Dostosowanie morfologii Aspergillus niger poprzez dodanie mikrocząsteczek talku

Podsumowanie

Opisano metodę precyzyjnego generowania i kompleksowej charakterystyki morfologicznej grzyba nitkowatego Aspergillus niger, która pozwala na matematyczną korelację wyglądu morfologicznego z produktywnością.

Streszczenie

Niciakowaty grzyb A. niger jest szczepem szeroko stosowanym w szerokim zakresie procesów przemysłowych, od przemysłu spożywczego po farmaceutyczny. Jedną z najbardziej intrygujących i często niekontrolowalnych cech tego organizmu nitkowatego jest jego złożona morfologia. Przybiera ona formy od gęstych sferycznych granulek po lepkie grzybnie (Rysunek 1). Znane jest, że różne parametry procesu i składniki wpływają na morfologię grzyba ¹. Ponieważ optymalna wydajność jest silnie skorelowana z konkretną formą morfologiczną, morfologia grzyba często stanowi wąskie gardło wydajności w produkcji przemysłowej.

Prostym i eleganckim sposobem na precyzyjną kontrolę kształtu morfologicznego jest dodanie do pożywki nieorganicznych nierozpuszczalnych mikrocząsteczek (takich jak wodny krzemian magnezu, tlenek glinu lub tlenek krzemianu tytanu), co przyczynia się do zwiększenia produkcji enzymów ^2-6. Ponieważ istnieje wyraźna korelacja między morfologią zależną od mikrocząsteczek a produkcją enzymów, pożądanym jest matematyczne powiązanie produktywności z wyglądem morfologicznym. Z tego względu celem jest opracowanie ilościowego, precyzyjnego i holistycznego opisu morfologicznego.

W związku z tym przedstawiamy metodę generowania i charakteryzacji struktur morfologicznych zależnych od mikrocząsteczek oraz korelacji morfologii grzybów z wydajnością (Rysunek 1), co może przyczynić się do lepszego zrozumienia morfogenezy mikroorganizmów nitkowatych.

Rekombinowany szczep A. niger SKAn1015 jest hodowany przez 72 h w 3 L bioreaktorze z mieszadłem. Poprzez dodanie mikrocząstek talku w stężeniach 1 g/L, 3 g/L oraz 10 g/L przed inokulacją, w sposób powtarzalny generowane są różnorodne struktury morfologiczne. Próbki sterylne pobierane są po 24, 48 i 72 godzinach w celu oznaczenia postępu wzrostu oraz aktywności produkowanego enzymu. Produktem jest wysokowartościowy enzym β-fruktofuranozydaza, ważny biokatalizator w syntezie nowych cukrów w przemyśle spożywczym lub farmaceutycznym, który katalizuje między innymi reakcję sacharozy do glukozy ^7-9. Zatem oznaczenie ilości glukozy po dodaniu sacharozy pozwala określić ilość wyprodukowanej β-fruktofuranozydazy. Ilościowe oznaczenie glukozy wykonuje się za pomocą testu GOD/POD ¹⁰, który został zmodyfikowany pod kątem analiz wysokoprzepustowych w 96-dołkowych płytkach mikrotitracyjnych.

Morfologię grzybów po 72 godzinach badano pod mikroskopem i scharakteryzowano za pomocą cyfrowej analizy obrazu. W tym celu, przy użyciu programu do przetwarzania obrazów o otwartym kodzie źródłowym ImageJ, obliczono wskaźniki kształtu cząstek dla makromorfologii grzybów, takie jak średnica Fereta, powierzchnia rzutu, obwód, kolistość, współczynnik kształtu, zaokrąglenie oraz zwartość. Odpowiednie parametry połączono w bezwymiarową liczbę morfologiczną (Mn) ¹¹, która umożliwia kompleksową charakterystykę morfologii grzybów. Bliską korelację między liczbą morfologiczną a produktywnością wykazano za pomocą regresji matematycznej.

