Schemat ilościowej analizy sprawności fizycznej

Podsumowanie

Ilościowa Analiza Przystosowania (QFA) to komplementarna seria metod eksperymentalnych i obliczeniowych służąca do szacowania przystosowania kultur mikrobiologicznych. QFA pozwala ocenić wpływ mutacji genetycznych, leków lub innych zastosowanych zabiegów na wzrost drobnoustrojów. Możliwe jest zaprojektowanie eksperymentów o skali od ukierunkowanej analizy pojedynczych kultur po tysiące kultur prowadzonych równolegle.

Streszczenie

Ilościowa Analiza Przystosowania (Quantitative Fitness Analysis, QFA) to eksperymentalny i obliczeniowy schemat postępowania służący do porównywania przystosowania kultur drobnoustrojów hodowanych równolegle^1,2,3,4. QFA może być stosowane do ukierunkowanych obserwacji pojedynczych kultur, jednak jest najbardziej użyteczne w przypadku genomowych badań oddziaływań genetycznych lub przesiewów lekowych obejmujących do tysięcy niezależnych kultur. Główną metodą eksperymentalną jest szczepienie niezależnych, rozcieńczonych płynnych kultur drobnoustrojów na stałe płytki agarowe, które są inkubowane i regularnie fotografowane. Analiza zdjęć z każdego punktu czasowego pozwala na uzyskanie ilościowych szacunków gęstości komórek, które służą do konstrukcji krzywych wzrostu, umożliwiając wyprowadzenie ilościowych miar przystosowania. Przystosowanie kultur można porównać w celu określenia i uszeregowania siły oddziaływań genetycznych lub wrażliwości na leki. QFA pozwala na ilościowe określenie wpływu na przystosowanie kultur wszelkich czynników dodanych do agaru podłoża (np. małych cząsteczek, antybiotyków lub składników odżywczych) lub zastosowanych zewnętrznie na płytki (np. promieniowanie UV, temperatura).

Procedura QFA pozwala na uzyskanie szacunków szybkości wzrostu analogicznych do tych otrzymywanych za pomocą pomiarów spektrofotometrycznych równoległych kultur w cieczy w czytnikach płytek 96- lub 200-dołkowych. Co istotne, QFA charakteryzuje się znacznie wyższą przepustowością w porównaniu z takimi metodami. Kultury w QFA rosną na stałej powierzchni agarowej i są zatem dobrze napowietrzane podczas wzrostu bez konieczności mieszania lub wstrząsania.

Przepustowość QFA nie jest tak wysoka, jak w przypadku niektórych metod przesiewowych Synthetic Genetic Array (SGA)^5,6. Jednakże, ponieważ kultury QFA są silnie rozcieńczane przed inokulacją na agar, QFA pozwala na rejestrację pełniejszych krzywych wzrostu, obejmujących fazy wykładniczą i nasycenia³. Na przykład obserwacje krzywych wzrostu pozwalają na bezpośrednie i precyzyjne szacowanie czasu podwojenia kultury, co było omawiane wcześniej¹.

W niniejszej pracy przedstawiamy specyficzny protokół QFA zastosowany do tysięcy kultur S. cerevisiae, które są automatycznie obsługiwane przez roboty podczas szczepienia, inkubacji i obrazowania. Każdy z tych zautomatyzowanych etapów może zostać zastąpiony równoważną procedurą ręczną, co wiąże się z obniżeniem przepustowości; przedstawiamy również ręczny protokół o niższej przepustowości. Te same narzędzia programistyczne QFA mogą być stosowane do obrazów zarejestrowanych w obu wariantach procesu.

Posiadamy szerokie doświadczenie w stosowaniu metody QFA do hodowli drożdży pączkujących S. cerevisiae, jednak spodziewamy się, że QFA okaże się równie użyteczna przy badaniu hodowli drożdży rozdzielających S. pombe oraz hodowli bakteryjnych.

