Przepływ pracy ilościowej analizy sprawności fizycznej

Summary

Ilościowa Analiza Dopasowania (QFA) to komplementarna seria eksperymentalnych i obliczeniowych metod do szacowania sprawności kultur mikrobiologicznych. QFA szacuje wpływ mutacji genetycznych, leków lub innych stosowanych metod leczenia na wzrost drobnoustrojów. Można zaprojektować eksperymenty skalujące się od ukierunkowanej analizy pojedynczych kultur do tysięcy równoległych kultur.

Abstract

Ilościowa Analiza Sprawności (QFA) to eksperymentalny i obliczeniowy proces pracy do porównywania sprawności kultur mikrobiologicznych hodowanych równolegle^1,2,3,4. QFA może być stosowana do ukierunkowanych obserwacji pojedynczych kultur, ale jest najbardziej przydatna do interakcji genetycznych całego genomu lub badań przesiewowych leków badających do tysięcy niezależnych kultur. Główną metodą eksperymentalną jest inokulacja niezależnych, rozcieńczonych, płynnych kultur drobnoustrojów na stałe płytki agarowe, które są inkubowane i regularnie fotografowane. Fotografie z każdego punktu czasowego są analizowane, tworząc ilościowe szacunki gęstości komórek, które są wykorzystywane do konstruowania krzywych wzrostu, umożliwiając wyprowadzenie ilościowych miar dopasowania. Dopasowania kulturowe mogą być porównywane w celu ilościowego określenia i uszeregowania siły interakcji genetycznych lub wrażliwości na leki. Wpływ na przydatność hodowlaną wszelkich zabiegów dodanych do agaru substratowego (np. małe cząsteczki, antybiotyki lub składniki odżywcze) lub zastosowanych na płytki zewnętrznie (np. promieniowanie UV, temperatura) można określić ilościowo za pomocą QFA.

Przepływ pracy QFA generuje szacunki tempa wzrostu analogiczne do tych uzyskanych przez spektrofotometryczne pomiary równoległych kultur płynnych w 96-dołkowych lub 200-dołkowych czytnikach płytek. Co ważne, QFA ma znacznie wyższą przepustowość w porównaniu z takimi metodami. Kultury QFA rosną na solidnej powierzchni agaru i dlatego są dobrze napowietrzone podczas wzrostu bez konieczności mieszania lub potrząsania.

Przepustowość QFA nie jest tak wysoka, jak w przypadku niektórych metod przesiewowych Synthetic Genetic Array (SGA)^5,6. Jednakże, ponieważ kultury QFA są mocno rozcieńczone przed zaszczepieniem na agarze QFA może uchwycić bardziej kompletne krzywe wzrostu, w tym fazy wykładnicze i nasycenia³. Na przykład obserwacje krzywej wzrostu pozwalają na bezpośrednie oszacowanie czasów podwajania hodowli z dużą precyzją, jak omówiono wcześniej¹.

Tutaj prezentujemy specyficzny protokół QFA stosowany do tysięcy kultur S. cerevisiae, które są automatycznie obsługiwane przez roboty podczas inokulacji, inkubacji i obrazowania. Każdy z tych zautomatyzowanych kroków może zostać zastąpiony równoważną, ręczną procedurą, co wiąże się ze zmniejszeniem przepustowości, a także przedstawiamy protokół ręczny o niższej przepustowości. Te same narzędzia programowe QFA można zastosować do obrazów zarejestrowanych w dowolnym przepływie pracy.

Mamy duże doświadczenie w stosowaniu QFA do kultur pączkujących drożdży S. cerevisiae, ale oczekujemy, że QFA okaże się równie przydatna do badania kultur rozszczepienia drożdży S. pombe i kultur bakteryjnych.