Protokół

1. Konfiguracja reaktora i rozpoczęcie hodowli

Przeprowadzono łącznie 4 hodowle w bioreaktorach.

1. Do hodowli A. niger SKAn1015 należy użyć bioreaktora z mieszadłem o pojemności 3 L i objętości roboczej 2,2 L.
2. Do reaktora należy wsypać 72,6 g monohydratu glukozy i uzupełnić go 1,9 L wody dejonizowanej.
3. Należy zainstalować wyposażenie reaktora, takie jak 3 przegrody, dwa sześciołopatkowe mieszadła turbinowe, elektrodę pH, wlot gazu z filtrem powietrza, palec chłodzący, chłodnicę powietrza wylotowego z filtrem powietrza, rurkę zanurzeniową do sterylnego pobierania próbek z filtrem powietrza oraz węże wlotowe dla pożywki, inokulum, kwasu i zasady.
4. Reaktor należy autoklawować w temperaturze 121 °C przez 20 min.
5. Należy połączyć reaktor z zasobnikami kwasu i zasady (2 M HCl, 2 M NaOH) oraz odpowiednimi pompami i ustawić wartość pH na 5,0 ± 0,05 za pomocą jednostki sterowania pH.
6. Należy połączyć reaktor z systemem wody chłodzącej i założyć płaszcz grzejny wokół naczynia reaktora.
7. Należy zainstalować czujnik temperatury z odpowiednią jednostką sterującą i ustawić temperaturę 37 ± 0,1 °C na sterowniku temperatury.
8. Na górze reaktora należy zamontować silnik mieszadła i uruchomić go z prędkością mieszania 200 min^-1.
9. Przez jeden z jałowych węży wlotowych należy dodać sterylną minimalną pożywkę wzrostową¹¹ (250 mL). Do przygotowania pożywki wszystkie składniki zostały autoklawowane w 121 °C przez 20 min, a następnie zmieszane. W przypadku trzech hodowli składniki obejmowały proszek talkowy (3MgO•4SiO₂•H₂O) w stężeniach 1 g/L (reaktor 2), 3 g/L (reaktor 3) i 10 g/L (reaktor 4). Przed użyciem mikrocząsteczki należy resuspendować w 50 mM buforze octanu sodu (pH 6,5) i dodać do sterylnej pożywki. W kulturach kontrolnych (bez cząsteczek) zawiesinę mikrocząsteczek należy zastąpić 50 mM buforem octanu sodu (pH 6,5).
10. Przez jeden z jałowych węży wlotowych należy dodać zawiesinę zarodników (inokulum) przygotowaną zgodnie z metodą Wucherpfennig et. al (2011)¹¹ (50 mL), tak aby stężenie zarodników wynosiło 1X10⁶ mL^-1. Inokulacja wyznacza moment rozpoczęcia hodowli (h = 0 h).
11. Należy rozpocząć napowietrzanie z przepływem 1,0 L min^-1.

2. Sterylne pobieranie próbek po 24, 48 i 72 h hodowli

1. Przenieś 50 mL sterylnej pożywki hodowlanej do probówki typu flacon.
2. Wykorzystaj próbkę do oznaczenia suchej masy biomasy, aktywności β-fruktofuranozydazy oraz analizy mikroskopowej.

3. Oznaczenie suchej masy biomasy po 24, 48 i 72 h hodowli

1. Próbki biomasy należy pobierać co najmniej w dubletach.
2. Zważyć filtr celulozowy za pomocą mikro wagi po wysuszeniu w eksyكاتهorze, a następnie umieścić filtr w lejku Büchnera podłączonym do pompy próżniowej z pompką wodną.
3. Przefiltrować określoną objętość próbki (np. 10 mL) i przepłukać filtr 10 mL wody dejonizowanej, aby usunąć związki pożywki z biomasy.
4. Złożyć filtr raz na pół, umieścić go w szklanej szalce Petriego i włożyć do suszarki komorowej do osiągnięcia stałej masy (co najmniej 24 h).
5. Ostudzić filtr w eksykatorze i zmierzyć jego masę.
6. Obliczyć suchą masę biomasy jako różnicę między masą filtra z wysuszoną biomasą a masą filtra bez niej, podzieloną przez użytą objętość próbki.