Protokół

Protokół ręcznego QFA (dla szczepów S. cerevisiae)

1. Hodowla szczepów drożdży

1. Do 96 niezależnych szczepów drożdży hoduje się w 200 μl bogatego medium płynnego w 96-dołkowej płytce hodowlanej. Szczepy namnaża się do stanu nasycenia w inkubatorze z kontrolowaną temperaturą.
2. 96-igłowy manualny replikator o średnicy igieł 1/8" (SIGMA R-2508) sterylizuje się poprzez zanurzenie w 100% etanolu, opalenie nad płomieniem, a następnie pozostawienie do ostygnięcia.
3. W 96-dołkowej płytce hodowlanej rozmieszcza się po 200 μl sterylnej wody. Nasycone kultury poddaje się mieszaniu w wortexie (Eppendorf MixMate, 30 sec, 750 rpm) i rozcieńcza, zanurzając wysterylizowane narzędzie igłowe trzy razy w nasyconych szczepach, a następnie raz w płytce zawierającej wodę.
4. Narzędzie igłowe sterylizuje się ponownie zgodnie z punktem 1.2.
5. Wysterylizowane narzędzie igłowe służy do nanoszenia rozcieńczonej kultury na płytki z agarem stałym poprzez zanurzenie w płytce z rozcieńczoną kulturą trzy razy, a następnie przeniesienie narzędzia na prostokątną płytkę z agarem stałym.
6. Prostokątne płytki z agarem stałym inkubuje się w odpowiedniej temperaturze, a następnie obrazuje manualnie za pomocą urządzenia S&P Robotics spImager. Można zastosować alternatywne metody obrazowania, takie jak FujiFilm LAS4000 lub tańszy aparat cyfrowy lustrzanka, pod warunkiem zachowania równomiernego oświetlenia i spójnego ustawienia płytki względem aparatu.
7. Metodę można dostosować do mniejszej liczby kultur równoległych, np. 48, które można umieścić na okrągłych szalkach Petriego, dbając o zachowanie tego samego kąta względem aparatu podczas każdego zdjęcia.

W pełni zautomatyzowany protokół QFA (dla szczepów S. cerevisiae)

2. Hodowla szczepów drożdży

1. Rozpocznij od prostokątnej macierzy niezależnych szczepów drożdży rosnących na stałym agarze. W tym przykładzie szczepy wyjściowe są wynikiem skrzyżowania temperaturoczułej mutacji zapytania z Kolekcją Delecji Drożdży (YDC) metodą Synthetic Genetic Array (SGA). Końcowe płytki SGA są w formacie 1536. Jest to 16 wierszy i 24 kolumny kolonii/kultur reprezentujących cztery powtórzenia 384 niezależnych szczepów drożdży. Układy płytek przedstawiono na Rysunku 1.
2. 384 szczepy spośród 1536 są przenoszone robotycznie przy użyciu robota S&P Robotics Inc BM3-SC z 96-pinowym, sterylnym narzędziem pinowym o średnicy pinu 1 mm do czterech płytek hodowlanych z 96 dołkami zawierających 200 μl pożywki selektywnej (Rysunek 1). Czystość i sterylność narzędzia pinowego uzyskuje się poprzez sekwencyjne mycie w wodzie sterylnej dwukrotnie (raz za pomocą obrotowej szczotki w celu usunięcia zanieczyszczeń), w 70% etanolu (z sonikacją) i na koniec w 100% etanolu.
3. Kultury są hodowane do nasycenia (w tym przykładzie przez trzy dni w 20 °C, patrz Rysunek 1).

3. Wysiewanie kultur drożdży

1. Przy użyciu urządzenia Beckman Biomek FX, nasycone kultury resuspendsuje się poprzez mieszanie w vortexie Variomag Teleshake (przeciwnie do ruchu wskazówek zegara przy 1000 rpm przez 20 s), a następnie rozcieńcza się je w stosunku około 1:70, przenosząc do 200 μl sterylnej wody za pomocą sterylnego robotycznego narzędzia typu pin tool do płytek 96-dołkowych (magnetyczny pin tool V&P Scientific, średnica pinu 2 mm). Czystość i sterylność narzędzia zapewnia się poprzez płukanie w sterylnej wodzie, płukanie w 70% etanolu (z użyciem szczoteczki w celu usunięcia zanieczyszczeń), a na koniec zanurzenie w 70% etanolu i osuszenie.
2. Rozcieńczone kultury nanosi się na stałe pożywki agarowe w formacie 384 za pomocą tego samego robotycznego narzędzia pin tool (patrz Rysunek 1) po jego oczyszczeniu i sterylizacji.
3. Po naniesieniu kultur, płytki przenosi się do inkubatora Cytomat z kontrolą temperatury i wilgotności, wyposażonego w automatyczny karuzelowy system transportowy i okno dostępu.