Protocol

Ręczny protokół QFA (dla szczepów S. cerevisiae)

1. Hodowla szczepów drożdży

1. Do 96 niezależnych szczepów drożdży jest hodowanych w 200 μl bogatej pożywki płynnej w 96-dołkowym naczyniu hodowlanym. Szczepy są hodowane do nasycenia w inkubatorze z kontrolowaną temperaturą.
2. 96-pinowa ręczna replika plater o średnicy 1/8" (SIGMA R-2508) jest sterylizowana poprzez uprzednie zanurzenie repliki w 100% etanolu, płomienie, a następnie pozostawienie do ostygnięcia.
3. 200 μl sterylnej wody umieszcza się na 96-dołkowej płytce hodowlanej. Nasycone kultury są wirowane (Eppendorf MixMate, 30 sekund, 750 obr./min) i rozcieńczane poprzez trzykrotne zanurzenie wysterylizowanego narzędzia do szpilek w nasyconych szczepach, a następnie jednokrotnie w płytce zawierającej wodę.
4. Narzędzie do szpilek jest ponownie sterylizowane zgodnie z ppkt. 1.2.
5. Wysterylizowane narzędzie do szpilek służy do namierzania rozcieńczonej kultury na sprzedawanych płytkach agarowych poprzez trzykrotne zanurzenie w płytce zawierającej rozcieńczoną kulturę, a następnie przeniesienie narzędzia do szpilek na prostokątną płytkę z litego agaru.
6. Prostokątne, stałe płytki agarowe są inkubowane w odpowiedniej temperaturze, a następnie ręcznie obrazowane za pomocą skanera s&P Robotics. Można również zastosować alternatywne metody przechwytywania obrazu, takie jak LAS4000 FujiFilm lub tańsza lustrzanka cyfrowa, jeśli zadba się o równomierne oświetlenie i spójne ustawienie płyty względem aparatu do obrazowania.
7. Metodę można dostosować do mniejszej liczby równoległych kultur, takich jak 48, które można zamontować na okrągłych szalkach Petriego, jeśli zadba się o zapewnienie tego samego kąta względem kamery obrazującej podczas każdego zdjęcia.

W pełni zautomatyzowany protokół QFA (dla szczepów S. cerevisiae)

2. Hodowla szczepów drożdży

1. Zacznij od prostokątnego układu niezależnych szczepów drożdży rosnących na stałym agarze . W tym przykładzie szczepy wyjściowe są wynikiem skrzyżowania wrażliwej na temperaturę mutacji zapytania z kolekcją delecji drożdży (YDC) przez syntetyczną macierz genetyczną (SGA). Końcowe płyty SGA są w formacie 1536. Jest to 16 rzędów w 24 kolumnach kolonii/kultur reprezentujących cztery repliki 384 niezależnych szczepów drożdży. Patrz rysunek 1, aby zapoznać się z układami płyt.
2. 384 szczepy z 1536 są przenoszone zrobotyzowane za pomocą robota BM3-SC firmy S&P Robotics Inc z 96-pinowym sterylnym pintoolem o średnicy 1 mm do czterech 96-dołkowych płytek hodowlanych zawierających 200 μl selektywnych pożywek (rysunek 1). Czystość i sterylność narzędzia uzyskuje się poprzez sekwencyjne dwukrotne mycie w sterylnej wodzie (raz za pomocą obrotowej szczotki do usuwania zanieczyszczeń), 70% etanolu (z sonikacją) i na końcu 100% etanolu.
3. Kultury są hodowane do nasycenia (przez trzy dni w temperaturze 20 °C w tym przykładzie, patrz rysunek 1).

3. Rozpoznawanie kultur drożdży

1. Za pomocą Beckman Biomek FX nasycone kultury są ponownie zawieszane przez wirowanie na Variomag Teleshake (w kierunku przeciwnym do ruchu wskazówek zegara przy 1000 obr./min przez 20 sekund) i rozcieńczane w około 1:70 przez przypinanie do 200 μl sterylnej wody za pomocą sterylnego 96-pinowego narzędzia do kołków robotycznych (magnetyczny pintool do montażu V&P Scientific, średnica sworznia 2 mm). Czystość i sterylność narzędzia do szpilek uzyskuje się poprzez mycie w sterylnej wodzie, mycie w 70% etanolu (za pomocą szczotki do usuwania zanieczyszczeń) i wreszcie zanurzanie w 70% etanolu, a następnie suszenie.
2. Rozcieńczone kultury są namierzane na twardych płytkach agarowych w formacie 384 za pomocą tego samego zrobotyzowanego narzędzia do szpilek (patrz rysunek 1) po oczyszczeniu i sterylizacji.
3. Po przypięciu płytki są przenoszone do nawilżanego inkubatora Cytomat z kontrolowaną temperaturą z automatyczną karuzelą i włazem dostępowym.