4. Oznaczanie zewnątrzkomórkowej aktywności enzymatycznej β-fruktofuranozydazy za pomocą testu GOD/POD po 24, 48 i 72 h hodowli

Próbki należy stale przechowywać w lodzie podczas pracy z nimi.

1. Przefiltruj 1,5 mL zawiesiny hodowlanej przez filtr z octanu celulozy, przeciskając zawiesinę strzykawką przez filtr do probówki reakcyjnej. Przechowuj probówkę reakcyjną w temperaturze -20 °C do momentu użycia.
2. Do przygotowania mieszaniny reakcyjnej użyj 20 μL próbki i dodaj 200 μL 1,65 M sacharozy rozpuszczonej w 0,05 M buforze fosforanowym (pH 5,4), aby zainicjować reakcję rozkładu sacharozy do glukozy. Przeprowadź reakcję co najmniej w dwóch powtórzeniach.
3. Inkubuj mieszaninę reakcyjną w temperaturze 40 °C przez 20 min w bloku grzejnym. Zatrzymaj reakcję poprzez inkubację w temperaturze 95 °C przez 10 min w bloku grzejnym. Schłodź mieszaninę reakcyjną, przechowując ją na lodzie, a następnie odwiruj skroploną wodę w wirówce przy 13 000 g przez 10 min w temperaturze 4 °C.
4. Aby uwzględnić zależny od pH i temperatury rozkład sacharozy do glukozy, wyznacz wartość tła (próbę blank), stosując 20 μL wody dejonizowanej zamiast 20 μL próbki.
5. Aby uwzględnić pozostałą glukozę w pożywce hodowlanej, przeprowadź kontrolę negatywną dla każdej próbki. W tym celu użyj 20 μL próbki i dezaktywuj β-fruktofuranozydazę przez ogrzewanie w temperaturze 95 °C przez 10 min przed dodaniem sacharozy, a następnie inkubuj zgodnie z opisem w kroku 4.3.
6. Rozcieńcz próbki w taki sposób, aby zmierzona absorbancja mieściła się w zakresie kalibracji.
7. Wszystkie testy enzymatyczne przeprowadź w trzech powtórzeniach. Nałóż 2 μL rozcieńczonej próbki do dołka płytki mikrotitracyjnej. W celu kalibracji nałóż na płytkę mikrotitracyjną szereg wzorców, używając po 2 μL dziesięciu roztworów glukozy o dziesięciu różnych znanych stężeniach (od 1 mM do 15 mM) zamiast 2 μL próbki. Do kalibracji punktu zerowego użyj 2 μL wody dejonizowanej zamiast 2 μL próbki.
8. Dodaj 200 μL roztworu odczynnika do każdego dołka za pomocą pipety wielokanałowej.
9. Inkubuj mieszaninę przez 10 min w temperaturze pokojowej.
10. Przechowuj płytkę mikrotitracyjną w temperaturze 6 °C do momentu pomiaru (maksymalnie przez kilka godzin).
11. Zmierz absorbancję przy 450 nm, korzystając z czytnika mikropłytek Sunrise 96-dołkowego oraz oprogramowania do analizy danych Magellan. Ustaw czas mieszania na 5 s oraz czas przerwy na 1 s.
12. Otwórz tabelę wyników w arkuszu kalkulacyjnym i wyznacz linię kalibracyjną na podstawie szeregu wzorców:
    stężenie glukozy = a X absorbancja + b
    
13. Oblicz aktywność:
    aktywność = (absorbancja X czynnik rozcieńczenia - wartość tła) X a + b
    
14. Wyznacz aktywność β-fruktofuranozydazy, obliczając różnicę między aktywnościami próbki a odpowiednią kontrolą negatywną.
15. Oblicz produktywność właściwą do dalszego wykorzystania, biorąc pod uwagę suchą masę biomasy oraz aktywność β-fruktofuranozydazy ¹¹.