4. Rejestracja obrazu

1. Zautomatyzowany system obrazowania S&P Robotics wielokrotnie wyjmuje płytki z inkubatora Cytomat, zdejmuje pokrywki, precyzyjnie umieszcza je w zamkniętej, równomiernie oświetlonej przestrzeni pod aparatem Canon EOS Rebel Ti 35mm DSLR, wykonuje zdjęcie w rozdzielczości 5184 x 3456 px, zakłada pokrywki i zwraca płytki do karuzeli inkubatora. Jedno zdjęcie jest wykonywane bezpośrednio po początkowym przeniesieniu do inkubatora, aby umożliwić pomiar wzrostu w punkcie zerowym (tło). Obsługa robotyczna i fotografia zajmują 2 min na płytkę.
2. Przy pełnej karuzeli maksymalna osiągalna częstotliwość przechwytywania obrazów płytek wynosi jedno zdjęcie co 6 hr. Płytki są inkubowane do sześciu dni (do momentu nasycenia wzrostu kolonii). Rysunek 1 przedstawia trzy typowe obrazy z serii czasowej w 20 °C.
3. W celach śledzenia płytki są nazywane zgodnie z nazwą inkubatora, temperaturą, unikalnym sekwencyjnym numerem partii oraz pozycją w inkubatorze. Nazwy obrazów stanowią połączenie nazwy płytki i znacznika czasu i są automatycznie tworzone podczas przechwytywania obrazu (np. K000011_030_010_2011-09-22_09-47-54.jpg, typ pliku FT1, Tabela 1).

5. Rejestracja metadanych eksperymentalnych

Pliki metadanych opisane w tej sekcji to pliki tekstowe rozdzielane tabulatorami, które są generowane ręcznie (np. przy użyciu arkuszy kalkulacyjnych). Plik Opisu Eksperymentu (FT2, Tabela 1) jest unikalny dla każdego eksperymentu, natomiast Opis Biblioteki (FT3, Tabela 1) może być wielokrotnie wykorzystywany po jego utworzeniu.

1. Eksperyment został opisany w pliku z opisem eksperymentalnym (FT2, Tabela 1), który zawiera kolumny dotyczące kodu kreskowego (lub automatycznie wygenerowanej nazwy płytki), znacznika czasu rozpoczęcia eksperymentu, traktowania płytki, składu stałego podłoża agarowego, nazwy przesiewania, biblioteki, numeru płytki (dla bibliotek obejmujących wiele płytek) oraz numeru kwadrantu powtórzeń (patrz Rysunek 1) w celu przeskalowania z formatu 1536 na format 384.
2. Biblioteka szczepów drożdży jest opisana w pliku z opisem biblioteki (FT3, Tabela 1), określającym genotyp hodowany w każdym miejscu kultury na każdej płytce w bibliotece. Zawiera on kolumny: nazwa biblioteki, ORF, numer płytki, wiersz płytki, kolumna płytki oraz opcjonalną kolumnę uwag.
3. Można dostarczyć opcjonalny plik ze standardowymi nazwami genów (FT4, Tabela 1) opisujący standardową nazwę genu (np. RAD9) powiązaną z każdym systematycznym numerem y ORF (np. YDR217C) identyfikującym przesiewane szczepy. Plik ten zawiera dwie kolumny: ORF i nazwa genu.

6. Analiza danych

Obliczeniowy schemat pracy QFA wymaga dostępu do odpowiednio wydajnej wielordzeniowej stacji roboczej (np. Dell Precision T3500 z czterordzeniowym procesorem Xeon 2,67 GHz i 12Gb RAM), na której zainstalowane są narzędzie do analizy obrazów Colonyzer ^3,4 oraz pakiet R dla QFA⁷; oba te narzędzia są udokumentowane online, ogólnodostępne i działają na wielu systemach operacyjnych.

