Izolacja związanych z rybosomami nowo powstałych polipeptydów in vitro w celu identyfikacji miejsc pauzy translacyjnej wzdłuż mRNA

Podsumowanie

Opisano technikę identyfikacji miejsc zatrzymania translacji na mRNA. Procedura ta opiera się na izolacji nowo powstających polipeptydów gromadzących się na rybosomach podczas translacji in vitro docelowego mRNA, a następnie na analizie wielkości łańcuchów nascentnych przy użyciu denaturującej elektroforezy żelowej.

Streszczenie

Szybkość elongacji translacyjnej nie jest jednorodna. Struktura drugorzędowa mRNA, wykorzystanie kodonów oraz białka związane z mRNA mogą zmieniać ruch rybosomów w obrębie matrycy^{w celu zapoznania się z przeglądem patrz 1}. Obecnie powszechnie przyjmuje się jednak, że wykorzystanie kodonów synonimicznych jest główną przyczyną niejednorodnych szybkości elongacji translacyjnej¹. Kodony synonimiczne nie są wykorzystywane z taką samą częstotliwością. Istnieje stronniczość w użyciu kodonów synonimicznych, przy czym niektóre kodony są wykorzystywane częściej niż inne². Stronniczość kodonowa jest specyficzna zarówno dla organizmu, jak i dla tkanki^2,3. Co więcej, częstotliwość wykorzystania kodonów jest wprost proporcjonalna do stężeń odpowiadających im tRNA⁴. Zatem kodon często wykorzystywany będzie posiadał większą liczbę odpowiadających mu tRNA, co dalej sugeruje, że kodon częsty będzie translacyjny szybciej niż kodon rzadki. W konsekwencji regiony mRNA wzbogacone w rzadkie kodony (potencjalne miejsca pauzy) co do zasady spowalniają ruch rybosomów na matrycy i powodują akumulację powstających peptydów odpowiednich wielkości^5-8. Miejsca pauzy te mogą mieć funkcjonalny wpływ na ekspresję białek, stabilność mRNA i fałdowanie białek^{w celu zapoznania się z przeglądem patrz 9}. Rzeczywiście wykazano, że zniesienie takich miejsc pauzy może zmienić ruch rybosomów na mRNA, a w konsekwencji wpłynąć na wydajność kotranslacyjnego (in vivo) fałdowania białek^1,7,10,11. Aby zrozumieć proces fałdowania białek in vivo w komórce, który jest ostatecznie sprzężony z procesem syntezy białek, niezbędne jest uzyskanie kompleksowej wiedzy na temat wpływu wykorzystania kodonów/zawartości tRNA na ruch rybosomów wzdłuż mRNA podczas elongacji translacyjnej.

W niniejszym pracy opisujemy prostą technikę, którą można wykorzystać do lokalizacji głównych miejsc pauzy translacyjnej dla danego mRNA translacjonowanego w różnych systemach bezkomórkowych^6-8. Procedura ta opiera się na izolacji nascentnych polipeptydów gromadzących się na rybosomach podczas translacji in vitro docelowego mRNA. Podstawą teoretyczną jest założenie, że w przypadku kodonów o niskiej częstotliwości występowania, wydłużenie czasu przebywania rybosomów prowadzi do zwiększenia ilości nascentnych peptydów o odpowiadających im rozmiarach. mRNA transkrybowane in vitro jest wykorzystywane do reakcji translacyjnych in vitro w obecności radioaktywnie znakowanych aminokwasów, co umożliwia detekcję nascentnych łańcuchów. W celu izolacji kompleksów nascentnych polipeptydów związanych z rybosomami, reakcję translacyjną nanosi się warstwowo na 30% roztwór glicerolu, a następnie poddaje wirowaniu. Nascentne polipeptydy w osadzie polisomalnym są następnie traktowane rybonukleazą A i rozdzielane za pomocą SDS PAGE. Technika ta może być potencjalnie zastosowana do każdego białka i pozwala na analizę ruchu rybosomów wzdłuż mRNA oraz detekcję głównych miejsc pauzy. Dodatkowo protokół ten można dostosować do badania czynników i warunków, które mogą zmieniać ruch rybosomów, a tym samym potencjalnie wpływać na funkcję lub konformację białka.

