Dostosowanie morfologii Aspergillus niger poprzez dodanie mikrocząstek talku

Podsumowanie

Opisano metodę precyzyjnego generowania i kompleksowego charakteryzowania morfologii grzyba nitkowatego Aspergillus niger, która pozwala na matematyczną korelację wyglądu morfologicznego i produktywności.

Streszczenie

Nitkowaty grzyb A. niger jest szeroko stosowanym szczepem w szerokim zakresie procesów przemysłowych, od przemysłu spożywczego po farmaceutyczny. Jedną z najbardziej intrygujących i często niekontrolowanych cech tego nitkowatego organizmu jest jego złożona morfologia. Waha się od gęstych kulistych granulek do lepkiej grzybni (Ryc. 1). Wiadomo, że różne parametry procesu i składniki wpływają na morfologię grzybów ¹. Ponieważ optymalna produktywność jest silnie skorelowana z określoną formą morfologiczną, morfologia grzybów często stanowi wąskie gardło produktywności w produkcji przemysłowej.

Prostym i eleganckim podejściem do precyzyjnej kontroli kształtu morfologicznego jest dodanie do pożywki nieorganicznych, nierozpuszczalnych mikrocząsteczek (takich jak uwodniony krzemian magnezu, tlenek glinu lub tlenek krzemianu tytanu) przyczyniające się do zwiększenia produkcji enzymów ^2-6. Ponieważ istnieje oczywista korelacja między morfologią zależną od mikrocząstek a produkcją enzymów, pożądane jest matematyczne powiązanie produktywności z wyglądem morfologicznym. W związku z tym dąży się do ilościowego, precyzyjnego i całościowego opisu morfologicznego.

Dlatego prezentujemy metodę generowania i charakteryzowania struktur morfologicznych zależnych od mikrocząstek oraz korelowania morfologii grzybów z produktywnością (Rysunek 1), co może przyczynić się do lepszego zrozumienia morfogenezy mikroorganizmów nitkowatych.

Rekombinowany szczep A. niger SKAn1015 jest uprawiany przez 72 godziny w 3-litrowym bioreaktorze z mieszadłem. Poprzez dodanie mikrocząsteczek talku w stężeniach 1 g/l, 3 g/l i 10 g/l przed inokulacją uzyskuje się w powtarzalny sposób różnorodne struktury morfologiczne. Sterylne próbki pobiera się po 24, 48 i 72 godzinach w celu określenia postępu wzrostu i aktywności wytworzonego enzymu. Powstającym produktem jest wysokowartościowy enzym β-fruktofuranozydaza, ważny biokatalizator do powstawania neocukrów w przemyśle spożywczym czy farmaceutycznym, który katalizuje m.in. reakcję sacharozy z glukozą ^7-9. Dlatego oznaczanie ilościowe glukozy po dodaniu sacharozy implikuje ilość wytwarzanej β-fruktofuranozydazy. Kwantyfikacja glukozy odbywa się za pomocą testu GOD/POD-Assay ¹⁰, który jest modyfikowany do analizy wysokoprzepustowej na 96-dołkowych mikropłytkach mianowych.

Morfologia grzybów po 72 godzinach jest badana pod mikroskopem i charakteryzowana za pomocą cyfrowej analizy obrazu. W ten sposób za pomocą programu do przetwarzania obrazów ImageJ o otwartym kodzie źródłowym obliczane są współczynniki kształtu cząstek dla makromorfologii grzybów, takie jak średnica Fereta, obszar rzutowany, obwód, okrągłość, okrągłość i solidność. Odpowiednie parametry są łączone w bezwymiarową liczbę morfologiczną (Mn) ¹¹, co umożliwia kompleksową charakterystykę morfologii grzybów. Ścisła korelacja liczby morfologicznej i produktywności jest podkreślona przez regresję matematyczną.

Protokół

1. Konfiguracja reaktora i rozpoczęcie uprawy

4 uprawy w bioreaktorach są prowadzone ogółem.