4. Przechwytywanie obrazu

1. Zautomatyzowany imager firmy S&P Robotics wielokrotnie wyjmuje płytki z inkubatora Cytomat, zdejmuje pokrywę płytki, umieszcza je precyzyjnie pod zamkniętą, równomiernie oświetloną przestrzenią pod lustrzanką cyfrową Canon EOS Rebel Ti 35 mm, rejestruje obraz w rozdzielczości 5184 x 3456 px, zakłada pokrywę płytki i zwraca je do karuzeli inkubatora. Jeden obraz jest rejestrowany natychmiast po wstępnym przeniesieniu do inkubatora, aby umożliwić pomiar zerowego punktu wzrostu w czasie (tło). Obsługa i fotografowanie robota zajmuje 2 minuty na płytę.
2. Przy w pełni załadowanej karuzeli maksymalna osiągalna częstotliwość przechwytywania obrazu na płytce to jedno zdjęcie co 6 godzin. Płytki inkubuje się przez okres do sześciu dni (aż do nasycenia wzrostu kolonii. Rysunek 1 przedstawia trzy typowe obrazy z przebiegu czasowego w temperaturze 20 °C.
3. W celu śledzenia płytki są nazwane zgodnie z nazwą inkubatora, temperaturą, unikalnym kolejnym numerem partii i pozycją w inkubatorze. Nazwy obrazów są konkatenacją nazwy płyty i znacznika czasu i są tworzone automatycznie po przechwyceniu obrazu (np. K000011_030_010_2011-09-22_09-47-54.jpg, Typ pliku FT1, Tabela1).

5. Przechwytywanie metadanych eksperymentalnych

Pliki metadanych opisane w tej sekcji to pliki tekstowe rozdzielane tabulatorami, które są generowane ręcznie (np. za pomocą oprogramowania do obsługi arkuszy kalkulacyjnych). Plik opisu eksperymentu (FT2, tabela 1) jest unikatowy dla każdego eksperymentu, ale opis biblioteki (FT3, tabela 1) może być ponownie szeroko wykorzystany po skonstruowaniu.

1. Eksperyment jest opisany w pliku opisu eksperymentu (FT2, Tabela 1) zawierającym kolumny dla kodu kreskowego (lub automatycznie wygenerowanej nazwy płytki), znacznika czasu rozpoczęcia eksperymentu, obróbki płytki, zawartości stałego podłoża agarowego, nazwy ekranu, biblioteki, numeru płyty (dla bibliotek z wieloma płytkami) i numeru kwadrantu powtórzenia (patrz rysunek 1) do skalowania w dół z formatu 1536 do formatu 384.
2. Biblioteka szczepów drożdży jest opisana za pomocą pliku opisu biblioteki (FT3, Tabela 1) określającego genotyp uprawiany w każdej lokalizacji kultury na każdej płycie biblioteki. Zawiera kolumny dla: nazwy biblioteki, ORF, numeru tablicy, wiersza tablicy, kolumny tablicy oraz opcjonalnej kolumny notatek.
3. Można dostarczyć opcjonalny plik standardowej nazwy genu (FT4, tabela 1) opisujący standardową nazwę genu (np. RAD9) powiązaną z każdym systematycznym numerem y ORF (np. YDR217C) identyfikującym szczepy poddawane badaniom przesiewowym. Ten plik zawiera dwie kolumny: ORF i nazwę genu.

6. Analiza danych

Przepływ pracy obliczeniowej QFA wymaga dostępu do dość wydajnej wielordzeniowej stacji komputerowej (np. Dell Precision T3500 z czterordzeniowym procesorem Xeon 2,67 GHz i 12Gb RAM), na której zainstalowane jest narzędzie do analizy obrazów Colonyzer ^3,4 i pakiet QFA R⁷, które są udokumentowane online, są swobodnie dostępne i działają na różnych systemach operacyjnych.