Protokół

1. Przygotowanie matrycy DNA i transkrypcja in vitro

1. Gen docelowy zostaje sklonowany pod promotorem transkrypcyjnym T7 i/lub np. SP6.
2. Do transkrypcji in vitro matryca DNA jest linearyzowana odpowiednim enzymem restrykcyjnym tnącym poniżej kodonu stop ORF i/lub końca 3' mRNA. Należy zweryfikować pełną linearyzację DNA plazmidowego, przeprowadzając elektroforezę produktu trawienia restrykcyjnego na żelu agarozowym.
3. Zlinearyzowany plazmid jest wykorzystywany do reakcji transkrypcji in vitro. Można przetestować różne stężenia matrycy DNA w celu ustalenia optymalnego stężenia DNA wymaganego do transkrypcji in vitro. Zazwyczaj, przy użyciu zestawu Ambion's MEGAscript High yield Transcription Kit (Ambion/Life Technologies, Grand Island, NY), 1 μg zlinearyzowanego DNA daje 40-60 μg mRNA. Transkrypcję in vitro przeprowadza się zgodnie z instrukcją producenta (Ambion/Life Technologies, Grand Island, NY).
4. Po transkrypcji in vitro mRNA jest oczyszczane poprzez wytrącanie chlorkiem litu zgodnie z instrukcją producenta (Ambion's MEGAscript High yield Transcription Kit).
5. Integralność mRNA jest następnie weryfikowana za pomocą elektroforezy na żelach akrylamidowych lub agarozowych.

2. Translacja bezkomórkowa in vitro

Dla in vitro wykorzystanie tłumaczenia Rkrólik Rlizat retikulocytów, RRL (Promega, Madison, WI), należy postępować zgodnie z poniższymi krokami:

1. Przygotować 100 μl reakcji translacji in vitro zgodnie z instrukcją producenta. W skrócie: do wody wolnej od nukleaz dodać 2 μl mieszaniny aminokwasów bez metioniny (1 mM), 10 jednostek inhibitora RNazy (Invitrogen/Life Technologies, Grand Island, NY), 20 μCi radioaktywnej [³⁵S]-metioniny (MP Biomedicals, Solon, OH) oraz 70 μl lizatu retikulocytów królika (Promega, Madison, WI).
2. Inkubować reakcję w temperaturze 30 °C przez 5 min w celu wstępnego ogrzania mieszaniny translacyjnej. Dodać 2 μg mRNA do reakcji translacji i inkubować w 30 °C przez 5 min.
3. Przerwać reakcję, umieszczając mieszaninę translacyjną na lodzie.

3. Izolacja nowo powstałych polipeptydów z reakcji translacji in vitro

1. Aby wyizolować nowo powstały polipeptyd związany z rybosomami (polysom), reakcję translacji nakłada się na 4,5 ml 30% glicerolu w buforze 10 mM Tris-HCl pH 7,6 zawierającym 100 mM KCl i 10 mM MgCI₂, a następnie wiruje przy 100,000 X g w rotorze TLA-110 (Beckman Coulter, Inc, Brea, CA) przez 1 h w temperaturze 4 °C.
2. Następnie ostrożnie usuwa się supernatant.
3. Osad polysomalny zawierający nowo powstałe polipeptydy resuspendsuje się w małej objętości (10-15 μl) buforu 1 mM Tris-HCl pH 7,6 zawierającego 0,5 mg/ml rybonukleazy A (Invitrogen/Life Technologies, Grand Island, NY) i inkubuje przez 30 min w 37 °C. W celu wzmocnienia hydrolizy wiązania estrowego peptydylo-tRNA dodaje się NaOH do stężenia końcowego 10 mM i kontynuuje inkubację przez kolejne 30 min.

In vitro reakcja translacji przeprowadzona bez udziału mRNA i w tych samych warunkach (z następującą po niej izolacją nowo powstałych peptydów zgodnie z opisem) służyłaby jako główna próba kontrolna. Traktowanie reakcji translacji puromycyną przed poddaniem ekstraktu wirowaniu w gradiencie gęstości może służyć jako dodatkowa kontrola.

4. Rozdzielanie nowo powstałego polipeptydu za pomocą elektroforezy Tris-tricine SDS PAGE

1. Wyizolowane nowo powstałe polipeptydy rozdziela się i analizuje za pomocą elektroforezy Tris-tricine SDS-PAGE. Należy pamiętać, że ilość materiału naniesionego na żel będzie zależna od wydajności znakowania białek, wydajności translacji białek oraz wielu innych parametrów. Ilość naniesionego materiału należy dostosować empirycznie, aby zapewnić najlepszą wizualizację i rozdzielenie poszczególnych łańcuchów polipeptydowych.
2. Po elektroforezie żele są utrwalane, suszone w próżniowej suszarce do żeli i poddawane autoradiografii. Rozkład nowo powstałych polipeptydów obserwuje się przy użyciu obrazowania fosforowego.