5. Mikroskopia i zautomatyzowana analiza obrazu po 72 h hodowli

1. Nalej około 3 mL zawiesiny hodowlanej do plastikowej szalki Petriego i rozcieńcz ją fizjologicznym roztworem chlorku sodu, aż struktury morfologiczne zostaną oddzielone.
2. Umieść szalkę Petriego pod mikroskopem wyposażonym w zintegrowaną lub podłączoną kamerę. Wykonaj i zapisz około 100 zdjęć (Rysunek 2) struktur morfologicznych dla każdej próbki. Dopilnuj, aby na każdym zdjęciu co najmniej jeden obiekt był widoczny w całości.
3. Otwórz wszystkie zdjęcia z tej samej próbki w programie do przetwarzania obrazów ImageJ¹². Konwertuj obrazy na czarno-białe za pomocą narzędzia procesowego „Make Binary” (Rysunek 2). Aby zastosować to polecenie do całej serii zdjęć, użyj następującego kodu makra:
   run(,,Make Binary")
   
4. Ponownie otwórz przetworzone obrazy binarne w programie ImageJ. Oblicz wskaźniki kształtu: średnicę Fereta, powierzchnię rzutu, obwód, kołowość, współczynnik kształtu (aspect ratio), zaokrąglenie oraz zwartość (solidity) dla każdego obrazu za pomocą narzędzia analizy „Set Measurement”. Aby zastosować to polecenie do serii obrazów, użyj następującego kodu makra:
   run("8-bit");
   run("Make Binary");
   run("Set Scale...", "distance=X known=1000 pixel=1 unit=μm global");
   run("Set Measurements...", "area perimeter shape feret's limit display redirect=None decimal=3");
   run("Analyze Particles...", "size=10000-Infinity circularity=0.00-1.00 show=Outlines display");
   Wyznacz wartość X jako liczbę pikseli odpowiadającą 1000 μm, rysując linię prostą wzdłuż paska skali. Powiąż liczbę pikseli linii prostej z długością paska skali w μm.
5. Otwórz tabelę wyników zawierającą wartości wskaźników kształtu dla każdego obrazu w arkuszu kalkulacyjnym. Oblicz liczbę morfologiczną (Morphology number) dla każdego obrazu zgodnie z poniższym wzorem:
   
6. Oblicz wartość średnią i odchylenie standardowe dla liczby morfologicznej, uwzględniając wszystkie zdjęcia z jednej próbki.
7. Użyj programu do tworzenia wykresów i analizy danych w celu graficznej korelacji liczby morfologicznej z wydajnością specyficzną i określ zależność matematyczną za pomocą regresji matematycznej.

6. Reprezentatywne wyniki

Poprzez dodatek mikrocząsteczek talku morfologia A. niger SKAn 1015 zmienia się z właściwej morfologii granulkowatej na morfologię rozproszoną lub nawet grzybniową. Podczas gdy w warunkach standardowych występuje morfologia granulkowata, suplementacja pożywki mikrocząsteczkami talku w stężeniu 10 g/L prowadzi do powstania morfologii grzybniowej (Rycina 4.). Jednocześnie aktywność β-fruktofuranozydazy wzrasta około 3-krotnie ^3-5. Suplementacja proszkiem talkowym w stężeniu 1 lub 3 g/L prowadzi do powstania morfologii rozproszonej przy dwukrotnym wzroście aktywności fruktofuranozydazy (Rycina 4.).

