign gene expression in early chicken embryos in ovo. Biochem. Biophys. Res. Commun. 230, 376-380 (1997).
- Nishi, T. High-efficiency in vivo gene transfer using intraarterial plasmid DNA injection following in vivo electroporation. Cancer Res. 56, 1050-1055 (1996).
- Matsuda, T., Cepko, C. L. Electroporation and RNA interference in the rodent retina in vivo and in vitro. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101, 16-22 (2004).
- Blank, M. C., Chizhikov, V., Millen, K. J. In Ovo Electroporations of HH Stage 10 Chicken Embryos. J. Vis. Exp. (9), e408(2007).
- Chesnutt, C., Niswander, L. Plasmid-based short-hairpin RNA interference in the chicken embryo. Genesis. 39, 73-78 (2004).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