1. Uruchom program Colonyzer, wykorzystując każde z wykonanych zdjęć płytek jako dane wejściowe, generując jeden plik wynikowy Colonyzer (FT5 Tabela 1) dla każdego wykonanego zdjęcia. Pliki wynikowe Colonyzer określają szacunki gęstości kultury, powierzchnię kultury, kształt i kolor dla każdego z 384 miejsc na obrazowanej płytce. Nazwa pliku wynikowego jest automatycznie kopiowana z nazwy pliku obrazu źródłowego (np. fotografia płytki K000011_030_010_2011-09-22_09-47-54.jpg (FT1, Tabela 1) odpowiada plikowi wynikowemu Colonyzer K000011_030_010_2011-09-22_09-47-54.dat (FT5, Tabela 1)).
2. Za pomocą pakietu R QFA załaduj metadane eksperymentalne (FT2, Tabela 1) oraz pliki wynikowe Colonyzer (FT5 Tabela 1). Dane te są łączone w ramki danych R (które mogą zostać wyeksportowane jako tekstowe pliki surowych danych QFA (FT6, Tabela 1)) do dalszej analizy.
3. Pakiet R QFA zawiera funkcje służące do gromadzenia przebiegów czasowych gęstości komórek dla każdej kultury, dopasowywania uogólnionych logistycznych modeli populacyjnych do obserwacji oraz ich wykreślania (przykłady znajdują się na Rysunkach 2 i 3). Dopasowane wartości parametrów są zapisywane w plikach parametrów logistycznych QFA (FT7 Tabela 1). Więcej szczegółów znajduje się w dokumentacji pakietu R QFA.
4. Pakiet R QFA zawiera również funkcje kontroli jakości: kolonie brzegowe są odrzucane ze względu na większą dostępność składników odżywczych na brzegach płytki i trudności w analizie obrazu w pobliżu ścianek płytki; z analizy usuwane są kultury, które nie przeszły testu SGA, oraz genotypy wykazujące sprzężenie z markerowymi genami specyficznymi dla przesiewu.
5. Na podstawie parametrów logistycznego modelu populacyjnego dla każdej kultury wyznacza się kilka ilościowych miar sprawności (fitness). Obejmują one maksymalne tempo podwojenia populacji (MDR) oraz liczbę podziałów od inokulacji do nasycenia (MDP). Dla każdego zestawu kultur powtórzonych (na przykład dla unikalnego genotypu) i dla każdej definicji sprawności oblicza się kilka statystyk podsumowujących szacunki sprawności: średnią i medianę sprawności, odchylenie standardowe sprawności oraz liczbę zaobserwowanych powtórzeń. Statystyki podsumowujące są zapisywane w plikach podsumowania sprawności QFA (FT8, Tabela 1) do dalszej analizy, np. obliczenia wyników interakcji genetycznych (FT9 Tabela 1).

7. Reprezentatywne wyniki

Rysunek 2 przedstawia jedną typową krzywą wzrostu spośród 384 kultur QFA rosnących w temperaturze 20 °C na stałym agarze, zmierzoną za pomocą Colonyzer, w której wzrost gęstości komórek staje się wykrywalny po około 2 dniach. Opóźnienie to jest prawdopodobnie łącznym efektem fazy adaptacyjnej kultury po inokulacji na podłoże stałe oraz dolnej granicy wykrywalności gęstości komórek. Rysunek 3 pokazuje 308 podobnych krzywych wzrostu zarejestrowanych z jednej płytki. Rysunek 4 demonstruje porównanie dwóch genomowych przesiewów QFA w celu określenia siły interakcji genetycznych (adaptowano z ¹). Pakiet R dla QFA ⁷ zawiera również funkcje służące do generowania Rysunku 3 oraz do wyjściowego zestawienia rankingowych list badanych genotypów i szacunków siły interakcji genetycznej (GIS), wraz z wartością q (wartość p skorygowana o stopień fałszywych odkryć (FDR)) dla istotności zaobserwowanego GIS.

Rysunek 1. Schemat robotycznej inokulacji szczepów drożdży w formacie 384 punktów. Procedura ta rozpoczyna się od 1536 niezależnych kultur na płytce (po lewej). W tym typowym przykładzie kolonie w pozycjach 1,1; 1,2; 2,1 i 2,2 (zaznaczone na czerwono) stanowią cztery powtórzenia tego samego genotypu. Kultury his3::KANMX zaznaczone na żółto, rosnące na krawędzi płytki, mają przewagę wzrostu ze względu na brak konkurencji i dlatego nie są badane metodą QFA. Jedno z tych powtórzeń (np. 1,1) jest inokulowane do płynnych mediów wzrostowych w płytkach 96-dołkowych przy użyciu narzędzia 96-igłowca, który za każdym razem inokuluje 96 z 1536 kolonii. Aby zaszczepić jedno powtórzenie dla każdego z 384 delecji genów, cztery różne „kwadranty” (oznaczone jako czerwony, niebieski, zielony i fioletowy) są inokulowane do czterech różnych płytek 96-dołkowych zawierających media wzrostowe. Po wzroście do nasycenia (np. 3 dni w 20 °C), kultury są rozcieńczane w wodzie, a następnie cztery kwadranty z jednego powtórzenia są naniesione w formacie 384 na stałą płytkę agarową (po prawej) w tym samym układzie co na oryginalnej płytce SGA (zgodnie z oznaczeniem kolorystycznym). Proces ten można powtórzyć w celu przetestowania pozostałych powtórzeń: 1,2; 2,1 i 2,2. Przykładowe obrazy time-lapse po prawej stronie zostały wykonane 0,5, 2 i 3,5 dni po inokulacji. Adaptacja z Rysunku uzupełniającego 1 ². Kliknij tutaj, aby wyświetlić większy rysunek.

