Indukcja sygnałów zależnych od adhezji przy użyciu ultradźwięków o niskiej intensywności

Podsumowanie

Niniejszy protokół opisuje stymulację hodowanych fibroblastów za pomocą impulsowego ultradźwięku o niskiej intensywności, co indukuje tworzenie adhezji ogniskowych oraz aktywację Rac1 poprzez naśladowanie zaangażowania transmembranecznego receptora macierzy, syndekanu-4. Podejście to umożliwia badanie skutecznej techniki klinicznej na poziomie komórkowym, stwarzając tym samym możliwości udoskonalenia tej terapii.

Streszczenie

W organizmach wielokomórkowych zachowanie komórek jest determinowane przez oddziaływania z macierzą zewnątrzkomórkową. Skutki kontaktu z macierzą obejmują regulację migracji i proliferacji komórek, sekrecję, a nawet różnicowanie. Sygnały leżące u podstaw każdego z tych złożonych procesów wynikają z oddziaływań molekularnych receptorów macierzy zewnątrzkomórkowej na powierzchni komórki. Integryny są receptorami prototypowymi i zapewniają mechaniczne połączenie między macierzą zewnątrzkomórkową a cytoszkieletem, inicjując jednocześnie niektóre kaskady sygnalizacyjne zależne od adhezji. Staje się jednak coraz bardziej oczywiste, że obok integryn funkcjonują dodatkowe receptory transbłonowe, które regulują zarówno samą integrynę, jak i sygnały w dół szlaku. Najbardziej reprezentatywnym przykładem jest transbłonowy proteoglikan, syndekan-4, który współpracuje z integryną α₅β₁ podczas adhezji do fibronektyny. Modele in vivo wykazują znaczenie sygnalizacji syndekanu-4, ponieważ myszy z knockoutem syndekanu-4 wykazują opóźnienie gojenia wynikające z nieefektywnej migracji fibroblastów^1,2. U zwierząt typu dzikiego migracja fibroblastów w kierunku rany jest wyzwalana przez pojawienie się fibronektyny, która wycieka z uszkodzonych naczyń włosowatych i jest deponowana przez makrofagi w uszkodzonej tkance. W związku z tym istnieje duże zainteresowanie odkryciem strategii wzmacniających sygnalizację zależną od fibronektyny, co mogłoby przyspieszyć procesy naprawcze.

Komponenty sygnalizacji zależnej od fibronektyny, pośredniczone przez integryny i syndekan-4, można rozdzielić poprzez stymulację komórek rekombinowanymi fragmentami fibronektyny. Chociaż angażowanie integryn jest niezbędne do adhezji komórek, niektóre sygnały zależne od fibronektyny są regulowane przez syndekan-4. Syndekan-4 aktywuje sygnał protrusywny Rac1³, powoduje redystrybucję integryn¹, wyzwala rekrutację cząsteczek cytoszkieletu, takich jak winkulina, do adhezji ogniskowych⁴, a tym samym indukuje migrację kierunkową³. Poszukiwaliśmy alternatywnych strategii aktywacji takich sygnałów i odkryliśmy, że niskointensywny impulsowy ultradźwięk (LIPUS) może naśladować efekty angażowania syndekanu-4⁵. W niniejszym protokole opisujemy metodę, w której ultradźwięki o mocy 30 mW/cm², częstotliwości 1,5 MHz, impulsowane z częstotliwością 1 kHz (Rys. 1), mogą być stosowane w odniesieniu do fibroblastów w hodowli (Rys. 2) w celu indukcji aktywacji Rac1 i tworzenia adhezji ogniskowych. Stymulacja ultradźwiękami jest stosowana przez maksymalnie 20 minut, ponieważ ustalono, że ta kombinacja parametrów jest najskuteczniejsza w przyspieszaniu klinicznej naprawy złamań⁶. Metoda ta wykorzystuje rekombinowane fragmenty fibronektyny do angażowania integryny α₅β₁, bez angażowania syndekanu-4, i wymaga hamowania syntezy białek przez cykloheksymid, aby zablokować odkładanie dodatkowej macierzy przez fibroblasty. Pozytywny wpływ ultradźwięków na mechanizmy naprawcze jest dobrze udokumentowany^7,8, a zrozumienie molekularnego efektu ultradźwięków w hodowli powinno pozwolić na udoskonalenie techniki terapeutycznej w celu poprawy wyników klinicznych.