1. Do uprawy A. niger SKAn1015 należy użyć bioreaktora zbiornikowego o pojemności 3 l z mieszadłem i objętością roboczą 2,2 l.
2. Wlej 72,6 g monohydratu glukozy do reaktora i napełnij go 1,9 l wody dejonizowanej.
3. Zainstaluj wyposażenie reaktora, takie jak 3 przegrody, dwa sześciołopatkowe wirniki turbiny dyskowej, elektroda pH, wlot gazu z filtrem powietrza, palec chłodzący, chłodnica powietrza wylotowego z filtrem powietrza, rurka zanurzeniowa do sterylnego pobierania próbek z filtrem powietrza i węże doprowadzające do pożywki, inokulum, kwasu i zasady.
4. Autoklawować reaktor w temperaturze 121 °C przez 20 minut.
5. Połączyć reaktor ze zbiornikiem kwasowo-zasadowym (2 M HCl, 2 M NaOH) i odpowiednimi pompami i ustawić wartość pH 5,0 ± 0,05 za pomocą jednostki sterującej pH.
6. Połącz reaktor z układem wody chłodzącej i umieść płaszcz grzewczy wokół zbiornika reaktora.
7. Zamontuj czujnik temperatury z odpowiednią jednostką sterującą i ustaw temperaturę 37 ± 0.1 °C na jednostce sterującej temperaturą.
8. Zamontuj silnik mieszający na górze reaktora i uruchom go z prędkością mieszania 200 ^min-1.
9. Dodać sterylną minimalną pożywkę^{wzrostową 11} przez jeden ze sterylnych węży doprowadzających (250 ml). W celu przygotowania podłoża wszystkie składniki poddano sterylizacji w autoklawie w temperaturze 121 °C przez 20 minut i zmieszano ze sobą. W przypadku trzech upraw składniki obejmują talk w proszku (3MgO•4SiO₂•_H2O) w stężeniach 1 g/L (reaktor 2), 3 g/L (reaktor 3) i 10 g/L (reaktor 4). Przed użyciem ponownie zawiesić mikrocząstki w buforze octanu sodu o pojemności 50 mM (pH 6,5) i dodać go do sterylnego podłoża. W kulturach kontrolnych (bez cząstek) zawiesinę mikrocząstek zastąpić 50 mM buforem octanu sodu (pH 6,5).
10. Zawiesinę zarodników (inokulum) przygotowaną w Wucherpfennig i in. (2011)¹¹ dodać przez jeden ze sterylnych węży doprowadzających (50 ml) tak, aby stężenie zarodników wynosiło 1X10^{6 mL-1}. Inokulacja oznacza początek uprawy (h = 0 h).
11. Rozpocznij napowietrzanie od szybkości 1,0 l ^min-1.

2. Sterylne pobieranie próbek po 24, 48 i 72 godzinach uprawy

1. Weź 50 ml sterylnego bulionu hodowlanego do probówki flakonowej.
2. Użyć próbki do oznaczenia suchej masy biomasy, aktywności β-fruktofuranozydazy i analizy mikroskopowej.

3. Oznaczanie suchej masy biomasy po 24, 48 i 72 godzinach uprawy

1. Próbki biomasy pobiera się co najmniej dwukrotnie.
2. Po wysuszeniu w eksykatorze zważyć filtr celulozowy za pomocą mikrowagi i umieścić filtr w lejku Büchnera z podłączoną pompą próżniową strumienia wody.
3. Przefiltrować określoną objętość próbki (np. 10 ml) i przepłukać filtr 10 ml wody dejonizowanej w celu usunięcia związków pożywki z biomasy.
4. Zmarszcz filtr raz na środku, umieść go na szklanej szalce Petriego i włóż do suszarki komorowej do niezmienności wagi (co najmniej 24 godziny).
5. Schłodzić filtr w eksykatorze i zmierzyć wagę.
6. Obliczyć suchą masę biomasy jako różnicę między masą filtra z wysuszoną biomasą i bez niej podzieloną przez objętość użytej próbki.

4. Oznaczanie zewnątrzkomórkowej aktywności enzymatycznej β-fruktofuranozydazy przez GOD/POD-essay po 24, 48 i 72 h uprawy

Przechowuj próbki na lodzie przez cały czas podczas pracy z nimi.