Rycina 2. Pojedyncza krzywa wzrostu QFA zarejestrowana przez robota. A) Krzywa wzrostu QFA szczepu drożdży rosnących na agarze z galaktozą w temperaturze 20 °C. Obrazy były rejestrowane robotycznie mniej więcej co 2 godziny. Faza wykładnicza w tej temperaturze była obserwowalna przez około 1,5 dnia, a wzrost gęstości hodowli stał się wykrywalny około 2 dni po inokulacji. Do zaobserwowanych danych dopasowano uogólniony model logistyczny (krzywa szara). Przedstawiono parametry modelu automatycznie dopasowane przez pakiet R dla QFA: K (pojemność środowiska (AU)), r (szybkość wzrostu (d^-1)), g (gęstość inokulum (AU)), v (symetria wzrostu). B) Podobnie jak w panelu A, wykreślono z gęstością komórek w skali logarytmicznej. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną rycinę.

Rysunek 3. Automatycznie generowane krzywe wzrostu zarejestrowane równolegle z jednej płytki w formacie 384. Każdy panel przedstawia szacunki gęstości komórek (czerwone krzyżyki) i dopasowanie modelu (czarne krzywe) dla niezależnych kultur oznaczonych nazwą genu lub numerem y-ORF hodowanych w procedurze QFA. Ta przykładowa płytka została zobrazowana przez robota i hodowana w automatycznym inkubatorze w temperaturze 20 °C. Metadane eksperymentalne są automatycznie zawarte w tytule rysunku: nazwa płytki, traktowanie płytki, podłoże agarowe i numer płytki bibliotecznej. Dopasowane wartości parametrów modelu są również automatycznie wydrukowane na każdym panelu (patrz Rysunek 2). Kultury krawędziowe zostały usunięte z analizy QFA, co pozostawiło 308 kultur na tym wykresie (patrz Protokół QFA 5.4). Ponieważ kultury krawędziowe nie są analizowane w QFA, miejsca te są zazwyczaj wypełniane neutralnymi szczepami kontrolnymi (w tym przypadku pGAL-HIS3). Oryginalna wersja tego rysunku, wygenerowana przez pakiet R QFA, znajduje się w formacie .pdf i jest zatem nieskończenie powiększalna oraz przeszukiwalna za pomocą zapytań tekstowych. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększony rysunek.