5. Reprezentatywne wyniki

Wołowia gamma-B krystalina została przetłumaczona w lizacie retikulocytów królika (RRL) oraz w systemach ekstraktu S30 E. coli (Promega, Madison, WI), a następnie dokonano izolacji powstających łańcuchów polipeptydowych. Rysunek 1 przedstawia etapy izolacji powstających łańcuchów związanych z rybosomami. Celem niniejszego badania było sprawdzenie, czy zmiana środowiska translacji, tj. zestawu tRNA (który, jak wiadomo, znacznie różni się w systemach ssaczych (RRL) i prokariotycznych (E. coli) ze względu na różnice w preferencjach kodonów między organizmami), może zmienić ruch rybosomów wzdłuż mRNA i wpłynąć na rozmieszczenie miejsc zatrzymania translacji. Zmieniony ruch rybosomów powinien prowadzić do zmian w rozkładzie wielkości powstających polipeptydów gromadzących się podczas translacji, a także w ich względnej intensywności. Względne intensywności prążków odzwierciedlają czas trwania zatrzymania. Powstające polipeptydy wyizolowano i rozdzielono w technice SDS PAGE na żelu 16.5%T, 6%C Tris-tricine (Rysunek 2). Gamma-B krystalina jest białkiem o masie 20 kDa. Obserwacja powstających polipeptydów o nieidentycznych długościach i intensywnościach w systemach RRL i E. coli wskazuje, że ruch rybosomów wzdłuż mRNA w tych dwóch systemach przebiega według odmiennej kinetyki translacji. Na przykład w lizacie E. coli zaobserwowaliśmy wyraźny prążek o masie 17.7 kDa, którego nie było w systemie RRL, co sugeruje istnienie dodatkowego miejsca zatrzymania translacji w regionie 3'-końca mRNA (kodującym region C-końcowy gamma-B krystaliny), gdy jest on tłumaczony w systemie E. coli. Zauważamy, że gamma-B krystalina zawiera tandemowe kodony Arg (AGG₁₅₃ i AGA₁₅₄), które są częste w systemach ssaczych, ale znane są jako niezwykle rzadkie i wolno tłumaczone w E. coli. Nowy powstający peptyd gromadzący się w systemie E. coli (~17.7 kDa Rysunek 2.2) jest prawdopodobnie spowodowany zatrzymaniem rybosomu na tych tandemowych rzadkich kodonach. Należy zauważyć, że wykluczenie mRNA powoduje brak widocznych prążków (Rysunek 2.3), a traktowanie puromycyną usuwa większość powstających łańcuchów z polizomów (Rysunek 2.3). Przedłużona inkubacja z puromycyną (> 15 min) usuwa wszystkie powstające łańcuchy (dane nieprzedstawione). Potwierdza to, że obserwowane produkty polipeptydowe są powstającymi łańcuchami związanymi z rybosomami, a nie mRNP współosadzającymi się z polizomami.

Jak wspomniano powyżej, preferencja kodonów (codon bias) jest specyficzna zarówno dla organizmu, jak i dla tkanki. Przedstawiony tutaj reprezentatywny przykład wyraźnie wskazuje, że zmiana środowiska translacji, tj. zestawu tRNAs/preferencji kodonów, może prowadzić do zmiany ruchu rybosomu wzdłuż mRNA. Ewidentnie ta prosta technika pozwala nie tylko na identyfikację miejsc zatrzymania translacji wzdłuż mRNA, ale umożliwia również szybkie porównanie miejsc zatrzymania translacji pomiędzy różnymi układami.