1. Uruchom Colonyzer z każdym z przechwyconych obrazów płyt jako danymi wejściowymi, generując jeden plik wyjściowy Colonyzer (FT5 Tabela 1) dla każdego przechwyconego obrazu. Pliki wyjściowe Colonyzer określają szacunkową gęstość hodowli, obszar hodowli, kształt i kolor dla każdej z 384 lokalizacji na zobrazowanej płycie. Nazwa pliku wyjściowego jest automatycznie kopiowana z nazwy pliku obrazu źródłowego (np. K000011_030_010_2011-09-22_09-47-54.jpg zdjęcia płyty (FT1, Tabela 1) odpowiada K000011_030_010_2011-09-22_09-47-54.dat pliku wyjściowego Colonyzer (FT5, Tabela 1)).
2. Korzystając z pakietu QFA R, załaduj metadane eksperymentalne (FT2, Tabela 1) i pliki wyjściowe Colonyzer (FT5 Tabela 1). Dane te są łączone w ramki danych R (które można wyeksportować jako pliki tekstowe QFA Raw Data (FT6, Tabela 1)) w celu dalszej analizy.
3. Pakiet QFA R zawiera funkcje do zbierania przebiegów czasowych gęstości komórek dla każdej hodowli, dopasowywania uogólnionych modeli populacji logistycznych do obserwacji i wykreślania obu tych elementów (patrz rysunki 2 i 3 dla przykładów). Wartości dopasowanych parametrów są zapisywane w plikach parametrów logistycznych QFA (FT7, tabela 1). Aby uzyskać więcej informacji, zobacz dokumentację pakietu QFA R.
4. Pakiet QFA R zawiera również funkcje kontroli jakości: kolonie brzegowe są odrzucane ze względu na większą dostępność składników odżywczych na krawędziach płytki i trudności z analizą obrazu w pobliżu ścianek płytki, kultury, które nie przeszły SGA, oraz genotypy wykazujące powiązanie z genami markerowymi specyficznymi dla badania przesiewowego są usuwane z analizy.
5. Na podstawie parametrów modelu populacji logistycznej dla każdej kultury wyprowadza się kilka ilościowych miar dopasowania. Obejmują one maksymalne wskaźniki podwojenia populacji (MDR) i liczbę podziałów od szczepienia do saturacji (MDP). Dla każdego zestawu powtórzonych kultur (na przykład o unikalnym genotypie) i dla każdej definicji dopasowania oblicza się kilka zbiorczych statystyk oszacowań dopasowania: średnie i medianę dopasowania, odchylenie standardowe dopasowania i liczbę zaobserwowanych powtórzeń. Statystyki podsumowujące są wprowadzane do plików QFA Fitness Summary (FT8, tabela 1) w celu dalszej analizy, np. obliczenia wyników interakcji genetycznych (FT9 tabela 1).

7. Reprezentatywne wyniki

Rysunek 2 pokazuje jedną typową krzywą wzrostu z 384 kultur QFA rosnących w temperaturze 20 °C na stałym agarze określonym ilościowo przez Colonyzer, przy czym wzrost gęstości komórek staje się wykrywalny po raz pierwszy po około 2 dniach. Opóźnienie to jest prawdopodobnie połączonym efektem fazy opóźnienia hodowli po inokulacji na pożywce stałej i dolnej granicy wykrywalności gęstości komórek. Rysunek 3 przedstawia 308 podobnych krzywych wzrostu uchwyconych z jednej płytki. Rysunek 4 przedstawia porównanie dwóch badań przesiewowych QFA obejmujących cały genom w celu wywnioskowania siły interakcji genetycznej (dostosowano z ¹). Pakiet ^{QFA R 7} zawiera również funkcje do tworzenia rysunku 3 i generowania rankingowych list badanych genotypów i oszacowań siły interakcji genetycznych (GIS), wraz z wartością q (skorygowana wartość p współczynnika fałszywych odkryć (FDR)) dla znaczenia obserwowanego GIS.