Protokół

1. Powlekanie powierzchni ligandem macierzy

1. Ultradźwięki zostaną zastosowane do komórek w dołkach o średnicy 3,5 cm, w formie pojedynczych naczyń lub płytki 6-dołkowej. W przypadku analiz biochemicznych ligand należy nanieść bezpośrednio na plastik. Do immunofluorescencji należy trzykrotnie zagotować szklane zakrycia w wodzie MilliQ i umieścić 4 zakrycia na dnie każdego dołka.
2. Powierzchnie szklane muszą zostać poddane drywatyzacji, aby zapewnić efektywne powlekanie ligandem. Rozpuścić ester sulpho-m-maleimidobenzoylo-N-hydroksysukcynymidu w PBS do stężenia 1 mM. Dodać 2 ml do każdego dołka i inkubować przez 30 minut w temperaturze pokojowej.
3. Przemyć drywatyzowane powierzchnie 3 razy PBS.
4. Powlecz drywatyzowane szkło lub niepoddany obróbce plastik ligandem integrynowym. Nanieść 2 ml liganda integrynowego o stężeniu 10 ug/ml, rozpuszczonego w PBS zawierającym Ca²⁺ i Mg²⁺, do każdego dołka i inkubować przez noc w temperaturze 4 °C.
5. Przygotować monopartykulowane BSA, podgrzewając 1% BSA rozpuszczone w PBS do 85 °C przez 13 minut. Pozostawić do ostygnięcia, a następnie przefiltrować przez filtr 0,45-μm.
6. Przemyć powierzchnie powleczone ligandem 3 razy PBS i blokować monopartykulowanym BSA przez 30 minut.

2. Przygotowanie komórek

1. Aby kontrolować środowisko macierzy w trakcie całego eksperymentu, należy zablokować syntezę białek poprzez dodanie 25 μg/ml cykloheksymidy do fibroblastów o 80% konfluencji na 2 godziny.
2. Komórki traktowane cykloheksymidą należy przepłukać PBS i odlepić od kolby hodowlanej, używając 0,5 mg/ml trypsyny/EDTA.
3. Odseparowane komórki należy zebrać poprzez wirowanie przy 500x g przez 5 minut.
4. Komórki należy resuspendować w DMEM/25 mM HEPES z dodatkiem 25 μg/ml cykloheksymidy.
5. Należy ocenić gęstość komórek w zawiesinie za pomocą hemocytometru i rozcieńczyć ją do stężenia 105 ml-1.
6. Komórki należy inkubować w temperaturze 37 °C przez 20 minut w celu regeneracji integryn powierzchniowych.
7. Studzienki pokryte ligandem i zablokowane BSA należy przepłukać 3 razy PBS.
8. Do każdej studzienki należy nanieść 2 ml zawiesiny komórkowej.
9. Pozostawić komórki do rozprzestrzenienia się na 2 godziny w temperaturze 37 °C, przy 5% CO₂.

3. Stymulacja ultradźwiękami

1. Podgrzać macierz emiterów ultradźwiękowych oraz żel sprzęgający do 37 °C.
2. Nanieść niewielką ilość żelu sprzęgającego (wielkości ziarnka grochu) na każdy emiter.
3. Sprawdzić funkcjonalność każdego emitera za pomocą detektora w postaci diody wskaźnika ultradźwięków.
4. Umieścić dołki na macierzy emiterów. Przenieść macierz do warunków 37 °C i 5% CO₂ i odczekać 10 minut aż do wyrównania temperatury.
5. Włączyć sygnał ultradźwiękowy.
6. Sygnał ultradźwiękowy zostanie wyłączony po 20 minutach, co naśladuje schemat terapeutyczny. W przypadku potrzeby zastosowania krótszego czasu stymulacji, płytki należy wyjąć z macierzy w odpowiednich punktach czasowych. We wszystkich przypadkach należy użyć płytek niestymulowanych jako kontroli negatywnej.