Rycina 4. Porównanie dostosowania z dwóch przesiewów QFA w celu wywnioskowania interakcji genetycznej.Wykres ten przedstawia porównanie dostosowania (fitness) delecji drożdży pączkujących (yfgΔ) w połączeniu z neutralną mutacją ura3Δ lub mutacją wrażliwą na temperaturę cdc13-1, hodowanych w temperaturze półprzepuszczalnej dla cdc13-1 (27 °C). Dostosowanie obliczono jako iloczyn maksymalnej szybkości podwajania i maksymalnego potencjału podwajania ¹. Większość szczepów z delecjami rośnie dobrze w połączeniu z neutralną mutacją ura3Δ, co było oczekiwane, i wykazuje wysokie dostosowanie, natomiast delecje w połączeniu z cdc13-1 wykazują szeroki zakres dostosowania. Jasnoniebieskie linie przecinają się w miejscu neutralnej mutacji his3Δ; linia ciągła stanowi model regresji liniowej niezależności genetycznej (oczekiwane dostosowanie mutantów cdc13-1 yfgΔ przy danym dostosowaniu mutantów ura3Δ yfgΔ), a linia przerywana jest linią równości dostosowania. Delecje zaznaczone na zielono znacząco wzmacniają defekt dostosowania szczepów cdc13-1. Delecje zaznaczone na czerwono znacząco supresują ten sam defekt. Odległość pionowa dowolnej mutacji cdc13-1 yfgΔ od linii ciągłej wskazuje siłę interakcji genetycznej między cdc13-1 a yfgΔ w warunkach hodowli na płytkach. Należy zauważyć, że niektórymi z najsilniejszych supresorów cdc13-1 są wcześniej zidentyfikowane geny punktu kontrolnego RAD17, DDC1 i RAD24 oraz nukleaza EXO1 w prawym górnym rogu. Geny, których delecja zmniejsza dostosowanie, obejmują YKU80 (kodujący białko naprawy DNA i cappingu telomerów Yku80) w prawym dolnym rogu. Warto również zauważyć, że niektóre grupy genów funkcjonujących wspólnie mają tendencję do współlokalizacji na tym wykresie. Trzy przykładowe klastry są zaznaczone na niebiesko: SPE1, SPE2 i SPE3: geny syntezy espermidyny; RAD17, DDC1 i RAD24: kodujące składniki przesuwnej obręczy punktu kontrolnego (checkpoint sliding clamp) i ładowarki obręczy punktu kontrolnego (checkpoint clamp loader); MRE11, RAD50 i XRS2: kompleks MRX zaangażowany w DDR oraz EST1 i EST3: geny zaangażowane w regulację długości telomerów. Adaptowano z Supplementary Figure 1B ¹; surowe dane, na podstawie których wygenerowano ten wykres, można pobrać stąd: http://research.ncl.ac.uk/colonyzer/AddinallQFA/. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną rycinę.

Id pliku	Typ pliku	Utworzony ręcznie	Częstotliwość aktualizacji	Wymóg wstępny
FT1	Fotografia płytki	Nie	Na każdą płytkę i punkt czasowy	Tak
FT2	Opis eksperymentu	Tak	Na każdy eksperyment	Tak
FT3	Opis biblioteki	Tak	Na każdą bibliotekę	Tak
FT4	Standardowe nazwy genów	Tak	Na każdą bibliotekę	Nie
FT5	Wynik Colonyzer	Nie	Na każdy punkt czasowy na płytkę	Tak
FT6	Surowe dane QFA	Nie	Na każdy eksperyment	-
FT7	Parametry logistyczne QFA	Nie	Na każdy eksperyment	-
FT8	Podsumowanie sprawności QFA	Nie	Na każdy eksperyment	-
FT9	Lista trafień interakcji genetycznych QFA	Nie	Na każde badanie GIS (2 eksperymenty)	-

Tabela 1. Elektroniczne pliki QFA. Wszystkie wymienione pliki (z wyjątkiem FT1) są plikami tekstowymi rozdzielanymi tabulatorami i mogą być tworzone lub odczytywane przy użyciu dowolnego edytora tekstu lub programu do arkuszy kalkulacyjnych. Aby uzyskać więcej szczegółów na temat tworzenia plików z metadanymi QFA i dokładnej interpretacji wyników QFA, należy zapoznać się z dokumentacją pakietu R dla QFA ⁷ oraz dokumentacją oprogramowania Colonyzer ³.

Tabela 2. Metody oceny kondycji hodowli. Podsumowanie cech i wymagań szeregu metod oceny kondycji hodowli drobnoustrojów. Przegląd autorstwa Blomberga ⁸ zawiera bardziej szczegółowe porównanie niektórych z tych metod. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą grafikę.