Rysunek 1. Schemat zrobotyzowanej inokulacji szczepów drożdży w formacie 384-punktowym. Ta procedura rozpoczyna się od 1536 niezależnych kultur na płytkę (po lewej). W tym typowym przykładzie kolonie na pozycjach 1,1; 1,2; 2,1 i 2,2 (w kolorze czerwonym) to cztery powtórzenia tego samego genotypu. Kultury his3::KANMX w kolorze żółtym, rosnące na krawędzi płytki, mają przewagę wzrostu z powodu braku konkurencji i dlatego nie są badane przez QFA. Jedna z tych kontrprób (np. 1,1) jest zaszczepiana do płynnych pożywek wzrostowych na 96-dołkowych płytkach za pomocą 96-pinowego narzędzia, które za każdym razem zaszczepia 96 z 1536 kolonii. W celu zaszczepienia jednego powtórzenia dla każdej z 384 delecji genów, cztery różne "ćwiartki" (oznaczone jako czerwony, niebieski, zielony i fioletowy) są inokulowane do czterech różnych 96-dołkowych płytek zawierających pożywkę wzrostową. Po wzroście do nasycenia (np. 3 dni w temperaturze 20 °C) kultury rozcieńcza się w wodzie, a następnie cztery ćwiartki z jednego powtórzenia są nakrapiane w formacie 384 na stałej płytce agarowej (po prawej) w tym samym wzorze, co oryginalna płytka SGA (jak wskazano kolorem). Proces można powtórzyć w celu zbadania innych kontrprób: 1,2; 2,1 oraz 2,2. Przykładowe zdjęcia poklatkowe po prawej stronie zostały zrobione 0,5, 2 i 3,5 dnia po zaszczepieniu. Na podstawie rysunku uzupełniającego 1 ². Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą postać.

Rysunek 2. Pojedyncza krzywa wzrostu QFA przechwycona przez robota. A) Krzywa wzrostu QFA szczepu drożdży rosnącego na agarze zawierającym galaktozę w temperaturze 20 °C. Obrazy były rejestrowane przez roboty mniej więcej co 2 godziny. Faza wykładnicza w tej temperaturze była obserwowana przez około 1,5 dnia, przy czym wzrost gęstości hodowli stał się wykrywalny po około 2 dniach po inokulacji. Do obserwowanych danych dopasowano uogólniony model logistyczny (szara krzywa). Przedstawiono parametry modelu automatycznie montowane przez pakiet QFA R: K (nośność (AU)), r (szybkość wzrostu (^d-1)), g (gęstość inokulum (AU)), v (symetria wzrostu). B) Jeśli chodzi o panel A, wykreślony z gęstością komórek w skali logarytmicznej. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą postać.

Rysunek 3. Automatycznie generowane krzywe wzrostu uchwycone równolegle z pojedynczej płyty formatu 384. Każdy panel pokazuje szacunkową gęstość komórek (czerwone krzyżyki) i dopasowanie modelu (czarne krzywe) dla niezależnych kultur oznaczonych nazwą genu lub numerem y ORF wyhodowanych w procedurze QFA. Ta przykładowa płytka została zobrazowana przez robota i wyhodowana w automatycznym inkubatorze w temperaturze 20 °C. Metadane eksperymentalne są automatycznie dołączane do tytułu rysunku: nazwa płytki, obróbka płytki, podłoże agarowe i numer tablicy bibliotecznej. Wartości parametrów dopasowanego modelu są również automatycznie drukowane na każdym panelu (patrz rysunek 2). Kultury brzegowe zostały usunięte z analizy QFA, pozostawiając 308 kultur na tym wykresie (patrz Protokół QFA 5.4). Ponieważ hodowle brzegowe nie są analizowane w QFA, te lokalizacje kultur są zwykle wypełnione neutralnymi szczepami kontrolnymi (w tym przypadku pGAL-HIS3). Oryginalna wersja tego rysunku, generowana przez pakiet QFA R, jest w formacie .pdf i dlatego można ją w nieskończoność powiększać i przeszukiwać za pomocą zapytań tekstowych. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą postać.