Morfologię zależną od mikrocząstek można kompleksowo opisać za pomocą wskaźnika morfologii (Morphology number), który można obliczyć, wykorzystując parametry określone podczas automatycznej analizy obrazu. Idealnie okrągłe i gładkie granulki będą w obrazach mikroskopowych widoczne jako idealne okręgi. Dla takich cząstek wskaźnik morfologii przyjmuje wartość 1. Najmniejszy fragment morfologii grzybni można uprościć do postaci linii jednowymiarowej, co daje wskaźnik morfologii równy 0. Wszystkie pośrednie formy morfologiczne, takie jak wydłużone, nieregularne granulki lub grudki, będą zatem miały wartości między 0 a 1. Dość duże cząstki będą skutkować wysokim, natomiast cząstki grzybowe o dużej powierzchni lub cząstki wydłużone dość niskim wskaźnikiem morfologii ¹¹.

W warunkach standardowych morfologia w reaktorze 1 wykazuje liczbę morfologii (Morphology number) wynoszącą około 0,8. Morfologia w reaktorze 4 z dodatkiem 10 g/L proszku talkowego charakteryzuje się Mn wynoszącą około 0,1. Liczba morfologii dla reaktorów 2 i 3, przy stężeniach proszku talkowego wynoszących odpowiednio 1 i 3 g/L, mieści się pomiędzy tymi wartościami ekstremalnymi, co wskazuje na morfologię rozproszoną. Ponieważ morfologia zależna od mikrocząsteczek jest ściśle powiązana z wydajnością β-fruktofuranozydazy, uzyskano korelację matematyczną między liczbą morfologii a wydajnością, analogiczną do przedstawionej na Ryc. 5.

Rysunek 1. Ogólny schemat projektu eksperymentalnego i procedury analitycznej. A. niger jest hodowany (z mikrocząsteczkami lub bez nich) w bioreaktorze z mieszadłem o pojemności 3 L przez 72 h. Po 24, 48 i 72 h pobierana jest próbka do oznaczenia masy suchej biomasy oraz aktywności β-fruktofuranozydazy, które następnie służą do obliczenia wydajności specyficznej. Po 48 h morfologia grzyba jest badana pod mikroskopem i charakteryzowana za pomocą cyfrowej analizy obrazu. Istotne parametry analizy obrazu są łączone w liczbę morfologiczną (Morphology number), która jest matematycznie skorelowana z wydajnością specyficzną.

Rysunek 2. Etapy przetwarzania obrazów mikroskopowych struktur morfologicznych A. niger. Krok 1: akwizycja obrazu za pomocą mikroskopu. Krok 2: ulepszanie obrazu, jeśli jest to konieczne. Krok 3: binaryzacja obrazu, generowanie obrazu czarno-białego (binarnego) w programie ImageJ. Krok 4: przetwarzanie obrazu binarnego i usuwanie niepożądanych obiektów. Krok 5: analiza morfologiczna przeprowadzana za pomocą funkcji „Analyze particles” w programie open source ImageJ.

Rycina 3. Różne formy morfologiczne A. niger w zależności od stężenia dodanych mikrocząsteczek. Wraz ze wzrostem stężenia dodanych mikrocząsteczek wielkość granulek może być precyzyjnie redukowana do małych granulek typu rdzeń-otoczka, małych kłaczków, a nawet swobodnie rozproszonej grzybni. Inżynieria morfologiczna Aspergillus niger SKAn1015 poprzez suplementację mikrocząsteczkami w kulturze zanurzonej. Bez mikrocząsteczek (A), 10 mg/L (B), 0.1 g/L (C), 0.2 g/L (D), 0.3 g/L (E), 0.6 g/L (F), 1.0 g/L (G), 1.5 g/L (H), 2.0 g/L (I), 2.5 g/L (J), 3.0 g/L (K), 3.5 g/L (L), 4.0 g/L (M), 4.5 g/L (N), 5.0 g/L (O), 10 g/L (P), 15 g/L (Q), 20 g/L (R), 30 g/L (S) oraz 40-50 g/L (T). Obrazy wykonano za pomocą mikroskopii świetlnej po 72 h inkubacji.