Dyskusja

QFA jest w wielu aspektach bezpośrednim rozwinięciem trzech uznanych mikrobiologicznych technik laboratoryjnych: testów punktowych z serii rozcieńczeń kultur ⁹, wyznaczania krzywej wzrostu w napowietrzanych kulturach ciekłych ⁹ oraz metody replikowania ¹³. Trzy te metody zostały podsumowane i porównane z QFA oraz innymi technikami wysokoprzepustowymi w Tabeli 2. Podczas gdy testy punktowe z serii rozcieńczeń definiują fitness szczepu jako jego zdolność do tworzenia kolonii w serii kultur hodowanych z różnych rozcieńczeń inokulum, QFA mierzy fitness szczepu poprzez powtarzalne obserwacje pojedynczej kultury w celu skonstruowania krzywej wzrostu. Ilościowe określanie fitness na podstawie pojedynczych kultur pozwala na jednoczesne badanie znacznie większej liczby szczepów w identycznych warunkach. Replikowanie macierzy kultur umożliwia wielokrotne testowanie kolekcji szczepów, co jest szczególnie przydatne przy badaniu różnic w fitness kultur w różnych środowiskach lub przy różnych tłach genetycznych. Przedstawiony tutaj protokół QFA wykorzystuje kosztowny sprzęt robotyczny do replikowania, inokulowania, inkubowania i obrazowania szalek z agarem, co jest odpowiednie do obserwacji wzrostu tysięcy niezależnych kultur (robotyczne QFA, Tabela 2). Ponieważ jednak QFA opiera się na uznanych, tradycyjnych technikach laboratoryjnych, można je przeprowadzić znacznie taniej, zastępując pomoc robota krokami manualnymi (manualne QFA, Tabela 2). Manualne QFA obejmuje replikowanie i inokulowanie kultur na szalkach z agarem przy użyciu manualnego narzędzia z pinem oraz ręczne przenoszenie szalek do inkubatora i z inkubatora w celu wykonania zdjęć. Ten sam schemat analizy obliczeniowej może zostać zastosowany do generowania krzywych wzrostu dla obu projektów eksperymentalnych.

Szacunki sprawności (fitness) uzyskane metodą QFA wydają się być stosunkowo precyzyjne. Na Rysunku 4 wyróżniono średnie wartości sprawności dla czterech przykładowych klastrów delecji genów powiązanych funkcjonalnie. Bliskie sąsiedztwo członków każdej klasy genów powiązanych funkcjonalnie w dwóch niezależnych tłach genetycznych (ura3Δ oraz cdc13-1) wskazuje na powtarzalność szacunków sprawności QFA. Na przykład tylko 3 delecje genów (z możliwych 4300) oddzielają trzy człony konserwatywnego kompleksu MRX.

Wysokoprzepustowe alternatywy dla QFA do badania charakterystyki wzrostu szczepów mikrobiologicznych obejmują SGA ^5,6, przesiewy konkurencyjne w bibliotekach z kodami kreskowymi ^11,12 oraz przesiewy rejestrujące kinetykę gęstości optycznej w płytkowych czytnikach spektrofotometrycznych ¹⁰, które zostały podsumowane w Tabeli 2 i opisane szerzej w innym opracowaniu ⁸. Płytki QFA i SGA, na których kultury rosną na stałych powierzchniach agarowych (metody oparte na agarze, Tabela 2), mogą być szybko i łatwo obsługiwane przez robota. Kultury na stałej powierzchni agarowej są dobrze napowietrzone przez cały czas wzrostu, a komórki mogą rosnąć w kulturach stacjonarnych, co pozwala mikroorganizmom wykazującym socjalność na wzrost w obrębie społeczności ¹⁴. Pozostawione w nienaruszonym stanie, społeczności mikrobiologiczne wpływają na swoje mikrootoczenie, wydzielając toksyny, takie jak etanol, i potencjalnie sygnalizując między komórkami. Jednak ciągłe mieszanie kultur w cieczy, niezbędne do zapewnienia odpowiedniego napowietrzenia, sztucznie zaburza społeczności mikrobiologiczne i ich mikrootoczenie, co może wpływać na ich tryby wzrostu. Zanieczyszczenia krzyżowe stanowią mniejszy problem w metodach na stałym agarze, ponieważ istnieje mniejsza możliwość rozpryskiwania cieczy przenoszącej komórki między kulturami. Jeśli w badaniach na stałym agarze dojdzie do kontaminacji obcymi mikrobami przenoszonymi przez powietrze, można ją często wykryć poprzez inspekcję wizualną płytek agarowych i uwzględnić lub usunąć.