Rysunek 4. Porównanie sprawności z dwóch ekranów QFA w celu wydedukowania interakcji genetycznej. Wykres ten przedstawia porównanie przydatności pączkujących delecji drożdży (yfgΔ) w połączeniu z obojętną mutacją ura3Δ lub wrażliwą na temperaturę mutacją cdc13-1 i hodowanych w temperaturze półdopuszczalnej dla cdc13-1 (27 °C). Sprawność obliczono jako iloczyn maksymalnego współczynnika podwojenia i maksymalnego potencjału podwojenia ¹. Większość szczepów delecyjnych rośnie dobrze w połączeniu z neutralną mutacją ura3Δ, zgodnie z oczekiwaniami i ma wysoką przydatność, ale delecje w połączeniu z cdc13-1 mają szeroki zakres sprawności. Jasnoniebieskie linie przecinają się w miejscu neutralnej mutacji his3Δ, linia ciągła to liniowy model regresji niezależności genetycznej (oczekiwane dopasowanie mutantów cdc13-1 yfgΔ biorąc pod uwagę przydatność mutantów ura3Δ yfgΔ), a linia przerywana to linia równej sprawności. Delecje w kolorze zielonym znacznie zwiększają defekt sprawności szczepów cdc13-1. Skreślenia w kolorze czerwonym znacznie tłumią tę samą wadę. Pionowa odległość dowolnej mutacji cdc13-1 yfgΔ od linii ciągłej wskazuje na siłę interakcji genetycznej między cdc13-1 i yfgΔ w warunkach płytki. Należy zauważyć, że jednymi z najsilniejszych supresorów cdc13-1 są wcześniej zidentyfikowane geny punktów kontrolnych, RAD17, DDC1 i RAD24 oraz nukleaza EXO1 w pobliżu prawego górnego rogu. Geny, których delecja zmniejsza dopasowanie, obejmują YKU80 (kodujący naprawę DNA i białko zamykające telomery Yku80) w pobliżu prawego dolnego rogu. Należy również zauważyć, że niektóre grupy genów, które funkcjonują razem, mają tendencję do kolokowania na tej działce. Trzy przykładowe klastry są zaznaczone na niebiesko SPE1, SPE2 i SPE3: geny syntezy spermidyny, RAD17, DDC1 i RAD24: kodujące składniki zacisku przesuwnego punktu kontrolnego i ładowarki zacisków punktu kontrolnego, MRE11, RAD50 i XRS2: kompleks MRX, zaangażowany w DDR oraz EST1 i EST3: geny zaangażowane w regulację długości telomerów. Na podstawie rysunku uzupełniającego 1B ¹, surowe dane, z których wygenerowano ten wykres, można pobrać stąd: http://research.ncl.ac.uk/colonyzer/AddinallQFA/. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą postać.

Identyfikator pliku Typ pliku Konstruowane ręcznie Częstotliwość aktualizacji warunek wstępny Klasa FT1 Zdjęcie na płycie Nie Na płytę i punkt czasowy tak Klasa FT2 Opis eksperymentu tak Na eksperyment tak Zobacz materiał FT3 Opis biblioteki tak Na bibliotekę tak Zobacz materiał FT4 Standardowe nazwy genów tak Na bibliotekę Nie Zobacz materiał FT5 Produkcja Colonyzer Nie Na punkt czasowy na płytę tak Zobacz materiał FT6 Surowe dane QFA Nie Na eksperyment - Zobacz materiał FT7 Parametry logistyczne QFA Nie Na eksperyment - Zobacz materiał FT8 Podsumowanie QFA Fitness Nie Na eksperyment - Zobacz materiał FT9 Lista trafień interakcji genetycznych QFA Nie Na badanie GIS (2 expts.) -

Tabela 1. Elektroniczne pliki QFA. Wszystkie wymienione pliki (z wyjątkiem FT1) są plikami tekstowymi rozdzielanymi tabulatorami i mogą być konstruowane lub odczytywane za pomocą dowolnego edytora tekstu lub arkusza kalkulacyjnego. Więcej informacji na temat konstruowania plików metadanych QFA i dokładnej interpretacji danych wyjściowych QFA można znaleźć w dokumentacji pakietu QFA R ⁷ i dokumentacji oprogramowania Colonyzer ³.

Tabela 2. Metody oceny przydatności kulturowej. Podsumowanie cech i wymagań szeregu metod oceny przydatności kultur drobnoustrojów. Recenzja Blomberg ⁸ zawiera bardziej szczegółowe porównanie niektórych z nich. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą postać.

