Artykuł metodologiczny

Przygotowanie czynnika wzrostu limfocytów T ze splenocytów szczurów

DOI:

10.3791/402

⸱

31 października 2007

 , 
1Department of Physiology and Biophysics, University of California, Irvine (UCI)

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Opisujemy przygotowanie czynnika wzrostu limfocytów T używanych do in vitro ekspansji specyficznych dla antygenu linii limfocytów T szczura.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Utrzymanie linii lub klonów komórek T specyficznych dla antygenu w hodowli wymaga rund aktywacji wywołanej antygenem, oddzielonych fazami ekspansji komórek 1,2. Dodanie interleukiny 2 do pożywki hodowlanej podczas fazy ekspansji jest konieczne, aby zapobiec śmierci komórki i wystarczające do utrzymania krótkoterminowych linii komórek T, ale wykazano, że zwiększa polaryzację Th1 3. Zastąpienie interleukiny 2 czynnikiem wzrostu limfocytów T (TCGF), który zawiera mieszaninę cytokin, jest bardziej skuteczne niż interleukina 2 w utrzymaniu długoterminowych linii limfocytów T in vitro 3. Co więcej, TCGF można łatwo przygotować w dużych ilościach w laboratorium i jest znacznie tańszy niż rekombinowana interleukina 2.

Tutaj pokazujemy, jak przygotować TCGF z supernatantów hodowli splenocytów szczurów. Do tej procedury pobieramy śledziony od naiwnych szczurów Lewisa, które zostały poddane eutanazji w celu pobrania grasicy i krwi. Przygotowujemy zawiesiny jednokomórkowe ze śledziony, lizamy czerwone krwinki przez wstrząs osmotyczny i wysiewamy splenocyty w pożywce hodowlanej. Komórki są stymulowane konkanawaliną A, mitogenem, który nieselektywnie aktywuje wszystkie limfocyty T szczura, indukując produkcję cytokin. Supernantant hodowli zbiera się 48 godzin później, a nadmiar konkanawaliny A wiąże się z mannozydem alfa metylu, aby zapobiec aktywacji linii komórek T, do których zostanie dodany TCGF. TCGF jest następnie sterylnie filtrowany, poddawany porcjom i przechowywany w temperaturze -20°C.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Weźmy śledziony szczura Lewisa (najlepsze są szczury o wadze od 160 do 200 g). Dilacetować na lodzie na szalce Petriego zawierającej PBS + antybiotyki (PBS-PS) za pomocą sitka do komórek. Wlej do probówki o pojemności 50 ml. Napełnij PBS-PS.
  2. Wirować przez 10 minut w temperaturze 4°C, aby otoczkować komórki.
  3. Umyj komórki dwukrotnie.
  4. Zawiesić osad w NH4Cl 0,15 M (5 ml na śledzionę). Mieszaj delikatnie i w sposób ciągły pipetą przez 3 minuty na lodzie, aby zlizować erytrocyty. Napełnij probówkę medium.
  5. Wirować przez 10 minut w temperaturze 4°C, aby otoczkować komórki.
  6. Umyj komórki dwukrotnie.
  7. Policz komórki. Śledziona szczura daje 200-250 milionów komórek.
  8. Wysiać komórki w ilości 2 milionów na ml w kompletnym podłożu: 50 ml na 75cm2 kolba.
  9. Pozostaw na 48 godzin do wzrostu w inkubatorze.
  10. Wirować przez 15 minut w temperaturze 4°C, aby rozpylić komórki.
  11. Zebrać supernatant, wyrzucić komórki.
  12. Dodać 15 mg/ml mannozydu metylu do supernatantu. Dokładnie wymieszaj.
  13. Filtr (0,2 mm)
  14. Porcjować i przechowywać w temperaturze -20°C. W razie potrzeby można go przechowywać w temperaturze 4°C przez 10 dni.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Przygotowujemy TCGF ze splenocytów szczurów Lewisa, ponieważ regularnie poddajemy eutanazji naiwne szczury z tego szczepu w celu zebrania surowicy i thymi, aby stymulować linie limfocytów T szczura Lewisa in vitro. Ten TCGF może być stosowany do promowania wzrostu i przeżycia linii komórek T z innych szczepów szczurów. TCGF można również przygotować z innych szczepów szczurów.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
PBS, 1x, sterylnyodczynnikGIBCO, firmy Life Technologies14040-182
Penicylina / Streptomycyna 100xOdczynnikSigma-AldrichP0781Dodaj 5 ml 100x roztworu do 500 ml PBS, aby przygotować PBS-PS
Sitko do komórek, średnica 70 umNarzędzieFisher Scientific08-771-2
Chlorek amonu (NH4Cl)OdczynnikSigma-AldrichA0171Przygotuj 0,15 M roztwór w sterylnej wodzie destylowanej, utrzymuj w niskiej temperaturze
Odczynnik RPMI 1640GIBCO, firmy Life Technologies21870-092
Płodowa surowica bydlęca (FCS, FBS)OdczynnikGIBCO, firmy Life Technologies16140-071Inaktywowana termicznie
penicylina / streptomycyna / L-glutaminaOdczynnikCambrex/BioWhittaker17-718RPSG
Witaminy RPMI, 100xOdczynnikSigma-AldrichR7256
Pirogronian sodu, 100xOdczynnikSigma-AldrichS8636
Aminokwasy endogenne, 100xOdczynnikSigma-Aldrich
Beta-mercapt– odczynnik tanolSigma-AldrichM7522
alfa metylomannozyd OdczynnikSigma-AldrichM6882
Odczynnik Concanavalin ASigma-AldrichM6882
Aby przygotować kompletną pożywkę hodowlaną, dodaj następujące składniki do 500 ml butelki RPMI 1640 i sterylnego filtra: 10% FCS; 1 butelka PSG; 5 ml witamin RPMI; 5 ml pirogronianu sodu; 5 ml aminokwasów endogennych kwasy; 50 uM beta-mercapt– tanol; 2 μg/ml konkanawaliny A.

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Beeton, C., Barbaria, J., Devaux, J., Benoliel, A. -M., Gola, M., Sabatier, J. -M., Bernard, D., Crest, M., Beraud, E. Selective blocking of voltage-gated K+ channels treats experimental autoimmune encephalomyelitis and inhibits T-cell activation. J. Immunol. 166, 936-944 (2001).
  2. Beeton, C., Wulff, H., Barbaria, J., Clot-Faybesse, O., Pennington, M., Bernard, D., Cahalan, M. D., Chandy, K. G., Beraud, E. Selective blockade of T lymphocyte K+ channels ameliorates experimental autoimmune encephalomyelitis, a model for multiple sclerosis. Proc. Natl. Acad. 98, 13942-13947 (2001).
  3. Mor, F., Cohen, I. R. Propagation of Lewis rat encephalitogenic T cell lines: T-cell-growth-factor is superior to recombinant IL-2. J. Neuroimmunol. 123, 76-82 (2002).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

T Cell Growth FactorRat SplenocytesConcanavalin A StimulationCytokine ProductionRed Blood Cell LysisSingle Cell SuspensionSterile FiltrationAlpha Methyl MannosideCell Culture SupernatantT Cell Line Maintenance

Powiązane artykuły