Rycina 4. Aktywność fruktofuranosydazy w zależności od stężenia mikrocząsteczek talku 1 g/L (reaktor 2), 3 g/L (reaktor 3) i 10 g/L (reaktor 4). Reaktor 1 nie został wzbogacony o mikrocząsteczki; w tym przypadku hodowla prowadzona jest w warunkach standardowych.

Rycina 5. Reprezentatywna dobra korelacja (R² = 0,91) między liczbą morfologiczną a wydajnością specyficzną. Liczbę morfologiczną naniesiono na oś odciętych (abscysę), a wydajność specyficzną na oś rzędnych (ordynatę). Regresja nieliniowa wykazała korelację wykładniczą.

Dyskusja

Modyfikacja morfologii grzybów jest przedmiotem zainteresowania biotechnologii od wielu dziesięcioleci. W różnych badaniach próbowano zmieniać wybrane parametry procesu, takie jak wartość pH, doprowadzenie energii, temperaturę, składniki odżywcze pożywki lub stężenie inokulum ¹, jednak działania te obarczone są dość niedokładną i niepełną kontrolą morfologii, wysokimi kosztami energetycznymi, efektami inhibicji lub niestabilnością produktu. W przeciwieństwie do tego, suplementacja mikrocząsteczek pozwala na precyzyjne kształtowanie morfologii grzybów poprzez dokładną regulację wielkości i stężenia cząsteczek. Otwiera to nowe możliwości wykorzystania mikrocząsteczek do optymalizacji i projektowania dedykowanej, wysokowydajnej morfologii w produkcji biotechnologicznej z wykorzystaniem A. niger oraz innych mikroorganizmów nitkowatych.

Cyfrowa analiza obrazu jest łatwą i powtarzalną metodą charakteryzacji makromorfologii grzybów. Jednakże różnorodność parametrów dotyczących rozmiaru, kształtu i charakterystyki powierzchni struktur morfologicznych opisanych w literaturze sprawia, że szybka ocena morfologii grzybów jest skomplikowana. Przedstawiona liczba morfologiczna, będąca kombinacją istotnych parametrów, eliminuje ten brak i może być wykorzystywana nie tylko do kompleksowej charakteryzacji struktur morfologicznych, ale również do bezpośredniej korelacji matematycznej z wydajnością. Umożliwia to ponownie szacowanie wydajności na podstawie danej morfologii, a w konsekwencji dostosowanie morfologii do potrzeb procesu.

Wykorzystując liczbę morfologii (Morphology number), możliwe jest rozróżnienie pomiędzy różnymi morfologiami pelletów i aglomeratów ^4,5. W celu dalszego rozwoju liczby morfologii obiecujące wydaje się uwzględnienie wymiaru fraktalnego. Wymiar fraktalny pozwala na pomiar złożoności i właściwości wypełniania masy obiektu ¹³, a zatem jest predestynowany do holistycznej charakterystyki morfologii grzybni.

Tworzenie morfologii grzybni o wysokiej wydajności może jednak prowadzić do problemów z efektywnością procesu, szczególnie w uprawie na dużą skalę, ponieważ wcześniej wykazano, że taka forma wzrostu grzybni wiąże się z znacznie większą lepkością cieczy fermentacyjnej ². Prowadzi to do problemów z przekazywaniem ciepła i masy oraz do powstawania zastygłych stref niemieszanych, co wymaga większego nakładu energii i zwiększa koszty prowadzenia uprawy¹. W związku z tym podczas zmiany morfologii należy uwzględnić zależność między morfologią grzyba a lepkością cieczy fermentacyjnej i włączyć ją do dalszych modeli.