4. Analiza adhezji ogniskowych metodą immunofluorescencji

1. W celu analizy tworzenia adhezji ogniskowych zastosuj 20-minutowy sygnał ultradźwiękowy, a następnie pozwól strukturom rozwijać się przez kolejne 40 minut, utrzymując komórki w temperaturze 37 °C i 5% CO₂.
2. Odsaj cały medium i utrwal komórki, dodając 2 ml 4% paraformaldehydu w PBS. Inkubuj przez 14 minut w temperaturze pokojowej.
3. Odsaj paraformaldehyd i wypłucz trzy razy PBS, aplikując go delikatnie po ściance studzienki, aby uniknąć powstania sił ścinających.
4. Przenieś każdą szkiełko nakrywkę ze studzienki 3,5 cm do płytki 24-dołkowej w celu przeprowadzenia immunofluorescencyjnego barwienia.
5. Zneutralizuj pozostałości paraformaldehydu, dodając 0,5 ml 0,1 M glicyny w PBS do każdego z 24 dołków. Inkubuj przez 20 minut w temperaturze pokojowej.
6. Odsaj glicynę i wypłucz trzy razy PBS.
7. Przeprowadź permeabilizację komórek, dodając 0,5 ml 0,5% (w/v) Triton X-100 w PBS. Inkubuj przez 4 minuty w temperaturze pokojowej.
8. Odsaj Triton X-100 i wypłucz trzy razy PBS.
9. Zablokuj nieswoiste wiązania, dodając 0,5 ml 3% (w/v) BSA w PBS. Inkubuj przez noc w temperaturze 4 °C.
10. Zbarw adhezje ogniskowe zawierające winkulinę, stosując przeciwciało hVIN-1 rozcieńczone 1:400 w bloku BSA. Inkubuj przez jedną godzinę w temperaturze pokojowej.
11. Wypłucz trzy razy PBS.
12. Zastosuj przeciwciało wtórne koniugowane z fluorophorem (DyLight 488) (rozcieńczenie 1:200) i zbarw aktynę falloidyną koniugowaną z TRITC (rozcieńczenie 1:200) w bloku BSA. Inkubuj przez 30 minut w temperaturze pokojowej.
13. Wypłucz trzy razy PBS i raz wodą.
14. Zamontuj próbkę na szkiełku przedmiotowym w pozycji odwróconej, używając medium montażowego Prolong Gold.