1. Przefiltrować 1,5 ml zawiesiny hodowli przez filtr z octanu celulozy, wciskając zawiesinę hodowli strzykawką przez filtr do probówki reakcyjnej. Przechowywać probówkę reakcyjną w temperaturze -20 °C do momentu użycia.
2. Do mieszaniny reakcyjnej należy użyć próbki o objętości 20 μl i dodać 200 μl 1,65 M sacharozy rozpuszczonej w 0,05 M buforze fosforanowym (pH 5,4), aby zainicjować reakcję od sacharozy do glukozy. Przeprowadź reakcję co najmniej w dwóch egzemplarzach.
3. Mieszaninę reakcyjną inkubować w temperaturze 40 °C przez 20 minut w bloku grzewczym. Zatrzymać reakcję przez inkubację w temperaturze 95 °C przez 10 minut w bloku grzewczym. Schłodzić mieszaninę reakcyjną, przechowując ją na lodzie, a następnie odwirować skondensowaną wodę za pomocą wirówki o stężeniu 13 000 g przez 10 minut w temperaturze 4 °C.
4. Aby uwzględnić zależny od pH i temperatury rozkład sacharozy do glukozy, należy przeprowadzić ślepą próbę, używając 20 μl wody dejonizowanej zamiast 20 μl próbki.
5. Aby uwzględnić resztki glukozy w bulionie hodowlanym, należy przeprowadzić kontrolę ujemną dla każdej próbki. W tym celu należy użyć 20 μl próbki i dezaktywować β-fruktofuranozydazę przez ogrzewanie w temperaturze 95 °C przez 10 minut przed dodaniem sacharozy i inkubować zgodnie z opisem w kroku 4.3.
6. Rozcieńczyć próbki w taki sposób, aby następująca po niej zmierzona adsorpcja mieściła się w skalibrowanym zakresie wartości.
7. Przeprowadzić wszystkie testy enzymatyczne w trzech egzemplarzach. Nałożyć 2 μl rozcieńczonej próbki do dołka z mikromiareczkowaniem. Zastosować standardowy zakres do kalibracji na mikropłytce miareczkowej, używając 2 μl dziesięciu roztworów glukozy o dziesięciu różnych znanych stężeniach (od 1 mM do 15 mM) zamiast 2 μl próbki. Do kalibracji punktu zerowego należy użyć 2 μl wody dejonizowanej zamiast 2 μl próbki.
8. Dodaj 200 μl roztworu odczynnika do każdej studzienki za pomocą pipety wielofunkcyjnej.
9. Inkubować mieszaninę przez 10 minut w temperaturze pokojowej.
10. Przechowywać mikropłytkę miareczkową w temperaturze 6 °C do czasu pomiaru (najwyżej kilka godzin).
11. Zmierz absorpcję przy 450 nm za pomocą 96-dołkowego czytnika mikropłytek Sunrise i oprogramowania do wyszukiwania danych Magellan. Ustaw czas mieszania do 5 sek., a czas odpoczynku do 1 sek.
12. Otwórz wykres wyników za pomocą arkusza kalkulacyjnego i skonstruuj linię kalibracji, używając standardowego zakresu:
    stężenie glukozy = a X absorpcja + b
    
13. Oblicz aktywność:
    aktywność = (absorpcja X współczynnik rozcieńczenia-wartość ślepej próby ) X a+b
    
14. Oblicz aktywność β-fruktofuranozydazy, obliczając różnicę między aktywnością próbki a odpowiednią kontrolą ujemną.
15. Obliczyć wydajność właściwą dla następnego zastosowania, biorąc pod uwagę biomasę, suchą masę i aktywność β-fruktofuranozydazy ¹¹.

5. Mikroskopia i automatyczna analiza obrazu po 72 godzinach uprawy

1. Umieścić około 3 ml zawiesiny hodowli na plastikowej szalce Petriego i rozcieńczyć je fizjologicznym roztworem chlorku sodu, aż struktury morfologiczne zostaną oddzielone.
2. Umieść szalkę Petriego pod mikroskopem, który jest wyposażony w zintegrowaną lub podłączoną kamerę. Pozyskaj i zapisz około 100 obrazów (ryc. 2) struktur morfologicznych na próbkę. Zwróć uwagę, że na każdym obrazie co najmniej jeden obiekt jest całkowicie przedstawiony.
3. Otwórz wszystkie obrazy tej samej próbki za pomocą programu do przetwarzania obrazów ImageJ¹². Przekonwertuj obrazy na czarno-białe za pomocą narzędzia procesu "Utwórz plik binarny" (Rysunek 2). Aby zastosować polecenie do całej serii obrazów, należy użyć kodu makra w następujący sposób.
   run(,,Utwórz plik binarny")
   
4. Otwórz ponownie przetworzone obrazy binarne za pomocą ImageJ. Oblicz współczynniki kształtu: średnicę Fereta, rzutowany obszar, obwód, okrągłość, proporcje, okrągłość i solidność dla każdego obrazu za pomocą narzędzia do analizy "Ustaw pomiar". Aby zastosować polecenie do serii obrazów, należy użyć kodu makra w następujący sposób.
   run("8-bitowy");
   run("Utwórz plik binarny");
   run("Ustaw skalę...", "odległość=X znane=1000 pikseli=1 jednostka=μm globalny");
   run("Ustaw pomiary...", "Obszar obwodu, kształt, wyświetlanie limitu Fereta, przekierowanie=Brak dziesiętny=3");
   run("Analizuj cząstki...", "rozmiar=10000-Nieskończoność kołowości=0.00-1.00 show=Wyświetlanie konturów");
   Określ X jako liczbę pikseli, która odpowiada 1000 μm, konstruując linię prostą w poprzek podziałki liniowej. Skoreluj liczbę pikseli linii prostej z długością podziałki liniowej w μm.
5. Otwórz wykres wynikowy zawierający wartości współczynników kształtu dla każdego obrazu za pomocą arkusza kalkulacyjnego. Oblicz liczbę morfologii w następujący sposób dla każdego obrazu.
   