Discussion

QFA jest pod wieloma względami bezpośrednim spadkobiercą trzech uznanych technik mikrobiologicznych stosowanych w skali laboratoryjnej: testów punktowych serii rozcieńczania kultur ⁹, wyznaczania krzywej wzrostu w napowietrzonych kulturach ciekłych ⁹ i replikowania ^{posiewu 13}. Te trzy metody podsumowano i porównano z QFA i innymi technikami wysokoprzepustowymi w tabeli 2. Podczas gdy testy punktowe serii rozcieńczeń definiują przydatność szczepu jako jego zdolność do tworzenia kolonii w serii kultur wyhodowanych z różnych rozcieńczeń inokulum, QFA mierzy dopasowanie szczepu poprzez wielokrotne obserwacje pojedynczej kultury w celu skonstruowania krzywej wzrostu. Kwantyfikacja dopasowania z pojedynczych kultur pozwala na jednoczesne badanie znacznie większej liczby szczepów w identycznych warunkach. Replikacja macierzy kultur umożliwia wielokrotne testowanie kolekcji szczepów, co jest najbardziej przydatne podczas testowania różnic w dopasowaniu kultur w różnych środowiskach lub tłach genetycznych. Przedstawiony tutaj protokół QFA wykorzystuje drogi sprzęt robotyczny do replikacji, inokulacji, inkubacji i obrazowania płytek agarowych, odpowiednich do obserwacji wzrostu tysięcy niezależnych kultur (zrobotyzowany QFA, Tabela 2). Ponieważ jednak QFA opiera się na sprawdzonych, tradycyjnych technikach laboratoryjnych, można je również przeprowadzić znacznie taniej, zastępując wspomaganie robota ręcznymi krokami (ręczna kontrola jakości, tabela 2). Ręczna kontrola jakości polega na replikacji i inokulacji kultur na płytkach agarowych za pomocą ręcznego narzędzia do szpilek oraz ręcznym przenoszeniu płytek do i z inkubatora w celu fotografowania. Ten sam przepływ pracy analizy obliczeniowej można zastosować do generowania krzywych wzrostu na podstawie dowolnego projektu eksperymentalnego.

Szacunki QFA dotyczące sprawności fizycznej wydają się być stosunkowo precyzyjne. Na rysunku 4 przedstawiono średnie dopasowania czterech przykładowych klastrów funkcjonalnie powiązanych delecji genów. Bliskie sąsiedztwo członków każdej funkcjonalnie powiązanej klasy genów w dwóch niezależnych tłach genetycznych (ura3Δ i cdc13-1) wskazuje na odtwarzalność szacunków dopasowania QFA. Na przykład tylko 3 delecje genów (z możliwych 4300) oddzielają trzech członków konserwatywnego kompleksu MRX.

Wysokoprzepustowe alternatywy dla QFA do badania charakterystyki wzrostu szczepów drobnoustrojów obejmują SGA ^5,6, ekrany konkurencji w bibliotekach kodów kreskowych ^11,12 oraz ekrany rejestrujące kinetykę gęstości optycznej w spektrofotometrycznych czytnikach płytek ¹⁰ , które podsumowano w tabeli 2 i opisano bardziej szczegółowo w innym miejscu ⁸. Płytki QFA i SGA, na których kultury rosną na litych powierzchniach agarowych (metody oparte na agarze, tabela 2) mogą być szybko i łatwo obsługiwane przez robota. Stałe kultury powierzchniowe agaru są dobrze napowietrzone podczas wzrostu, a komórki mogą rosnąć w ustalonych kulturach, umożliwiając rozwój towarzyskich drobnoustrojów w społeczności ¹⁴. Pozostawione w stanie nienaruszonym społeczności mikrobiologiczne wpływają na własne mikrośrodowiska, wydzielając toksyny, takie jak etanol, i prawdopodobnie sygnalizację między komórkami. Jednak ciągłe mieszanie płynnych kultur, niezbędne do osiągnięcia odpowiedniego napowietrzenia, sztucznie zakłóca zbiorowiska drobnoustrojów i ich mikrośrodowiska, co może wpływać na ich sposoby wzrostu. Zanieczyszczenie krzyżowe jest mniejszym problemem w przypadku metod z agarem stałym, ponieważ istnieje mniejsza możliwość rozprysków cieczy przenoszących komórki między kulturami. Jeśli zanieczyszczenie wystąpi przez obce drobnoustroje unoszące się w powietrzu w testach agaru stałego, często można je wykryć poprzez oględziny stałych płytek agarowych i uwzględnić lub usunąć.