5. Ilościowe określanie aktywacji Rac1 za pomocą testu pull-down

1. W celu analizy aktywacji Rac1 poddaj komórki 20-minutowej ekspozycji na sygnał ultradźwiękowy w temperaturze 37 °C i 5% CO₂. Podczas oceny czasów odpowiedzi przekraczających 20 minut, zastosuj sygnał ultradźwiękowy przez 20 minut, a następnie utrzymuj komórki w 37 °C i 5% CO₂ przez pozostały czas, aby umożliwić rozwinięcie się odpowiedzi.
2. Odsuń medium i umieść studzienki na lodzie. Przepłucz studzienki 2 ml zimnego PBS, a następnie go odessij. Upewnij się, że pozostałości PBS zostały usunięte, pozostawiając studzienki pod kątem przez 1 minutę, po czym dokładnie odessij płyn.
3. Zlizuj komórki na lodzie za pomocą 35 μl buforu do lizy (10% glicerolu, 20 mM Hepes pH 7.4, 140 mM NaCl, 1% NP40, 0.5% deoksycholan sodu, 4 mM EGTA, 4 mM EDTA, 1 × inhibitor proteaz cOmplete) na studzienne. W tym przykładzie dla każdego punktu czasowego wykorzystano 6 studzienek, aby uzyskać 210 μl lizatu komórkowego. Można użyć większej lub mniejszej liczby studzienek, jednak całkowita objętość lizatu powinna wynosić ~200 μl.
4. Dokładnie zeskrob komórki skrobakiem komórkowym, aby zapewnić pełną lizę, i pozostaw studzienki pod kątem przez 1 minutę, aby lizat mógł się zgromadzić.
5. Przenieś lizat do schłodzonej do temperatury lodowej probówki do mikrocentryfugi o pojemności 1,5 ml (łącząc lizaty z tego samego schematu traktowania) i wiruj przy 21000 × g przez 2 minuty w 4 °C, aby wytrącić resztki komórkowe.
6. Przenieś 180 μl lizatu do schłodzonych do temperatury lodowej probówek o pojemności 1,5 ml zawierających 130 μl buforu do lizy i 25 μl kulek agarozowych PAK-glutation¹⁰. Pozostały surowy lizat przechowuj w -20 °C do późniejszej separacji żelowej.
7. Wychwyć aktywny Rac1 na kulkach agarozowych PAK-glutation, rotując probówkami przez 40 minut w 4 °C.
8. Zebierz konjugaty kulek agarozowych poprzez wirowanie przy 2000 × g przez 1 minutę w 4 °C.
9. Przemyj konjugaty kulek trzykrotnie 500 μl buforu do lizy, zbierając kulki przez wirowanie przy 2000x g i odrzucając nadsącz po każdym przemyciu. Ostrożnie usuń pozostały bufor do przemywania pipetą 200 μl.
10. Eluuj każdą próbkę, dodając 35 μl buforu do ładowania SDS-PAGE, a następnie inkubuj w 85 °C na wstrząsającym bloku grzewczym przez 5 minut. Usuń kulki poprzez wirowanie przy 21000 × g przez 1 minutę.
11. Rozdziel eluat z kulek metodą SDS-PAGE, przenieś na błonę nitrocelulozową i przeprowadź detekcję Rac1.

6. Reprezentatywne wyniki

W niniejszym protokole opisujemy indukcję aktywności Rac1 oraz tworzenia ognisk adhezyjnych barwionych winukulina za pomocą ultradźwięków. W eksperymencie dotyczącym adhezji ogniskowej sytuacją wyjściową jest fakt, że fibroblasty rozprzestrzenione na ligandzie integryny α₅β₁ nie tworzą adhezji zawierających winukulina (Rys. 3A), chyba że drugi receptor fibronektyny, syndekan-4, zostanie aktywowany poprzez dodanie rozpuszczalnego ligandu (Rys. 3B) ^3,4. Jednakże stymulacja ultradźwiękami indukuje tworzenie adhezji ogniskowej w takim samym stopniu, jak aktywacja syndekanu-4 (Rys. 3C), co wskazuje, że stymulacja ultradźwiękami może zastąpić określone komponenty szlaku sygnałowego zależnego od fibronektyny ⁵. Kluczowym wyzwaniem w tym protokole jest wyeliminowanie tworzenia adhezji ogniskowych w przypadku braku stymulanta. Niepełna inhibicja syntezy białek przez cykloheksymid pozwoli na depozycję macierzy wystarczającą do autostymulacji komórek. Zbyt duże zagęszczenie komórek może również prowadzić do powstawania adhezji ogniskowych na niskim poziomie oraz słabej odpowiedzi na ultradźwięki, ponieważ interferencja między kontaktami komórka-komórka a komórka-macierz utrudni eksperyment zaprojektowany w celu wyizolowania pojedynczego bodźca. Jako rozwinięcie podstawowego testu przedstawiamy ten sam eksperyment powtórzony z użyciem fibroblastów pozbawionych syndekanu-4 (Rys. 4). Fibroblasty te nadal reagują na ultradźwięki (Rys. 4C), ale nie reagują na ligand syndekanu-4 (Rys. 4B). Eksperyment z wykorzystaniem fibroblastów Sdc4 -/- dowodzi, że ultradźwięki mogą rzeczywiście ominąć potrzebę obecności niektórych receptorów fibronektyny i ilustruje, w jaki sposób prosty protokół można rozwinąć, aby uzyskać dodatkowe informacje na temat szlaku sygnałowego.