Przepustowość QFA jest znacznie wyższa niż w przypadku równoległych metod w cieczy na dwa sposoby. Po pierwsze, na płytkach QFA (i SGA) zaszczepione kultury są rozmieszczone gęściej, co pozwala na uzyskanie większej liczby niezależnych kultur na jednej płytce. W QFA zazwyczaj znajduje się 308 kultur, nie licząc kultur brzegowych niezwiązanych z eksperymentem (Rycina 1), w porównaniu do równoległych kultur w cieczy, gdzie na płytce znajduje się 96 lub 100 kultur. Po drugie, eksperymenty QFA można skalować do znacznie większej liczby płytek. Podczas gdy liczba płytek analizowanych w pojedynczym eksperymencie QFA jest ograniczona jedynie dostępną przestrzenią w inkubatorze lub pomieszczeniu termostatycznym, minimalną dopuszczalną oraz maksymalną osiągalną częstotliwością przechwytywania obrazów, liczba płytek w eksperymencie wzrostu w cieczy jest silnie ograniczona wydajnością czytnika płytek (zazwyczaj jedna lub dwie płytki) lub stosownika dołączonego do czytnika płytek (zazwyczaj 25-50 płytek). Niedawno przeprowadziliśmy w pełni zautomatyzowany eksperyment QFA na 123 płytkach, z których każda zawierała 308 kultur eksperymentalnych, co dało łącznie 37 884 symultanicznych kultur. Szacujemy, że maksymalna osiągalna liczba niezależnych kultur rosnących w cieczy wynosi 96 (kultur/płytka) x 50 (płytek/stosownik) = 4800, co jest około dziesięciokrotnie mniejszą wartością niż przepustowość QFA. Alternatywą dla przesiewu kultur w cieczy jest wykorzystanie wielu zautomatyzowanych urządzeń do wzrostu równolegle (Tabela 1 z przeglądu Blomberga ⁸), z których każde posiada pojemność jednej lub dwóch płytek. Kontrola temperatury w każdym urządzeniu jest niezależna, zatem warunki nie są identyczne, ale zakładając, że takie są, ten przepływ pracy wymagałby co najmniej 190 takich urządzeń, aby zrównać się z przepustowością QFA (zakładając 200 kultur w cieczy na urządzenie).

Podsumowując, QFA jest wysokiej jakości procesem analitycznym, który można z powodzeniem zastosować do gromadzenia ilościowych fenotypów wzrostu zarówno w niewielkich eksperymentach ukierunkowanych, jak i w badaniach wysokoprzepustowych. Jest on wystarczająco elastyczny, aby efektywnie funkcjonować przy różnych wymaganiach dotyczących wyposażenia robotycznego. Komponent obliczeniowy procesu QFA opiera się na ogólnodostępnym kodzie o otwartym źródle.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Plater do replikacji	Sigma	R-2508	ręczny wyciągacz pinów 96-dołkowy z końcówką 1/8 " piny ustalające
Mix Mate	Eppendorf	5353 000.014
Biomek FX	Beckman	A31842
Teleshake	Thermo Scientific	50095890	Zainstalowano na Biomek FX
BM3-SC	S&P Robotics Inc	BM3-SC	karuzela obrotowa z 192 półkami
spImager	S&P Robotics Inc	spImager	Manualne obrazowanie o wysokiej rozdzielczości
spImager z systemem Cytomat	S&P Robotics Inc	Niestandardowy	Zautomatyzowane obrazowanie o wysokiej rozdzielczości z kontrolą temperatury
Cytomat 6001 z wymiennikiem ciepła	Thermo Scientific	51022222	Przyłączony do spImager
Ecoline RE207	Lauda	RE207	Przymocowany do Cytomatu
spImager z karuzelą	S&P Robotics Inc	Niestandardowy	Zautomatyzowane obrazowanie o wysokiej rozdzielczości
Uchwyt narzędzia do pinów robota dla FP12pins	V&P Scientific	AFIX96FP12	Nie dotyczy
96 pinu FP12	V&P Scientific	FP12	długość 50,4 mm, długość wystającego pinu 17 mm
Stacja dokująca dla narzędzia do pinowania	V&P Scientific	VP425	Podstawa stacji dokującej została zdjęta, aby umożliwić wysuszenie pinów za pomocą wentylatora
Szczoteczka do czyszczenia pinów	V&P Scientific	VP425	Proszę podać tekst źródłowy do tłumaczenia.
Plater do replikacji	Sigma	R-2508	Ręczne narzędzie do pinów
Nunc OmniTray z pokrywką	Nunc	734-0490	Nie dotyczy
sterylne płytki polistyrenowe z 96 dołkami	Greiner BioOne	655161	Brak danych
sterylne pokrywki polistyrenowe do płytek 96-dołkowych	Greiner BioOne	656171	Ponieważ nie dostarczono tekstu źródłowego do tłumaczenia, proszę o przesłanie materiałów, które mają zostać przetłumaczone na język polski zgodnie z wytycznymi.
Tabela 3. Specyficzne odczynniki i sprzęt.