Opisujemy przygotowanie czynnika wzrostu limfocytów T, stosowanego do ekspansji in vitro linii limfocytów T szczura specyficznych dla antygenu.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Przygotowanie czynnika wzrostu limfocytów T ze splenocytów szczura
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Utrzymanie w kulturze linii lub klonów limfocytów T swoistych dla antygenu wymaga cykli aktywacji indukowanej antygenem, przedzielonych fazami ekspansji komórek 1,2. Dodanie interleukiny 2 do pożywki hodowlanej w fazie ekspansji jest niezbędne w celu zapobiegania śmierci komórek i wystarczające do utrzymania krótkoterminowych linii limfocytów T, jednak wykazano, że zwiększa ono polaryzację Th1 3. Zastąpienie interleukiny 2 czynnikiem wzrostu limfocytów T (TCGF), który zawiera mieszaninę cytokin, jest skuteczniejsze niż stosowanie interleukiny 2 w utrzymywaniu długoterminowych linii limfocytów T in vitro 3. Co więcej, TCGF można łatwo przygotować w dużych ilościach w laboratorium i jest on znacznie tańszy niż rekombinowana interleukina 2.
W niniejszym materiale pokazujemy, jak przygotować TCGF z nadsączów kultur splenocytów szczura. W tej procedurze pobieramy śledziony od naiwnych szczurów szczepu Lewis, uśpionych w celu pobrania grasicy i krwi. Przygotowujemy zawiesiny pojedynczych komórek ze śledzion, lizujemy erytrocyt poprzez szok osmotyczny i wysiewamy splenocyty w pożywce hodowlanej. Komórki są stymulowane konkanawalina A, mitogenem, który nieselektywnie aktywuje wszystkie limfocyty T szczura, indukując produkcję cytokin. Nadsącz z hodowli jest zbierany po 48 godzinach, a nadmiar konkanawaliny A jest wiązany z alfa-metylomannozydem, aby zapobiec aktywacji linii komórek T, do których dodawany będzie TCGF. Następnie TCGF jest filtrowany sterylnie, rozdzielany na alikwoty i przechowywany w temperaturze -20°C.
Protokół
- Pobrać śledziony szczurów linii Lewis (najlepiej od szczurów o masie 160-200g). Rozetrzeć na lodzie w szalce Petriego zawierającej PBS + antybiotyki (PBS-PS) przy użyciu sita do komórek. Przenieść do probówki 50 ml. Dopełnić PBS-PS.
- Wirować przez 10 min w temperaturze 4°C, aby otrzymać osad komórkowy.
- Przemyć komórki dwukrotnie.
- Resuspender osad w NH4Cl 0,15 M (5 ml na śledzionę). Mieszać delikatnie i w sposób ciągły pipetą przez 3 min na lodzie w celu lizy erytrocytów. Dopełnić probówkę pożywką.
- Wirować przez 10 min w temperaturze 4°C, aby otrzymać osad komórkowy.
- Przemyć komórki dwukrotnie.
- Policzyć komórki. Śledziona szczura dostarcza 200-250 milionów komórek.
- Zasiać komórki w zagęszczeniu 2 milionów na ml w pełnej pożywce: 50 ml na kolbę 75 cm2.
- Inkubować przez 48 godzin w inkubatorze.
- Wirować przez 15 min w temperaturze 4°C, aby otrzymać osad komórkowy.
- Zebrać nadsącz; komórki odrzucić.
- Dodać do nadsączu α-metylomannozyd w stężeniu 15 mg/ml. Dokładnie wymieszać.
- Przefiltrować (0,2 mm).
- Rozdzielić na aliquoty i przechowywać w temperaturze -20°C. W razie potrzeby można przechowywać w temperaturze 4°C przez 10 dni.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Przygotowujemy TCGF ze splenocytów szczura szczepu Lewis, ponieważ regularnie uśmiercamy naiwne szczury tego szczepu w celu pozyskania surowicy i grasic do stymulacji linii limfocytów T szczura Lewis in vitro. Ten TCGF może być wykorzystywany do promowania wzrostu i przeżywalności linii limfocytów T z innych szczepów szczurów. TCGF można przygotować również z innych szczepów szczurów.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy nie zgłaszają żadnych konfliktów interesów.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze | |
|---|---|---|---|---|
| PBS, 1x, sterylny | Odczynnik | GIBCO, by Life Technologies | 14040-182 | |
| Penicylina / Streptomycyna 100x | Odczynnik | Sigma-Aldrich | P0781 | Dodać 5 ml roztworu 100x do 500 ml PBS w celu przygotowania PBS-PS |
| Sito do komórek, średnica 70 um | Narzędzie | Fisher Scientific | 08-771-2 | |
| Chlorek amonu (NH4Cl) | Odczynnik | Sigma-Aldrich | A0171 | Przygotować roztwór 0.15 M w sterylnej wodzie destylowanej, przechowywać w chłodzie |
| RPMI 1640 | Odczynnik | GIBCO, by Life Technologies | 21870-092 | |
| Płodowa surowica bydlęca (FCS, FBS) | Odczynnik | GIBCO, by Life Technologies | 16140-071 | Inaktywowana termicznie |
| Penicylina / Streptomycyna / L-Glutamina | Odczynnik | Cambrex/BioWhittaker | 17-718R | PSG |
| Witaminy RPMI, 100x | Odczynnik | Sigma-Aldrich | R7256 | |
| Pirowinian sodu, 100x | Odczynnik | Sigma-Aldrich | S8636 | |
| Niezbędne aminokwasy, 100x | Odczynnik | Sigma-Aldrich | ||
| Beta-mercapt–anol | Odczynnik | Sigma-Aldrich | M7522 | |
| alfa-metylomannozyd | Odczynnik | Sigma-Aldrich | M6882 | |
| Konkanawalina A | Odczynnik | Sigma-Aldrich | M6882 | |
| Aby przygotować kompletną pożywkę hodowlaną, do butelki 500 ml RPMI 1640 dodać następujące składniki i przefiltrować sterylnie: 10% FCS; 1 butelkę PSG; 5 ml witamin RPMI; 5 ml pirowinianu sodu; 5 ml niezbędnych aminokwasów; 50 uM beta-mercapt–anolu; 2 ug/ml Konkanawaliny A. |
Bibliografia
- Beeton, C., Barbaria, J., Devaux, J., Benoliel, A. -M., Gola, M., Sabatier, J. -M., Bernard, D., Crest, M., Beraud, E. Selective blocking of voltage-gated K+ channels treats experimental autoimmune encephalomyelitis and inhibits T-cell activation. J. Immunol. 166, 936-944 (2001).
- Beeton, C., Wulff, H., Barbaria, J., Clot-Faybesse, O., Pennington, M., Bernard, D., Cahalan, M. D., Chandy, K. G., Beraud, E. Selective blockade of T lymphocyte K+ channels ameliorates experimental autoimmune encephalomyelitis, a model for multiple sclerosis. Proc. Natl. Acad. 98, 13942-13947 (2001).
- Mor, F., Cohen, I. R. Propagation of Lewis rat encephalitogenic T cell lines: T-cell-growth-factor is superior to recombinant IL-2. J. Neuroimmunol. 123, 76-82 (2002).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