W eksperymencie biochemicznym wykazujemy, że ultradźwięki mogą indukować aktywację Rac1, wykorzystując test pull-down, który jest adaptacją metody opisanej przez Del Pozo et al. ¹⁰. Wytrącanie aktywnego Rac1 w 0, 10, 30 i 60 minutach po rozpoczęciu stymulacji ultradźwiękami wykazuje, że aktywność Rac1 osiąga szczyt w 10–30 minutach, a następnie powraca do poziomu bazowego (Ryc. 5). Analiza blotingu surowych lizatów w kierunku winkuliny zapewnia równą ilość naniesionego białka pomiędzy poszczególnymi punktami czasowymi. Wynik ten przypomina aktywację Rac1 wywołaną przez zaangażowanie syndekanu-4³, lecz jest nieco bardziej przedłużony niż aktywacja indukowana przez fibronektynę. W związku z tym zazwyczaj wymaganych jest 8–10 powtórzeń, aby uzyskać istotne statystycznie dane. Aktywacja Rac1 odpowiada za skierowanie komórek ku tworzeniu przylegań ogniskowych, a początkowe przylegania ogniskowe zaczynają formować się w 10–30 minutach, co zbiega się z aktywacją Rac1. Po zainicjowaniu przylegania te będą nadal dojrzewać do dużych blaszek przylegania przedstawionych na Ryc. 3 i 4.

Rycina 1. Kształt fali ultradźwiękowej. Ultradźwięki składają się z przerywanego sygnału 1,5 MHz, który ze względu na niską amplitudę (30 mW/cm², średnia przestrzenna, średnia czasowa) nie wywołuje efektu cieplnego.

Rycina 2. Schematyczny przedstawienie przebiegu prac nad przygotowaniem i stymulacją komórek ultradźwiękami.

Rycina 3. Indukcja tworzenia adhezji ogniskowych w fibroblastach za pomocą ultradźwięków. Fibroblasty wysiano na fragment fibonektyny wiążący integryny (A) przed stymulacją fragmentem fibonektyny wiążącym syndekan-4 (B) lub ultradźwiękami (C). Po 60-minutowej stymulacji komórki utrwalono, zabarwiono na winukulina i aktynę, a następnie obrazowano za pomocą mikroskopii epifluorescencyjnej. Pasek skali = 10 μm.

Rysunek 4. Indukcja tworzenia adhezji ogniskowych w fibroblastach pozbawionych syndekanu-4 za pomocą ultradźwięków. Fibroblasty Sdc4 -/- rozprzestrzeniono na fragmencie fibronektyny wiążącym integryny (A) przed stymulacją fragmentem fibronektyny wiążącym syndekan-4 (B) lub ultradźwiękami (C). Po 60-minutowej stymulacji komórki utrwalono, zabarwiono na obecność winkuliny i aktyny, a następnie obrazowano za pomocą epifluorescencji. Mimo że fibroblasty Sdc4 -/- były niewrażliwe na fibronektynę, ultradźwięki nadal indukowały tworzenie adhezji ogniskowych, co wskazuje, że ultradźwięki omijają proces angażowania receptorów macierzy. Pasek = 10 μm.

Rysunek 5. Aktywacja Rac1 przez ultradźwięki. Komórki stymulowano przez 0, 10, 30 i 60 minut, wykorzystując 6 dołków dla każdego punktu czasowego. Ilość GTP-Rac1 obecną w próbkach z przebiegu czasowego testu pull-down Rac1 wizualizowano poprzez inkubację z przeciwciałem anty-Rac1 na western blot (górny obraz). Kwantyfikacja intensywności prążków (średnia z 8-10 powtórzeń) wykazuje zwiększoną aktywność Rac1 w wyniku sygnału ultradźwiękowego w 10. i 30. minucie, przed powrotem do poziomów bazowych w 60. minucie (wykres). Słupki błędów reprezentują s.e.m.