Przepustowość QFA jest znacznie wyższa niż w przypadku równoległych metod płynnych na dwa sposoby. Po pierwsze, na płytkach QFA (i SGA) zaszczepione kultury są gęściej upakowane razem, co daje więcej niezależnych kultur na płytkę. W QFA znajduje się zazwyczaj 308 kultur, nie licząc nieeksperymentalnych kultur krawędziowych (ryc. 1) w porównaniu z równoległymi kulturami płynnymi z 96 lub 100 kulturami na płytkę. Po drugie, eksperymenty QFA można skalować do znacznie większej liczby płytek. Podczas gdy liczba płytek analizowanych w pojedynczym eksperymencie QFA jest ograniczona jedynie przestrzenią dostępną w inkubatorze lub ciepłym pomieszczeniu, minimalną dopuszczalną częstotliwością przechwytywania obrazu i maksymalną osiągalną częstotliwością przechwytywania, liczba płytek w eksperymencie wzrostu cieczy jest silnie ograniczona pojemnością czytnika płytek (zazwyczaj jedna lub dwie płytki), lub układarki podłączonej do czytnika płytek (zwykle 25-50 płytek). Niedawno przeprowadziliśmy w pełni zautomatyzowany eksperyment QFA na 123 płytkach, z których każda zawierała 308 kultur eksperymentalnych, co dało 37 884 jednoczesnych kultur. Szacujemy, że maksymalna osiągalna liczba niezależnych kultur rosnących w płynie wynosi 96 (kultury/płytkę) x 50 (płytki/układarkę) = 4800, czyli około dziesięciokrotnie mniej niż nasza przepustowość QFA. Alternatywą dla przesiewów do hodowli płynnych jest równoległe wykorzystanie wielu zautomatyzowanych urządzeń do wzrostu (tabela 1 z przeglądu przeprowadzonego przez Blomberga ⁸), z których każde ma pojemność jednej lub dwóch płytek. Kontrola temperatury w każdym urządzeniu jest niezależna, więc warunki nie są identyczne, ale zakładając, że są, ten przepływ pracy wymagałby co najmniej 190 takich urządzeń, aby dopasować się do przepustowości QFA (przy założeniu 200 kultur płynów na urządzenie).

Podsumowując, QFA to wysokiej jakości przepływ pracy, który może być z pożytkiem zastosowany do gromadzenia ilościowych fenotypów wzrostu zarówno w eksperymentach skoncentrowanych na małej skali, jak i w wysokoprzepustowych badaniach przesiewowych. Jest na tyle elastyczny, że można go skutecznie stosować przy różnych wymaganiach dotyczących sprzętu robotycznego. Komponent obliczeniowy przepływu pracy QFA opiera się na ogólnodostępnym kodzie open source.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Replika Plater	Sigma	R-2508	96-pinowy ręczny pintool z kołkami o średnicy 1/8 "
Mix Mate	Eppendorf	5353 000.014
Biomek FX	Beckman	A31842
Teleshake	Thermo Scientific	50095890	zainstalowany na Biomek FX
BM3-SC	S& P Robotics Inc	BM3-SC	192 obrotowa karuzela półkowa
spImager	S& P Robotics Inc	spImager	Ręczne obrazowanie w wysokiej rozdzielczości
spImager z Cytomat	S& P Robotics Inc	Niestandardowe	automatyczne obrazowanie w wysokiej rozdzielczości z kontrolowaną temperaturą
Cytomat 6001 z wymiennikiem ciepła	Thermo Scientific	51022222	Dołączony do spImager
Ecoline RE207	Lauda	RE207	Dołączony do Cytomat
spImager z karuzelą	S& P Robotics Inc	Niestandardowe	zautomatyzowane obrazowanie w wysokiej rozdzielczości
Robot do mocowania pinów do FP12pins	V& P Scientific	AFIX96FP12	Nie dotyczy
96 x piny FP12	V& P Scientific	FP12	50,4 mm długości, 17 mm odsłonięta długość pinu
Stacja dokująca do narzędzia do kołków	V& P Scientific	VP425	Usunięta podstawa stacji dokującej, aby umożliwić suszenie szpilek wentylatorem
Szczotka do czyszczenia pinów	V& P Scientific	VP425	N/A
Replika Plater	Sigma	R-2508	Ręczne narzędzie do szpilek
Nunc OmniTray z pokrywką	Nunc	734-0490	N/A
96-dołkowe sterylne płytki polistyrenowe	Greiner BioOne	655161	N/A
96-dołkowe sterylne pokrywki polistyrenowe	Greiner BioOne	656171	N/A
Tabela 3. Specjalne odczynniki i sprzęt.