Rysunek 1. Schemat wyjaśniający etapy izolacji nowo powstałych polipeptydów związanych z rybosomami. Sekwencja ORF białka Gamma-B krystaliny bydlęcej (528 par zasad) została sklonowana za promotorem T7 w wektorze pBSKS+. Do transkrypcji in vitro wykorzystano matrycę DNA zlinearyzowaną za pomocą EcoRI. Zlinearyzowana matryca posłużyła do przeprowadzenia transkrypcji in vitro. Promotor T7 w matrycy DNA jest rozpoznawany przez polimerazę RNA T7, która transkrybuje znajdujący się za nim gen Gamma-B krystaliny. mRNA jest oczyszczane metodą wytrącania chlorkiem litu. Oczyszczone mRNA jest wykorzystywane do translacji in vitro. Po inkubacji mieszaninę reakcyjną translacji naniesiono na 30% roztwór glicerolu i wirowano przez 1 hr w temperaturze 4 °C przy 100,000 X g w celu izolacji nowo powstałych polipeptydów związanych z rybosomami.

Rycina 2. Izolacja nowo powstałych polipeptydów bydlęcej krystaliny Gamma-B przetłumaczonych w lizacie retikulocytów królika (RRL) oraz lizacie E. coli. 2 μg mRNA zmieszano w 100 μl mieszaniny reakcyjnej zawierającej RRL lub system ekstraktu S30 z E. coli (Promega, Madison, WI) zgodnie z instrukcją producenta z 20 μCi [³⁵S]-metioniną i inkubowano w 30 °C przez 5 min. Po inkubacji mieszaninę reakcji translacji nałożono na 4,5 ml 30% glicerolu w buforze 10 mM Tris-HCl pH 7.6, zawierającym 100 mM KCl i 10 mM MgCI₂, a następnie wirowano przez 1 h w 4 °C przy 100,000 X g w rotorze TLA-110 (Beckman Coulter, Inc, Brea, CA). Izolowany osad polirybosomów resuspendowano w 20 μl 1 mM Tris-HCl pH 7.6, zawierającego 0,5 mg/ml rybonukleazy A (Invitrogen/Life Technologies, Grand Island, NY), a następnie poddano działaniu NaOH (jak opisano w sekcji protokołu). Nowo powstałe polipeptydy rozdzielono na żelu SDS-PAGE Tris-Tricine 16,5% T, 6% C. Żel wysuszono i naświetlono do autoradiografii. Po naświetleniu żel przeskanowano za pomocą skanera obrazującego Typhoon firmy GE Healthcare. Rycina 2.1 przedstawia żel z nowo powstałymi polipeptydami izolowanymi i rozdzielonymi po reakcjach translacji przeprowadzonych w dwóch różnych systemach (RRL i E. coli). Rycina 2.2 Żel przeanalizowano za pomocą oprogramowania Image Quant TL, v2005 i wykorzystano go tutaj jako przykład, aby pokazać, że masę cząsteczkową i intensywność nowo powstałych polipeptydów gromadzących się w obu systemach można łatwo analizować i porównywać. Rycina 2.3 przedstawia dwa zestawy kontroli: nowo powstałe polipeptydy izolowane i rozdzielone na SDS-PAGE po reakcjach translacji przeprowadzonych bez mRNA i/lub po potraktowaniu reakcji translacji puromycyną (5 min, stężenie końcowe 1 mM) przed poddaniem reakcji wirowaniu.

Dyskusja

Dla uzyskania powtarzalnych wyników krytyczne znaczenie mają jakość i stężenie komponentów wykorzystywanych w reakcjach transkrypcji i translacji in vitro. W niniejszym badaniu zastosowano dostępne komercyjnie zestawy i ekstrakty, które przy ostrożnym obchodzeniu się z nimi dostarczają wysoce powtarzalnych danych. Niemniej jednak, w razie potrzeby, ekstrakty zdolne do translacji można przygotować z wybranych komórek. Jakość mRNA może wpływać na translację, dlatego niezwykle ważne jest sprawdzenie integralności m...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Zestaw do transkrypcji o wysokiej wydajności MEGAscript T7	Ambion	AM1333
Inhibitor rybonukleazy	Invitrogen	15518012
Znacznik Trans [35S]-Label	MP Biomedicals	0151006
Rybonukleaza-A	Invitrogen	12091
System lizatu retikulocytów królika, traktowany nukleazą	Promega	L4960
System ekstraktu S30 z E. coli do matryc liniowych	Promega	L1030
Wirowanie	Beckman Coulter	Ultrawirowka Optima TLX
Autoradiografia na fosforowych płytach pamięci	GE Healthcare	Obrazownik Typhoon 9410 w trybie zmiennym
Oprogramowanie do analizy powstających polipeptydów	GE Healthcare	Image Quant TL, v2005