Dyskusja

W niniejszym protokole opisujemy metodę, dzięki której zabieg normalnie stosowany u pacjentów może zostać wykorzystany w eksperymentach na liniach komórkowych. Ostatecznym celem jest zrozumienie molekularnego mechanizmu działania ultradźwięków, aby umożliwić udoskonalenie tej terapii. W tym protokole wykorzystujemy embrionalne fibroblasty mysie (MEFs) jako modelowy system komórkowy, jednak wykazano, że ultradźwięki są skuteczne również w przypadku pierwotnych ludzkich fibroblastów napierstka ⁵, mezenchymalnych komórek macierzystych, osteoblastów oraz chondrocytów ⁶. Jako przykład analizy biochemicznej stosujemy aktywację Rac1, lecz metoda ta mogłaby zostać w równym stopniu wykorzystana do badania regulacji fosforylacji białek lub tworzenia kompleksów białkowych metodą immunoprecypitacji. W przykładzie z zastosowaniem immunofluorescencji demonstrujemy wpływ ultradźwięków na tworzenie adhezji ogniskowej, jednak zbadana może zostać redystrybucja dowolnej cząsteczki. Na przykład można by sprawdzić rekrutację czynników cytozolowych do błony plazmatycznej, kolokalizację białek w pęcherzykach transportowych lub zbadać wpływ ultradźwięków na organizację wrzeciona mitotycznego. Do tej pory ograniczyliśmy się do testowania szlaków zależnych od fibronektyny; wpływ ultradźwięków na komórki na kolagenie lub w obecności czynników wzrostu mógłby zostać zbadany w celu stworzenia pełnego obrazu tego, jak ultradźwięki wpływają na zachowanie komórek w złożonym środowisku, które bardziej przypomina sytuację in vivo. Większym wyzwaniem będzie zbadanie efektu ultradźwięków przy użyciu obrazowania time-lapse, gdzie obecność emitera blokującego drogę światła oraz wibracje pochodzące z ultradźwięków stanowią dodatkowe przeszkody techniczne. Jednak fakt, że zastosowanie terapeutyczne wymaga jedynie 20 minut stymulacji na dobę, sugeruje, że analiza zachowania komórek po serii stymulacji może być bardzo owocna.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
ester N-hydroksy-sukcynimidowy sulfo-m-maleimidobenzoilowy	Fisher Scientific	PN22312	Roztwory stokowe 25 mM w wodzie można przechowywać w temperaturze -20°C
płytka do hodowli tkanek z 6 dołkami	Corning	3516	Tworzywa sztuczne innych firm mogą zapewniać słabsze pokrycie
szklana lamella 13-mm	Scientific Laboratory Supplies LTD	MIC3336	Szkło innych firm może zapewniać słabsze pokrycie
PBS	Sigma-Aldrich	D8537
PBS, Ca2+ Mg2+	Sigma-Aldrich	D8662
ligand integryny 50K (fragment fibronektyny)			Opis konstrukcji i przygotowanie w 9, 11. Do badania innych szlaków można użyć alternatywnych ligandów macierzy
BSA	Sigma-Aldrich	A3059
cykloheksymida	Sigma-Aldrich	C7698	Można przechowywać jako roztwór stokowy 10mg/ml w wodzie
DMEM/25 mM HEPES	Sigma-Aldrich	D6171
Exogen 4000+	Smith & Nephew Inc.
żel do sprzęgania ultradźwięków	Smith & Nephew Inc.
wskaźnik SAFHS	Smith & Nephew Inc.
hVIN-1	Sigma-Aldrich	V9264
przeciwciało anty-mysie sprzężone z DyLight 488	Stratagene, Agilent Technologies	715-485-150
faloidyna znakowana TRITC	Sigma-Aldrich	P1951
odczyn anty-fadingowy Prolong Gold	Invitrogen	P36930
inhibitor proteaz cOmplete (wolny od EDTA)	Roche Group	056 489 001	Roztwór stokowy 100× przygotowany z tabletki, przechowywany w temperaturze -20°C
kulkowe nośniki agarozowe PAK-glutationian			Opis konstrukcji i przygotowanie w 10
glicerol	Fisher Scientific	G/0650/17
Hepes	Apollo Scientific	BI8181	Przygotować roztwór stokowy 1M i dostosować pH do 7,4
NaCl	Fisher Scientific	S/0160/65
NP40	Sigma-Aldrich	I3021
deoksycholan sodu	Sigma-Aldrich	D6750
EGTA	Sigma-Aldrich	E4378
EDTA	Sigma-Aldrich	E5134