6. Obliczyć wartość średnią i odchylenie standardowe dla liczby morfologicznej, biorąc pod uwagę wszystkie obrazy jednej próbki.
7. Użyj programu do tworzenia wykresów i analizy danych, aby graficznie skorelować liczbę morfologiczną z określoną produktywnością i określić zależność matematyczną za pomocą regresji matematycznej.

6. Reprezentatywne wyniki

Poprzez dodanie mikrocząsteczek talku morfologia A. niger SKAn 1015 zmienia się z prawdziwej morfologii granulek na morfologię rozproszoną lub nawet grzybnię. Podczas gdy morfologia osadów jest wykazywana w standardowych warunkach, morfologia grzybni jest tworzona przez suplementację pożywki 10 g/L mikrocząstek talku (Ryc. 4.). Jednocześnie aktywność β-fruktofuranozydazy wzrasta około ^{3-krotnie, 3-5}. Suplementacja 1 lub 3 g/l talku w proszku prowadzi do rozproszonej morfologii, z podwojoną aktywnością fruktofuranozydazy (ryc. 4.).

Morfologia zależna od mikrocząstek może być kompleksowo opisana przez liczbę morfologii, która może być obliczona przy użyciu parametrów określonych przez automatyczną analizę obrazu. Idealnie okrągłe i gładkie granulki na obrazach mikroskopowych będą wyglądać jak idealne koła. Dla takich cząstek liczba morfologiczna ma wartość 1. Najmniejszy fragment morfologii grzybni może być uproszczony jako jednowymiarowa linia dająca liczbę morfologiczną równą 0. Wszystkie pośrednie formy morfologiczne, takie jak wydłużone, nieregularne granulki lub kępy, będą zatem miały wartości od 0 do 1. Dość duże cząstki spowodują powstanie wysokich, grzybowych cząstek o dużej powierzchni lub wydłużonych cząstek, o raczej niskiej morfologii numer ¹¹.

W standardowych warunkach morfologia w reaktorze 1 wykazuje liczbę morfologii około 0,8. Morfologia w reaktorze 4 z talkiem w proszku o stężeniu 10 g/l ma Mn około 0,1. Liczba morfologiczna dla reaktorów 2 i 3, przy stężeniach talku w proszku wynoszących 1 i 3 g/l, mieści się pomiędzy tymi skrajnościami, wykazując zróżnicowaną morfologię. Ponieważ morfologia zależna od mikrocząstek jest ściśle związana z produktywnością β-fruktofuranozjadazy, uzyskuje się matematyczną korelację liczby morfologii i produktywności podobną do ryc.

Rysunek 1. Ogólny schemat projektu eksperymentu i procedury analitycznej. A. niger jest hodowany (z mikrocząstkami lub bez) w bioreaktorze z mieszadłem o pojemności 3 l przez 72 godziny. Po 24, 48 i 72 godzinach pobiera się próbkę w celu oznaczenia suchej masy biomasy i aktywności β-fruktofuranozydazy, które są ponownie wykorzystywane do obliczenia wydajności właściwej. Po 48 godzinach morfologia grzyba jest badana pod mikroskopem i charakteryzowana za pomocą cyfrowej analizy obrazu. Odpowiednie parametry analizy obrazu są łączone w liczbę morfologiczną, która jest matematycznie skorelowana z wydajnością właściwą.

Rysunek 2. Etapy przetwarzania obrazów dla generowanych mikroskopowo obrazów struktur morfologicznych A. niger. Krok 1: akwizycja obrazu za pomocą mikroskopu. Krok 2: poprawa wizerunku w razie potrzeby. Krok 3: binaryzacja obrazu, czarno-biały (binarny) obraz wygenerowany w ImageJ. Krok 4: obraz binarny jest przetwarzany, a niechciany obiekt jest usuwany. Krok 5: analiza morfologiczna jest przeprowadzana za pomocą funkcji "Analizuj cząstki" programu open source ImageJ.

Rysunek 3. Różne formy morfologiczne A. niger w zależności od stężenia dodanych mikrocząstek. Wraz ze wzrostem stężenia dodawanych mikrocząstek, rozmiar granulki może być precyzyjnie zmniejszony do małych granulek skorupy, małych kłaczków, a nawet swobodnie zdyspergowanej grzybni. Inżynieria morfologii Aspergillus niger SKAn1015 poprzez suplementację mikrocząstkami w zanurzonej hodowli. Bez mikrocząstek (A), 10 mg/L (B), 0,1 g/L (C), 0,2 g/L (D), 0,3 g/L (E), 0,6 g/L (F), 1,0 g/L (G), 1,5 g/L (H), 2,0 g/L (I), 2,5 g/L (J), 3,0 g/L (K), 3,5 g/L (L), 4,0 g/L (M), 4,5 g/L (N), 5,0 g/L (O), 10 g/L (P), 15 g/L (Q), 20 g/L (R), 30 g/L (S) i 40-50 g/L (T). Obrazy wykonano za pomocą mikroskopii świetlnej po 72 godzinach uprawy.

Rysunek 4. Aktywność fruktofuranozydazy w zależności od stężenia mikrocząstek talku 1 g/l (reaktor 2), 3 g/l (reaktor 3) i 10 g/l (reaktor 4). Reaktor 1 nie jest uzupełniany mikrocząstkami; Tutaj uprawa odbywa się w standardowych warunkach.

Rysunek 5. Reprezentatywna dobra korelacja (R² = 0,91) liczby morfologicznej i produktywności właściwej. Liczba morfologiczna jest wykreślana (odcięte) w stosunku do produktywności właściwej (rzędnej). Regresja nieliniowa daje korelację wykładniczą.

Dyskusja

Modyfikacja morfologii grzybów jest przedmiotem zainteresowania w biotechnologii od wielu dziesięcioleci. W różnych badaniach próbowano zróżnicować wybrane parametry procesu, takie jak wartość pH, moc wejściowa, temperatura, składniki odżywcze ^{lub stężenie} inokulum1, ale cierpią one z powodu raczej nieprecyzyjnej i niepełnej kontroli morfologii, wysokich kosztów energii, efektów hamowania lub niestabilności produktu, natomiast suplementacja mikrocząstek pozwala na precyzyjną inżynierię morfologii grzybów poprzez precyzyjnie dostrojoną zmianę wielkości i stężenia cząstek. Otwiera to nowe możliwości wykorzystania mikrocząstek do optymalizacji i dostosowanego do potrzeb projektowania wysokiej morfologii produkcyjnej w produkcji biotechnologicznej z udziałem A. niger i innych mikroorganizmów nitkowatych.

Cyfrowa analiza obrazu jest łatwą do odtworzenia metodą charakteryzowania makromorfologii grzybów. Jednak różnorodność parametrów wielkości, kształtu i charakteru powierzchniowego struktur morfologicznych opisywanych w piśmiennictwie utrudnia szybką ocenę morfologii grzybów. Przedstawiona liczba morfologiczna jako kombinacja istotnych parametrów, pozwala uniknąć tego niedoboru i może być wykorzystana nie tylko do kompleksowej charakterystyki struktur morfologicznych, ale także do bezpośredniej korelacji matematycznej z produktywnością. To z kolei umożliwia oszacowanie produktywności na podstawie danej morfologii, a tym samym dostosowanie morfologii do potrzeb procesu.

Za pomocą liczby morfologicznej można rozróżnić różne morfologie wypluwek i grudek ^4,5. Dla dalszego rozwoju liczby morfologicznej obiecujące wydaje się być uwzględnienie wymiaru fraktalnego. Wymiar fraktalny daje miarę złożoności i właściwości wypełniania masy obiektu ¹³ i dlatego jest predestynowany do holistycznej charakterystyki morfologii grzybni.

Stworzenie wysoce wydajnej morfologii grzybni może jednak prowadzić do problemów z wydajnością procesu, szczególnie w uprawie na dużą skalę, ponieważ wcześniej wykazano, że forma wzrostu grzybni wykazuje znacznie większą lepkość bulionu hodowlanego2. Prowadzi to do problemów z przenoszeniem ciepła i masy oraz powstawania zastałych stref niemieszanych, które wymagają większego poboru mocy i sprawiają, że uprawa jest droższa w eksploatacji¹. Dlatego związek między morfologią grzybów a lepkością bulionu hodowlanego powinien być brany pod uwagę przy zmianie morfologii i włączony do dalszych modeli.