Artykuł metodologiczny

Dwie metody tworzenia heterokaryonów w celu wykrycia czynników restrykcyjnych HCV

11.4K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/4029

⸱

16 lipca 2012

 ,  ,  ,  , 
1Division of Experimental Virology, Twincore, Centre for Experimental and Clinical Infection Research, 2Aaron Diamond AIDS Research Center, Laboratory of Retrovirology, The Rockefeller University, NY

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Opisujemy dwie metody warunkowej komplementacji trans w procesie składania wirusa zapalenia wątroby C (HCV) i dopełnienia pełnego cyklu życiowego wirusa, które opierają się na tworzeniu heterokaryonów. Techniki te są odpowiednie do przesiewania linii komórkowych wykazujących ekspresję dominujących czynników restrykcyjnych, które uniemożliwiają produkcję zakaźnego potomstwa HCV.

Streszczenie

Wirus zapalenia wątroby typu C (HCV) jest wirusem hepatotropowym, którego zakres gospodarzy ogranicza się do ludzi i szympansów. Chociaż obserwowano replikację RNA HCV w ludzkich liniach komórkowych pozahepatycznych oraz w mysich liniach komórkowych, wydajność ta była bardzo niska i wymagała długotrwałych procedur selekcyjnych z wykorzystaniem konstruktów replikonów HCV wykazujących dominujące markery selekcyjne z antybiotykami1-5. Badania HCV in vitro są zatem ograniczone do ludzkich linii komórkowych raka wątroby, które są podatne na wniknięcie wirusa i dopełnienie cyklu życiowego wirusa. Ze względu na wąski tropizm gatunkowy HCV, nie istnieje dostępny immunokompetentny model małego zwierzęcia, który utrzymywałby pełny cykl replikacji HCV 6-8. Nieefektywna replikacja HCV w komórkach niehumanoidalnych, np. pochodzenia mysiego, wynika prawdopodobnie z niezgodności genetycznej niezbędnych czynników zależnych od gospodarza i/lub ekspresji czynników restrykcyjnych.

Zbadaliśmy, czy propagacja HCV jest tłumiona przez dominujące czynniki restrykcyjne w liniach komórkowych człowieka pochodzących z tkanek pozawątrobowych lub w liniach komórkowych wątroby mysiej. W tym celu opracowaliśmy dwie niezależne, warunkowe metody trans-komplementacji opierające się na fuzji komórek somatycznych. W obu przypadkach ukończenie cyklu replikacyjnego wirusa jest możliwe wyłącznie w heterokaryonach. W konsekwencji pomyślna trans-komplementacja, stwierdzana poprzez pomiar produkcji nowego, zakaźnego potomstwa wirusowego de novo, wskazuje na brak dominujących restrykcji.

W szczególności subgenomowe replikony HCV zawierające transgen lucyferazy zostały transfektowane do wysoce permisywnych ludzkich komórek hepatomy (komórki Huh-7.5). Następnie komórki te były hodowane wspólnie i fuzjonowane z różnymi komórkami ludzkimi i mysimi wykazującymi ekspresję białek strukturalnych HCV: rdzenia (core), białek otoczki 1 i 2 (E1, E2) oraz białek akcesoryjnych p7 i NS2. Po zainicjowaniu fuzji komórkowej poprzez zastosowanie glikolu polietylenowego (PEG), hodowla uwalniała infekcyjne cząstki wirusa, które infekowały komórki naiwne w sposób zależny od receptorów.

Aby ocenić wpływ dominujących restrykcji na pełny cykl życiowy wirusa, obejmujący wniknięcie do komórki, translację RNA, replikację oraz składanie wirusa, wykorzystaliśmy linię komórek wątroby człowieka (komórki Huh-7 Lunet N 9), w której brakuje endogennej ekspresji CD81, niezbędnego czynnika wniknięcia HCV. W przypadku braku ektopowej ekspresji CD81 komórki te są w zasadzie oporne na zakażenie HCV 10. Co istotne, po wspólnej hodowli i fuzji z komórkami wykazującymi ekspresję ludzkiego CD81, ale pozbawionymi co najmniej jednego innego kluczowego czynnika wniknięcia do komórki (np. SR-BI, CLDN1, OCLN), tylko powstałe heterokariony wykazują pełny zestaw czynników wniknięcia HCV niezbędnych do infekcji. Zatem, aby przeanalizować, czy dominujące czynniki restrykcyjne hamują zakończenie cyklu replikacyjnego HCV, przeprowadziliśmy fuzję komórek Lunet N z różnymi komórkami pochodzenia ludzkiego i mysiego, które spełniały wyżej wymienione kryteria. Gdy komórki w wspólnej hodowli przetransfekowano wysoce fuzogennym mutantem białka otoczki wirusowej prototypowego wirusa pienistego (PFV11), a następnie poddano je działaniu zakaźnych cząsteczek HCV (HCVcc), zaobserwowano produkcję zakaźnego wirusa de novo. Wskazuje to, że HCV pomyślnie ukończyło swój cykl replikacyjny w heterokaryonach, co wyklucza ekspresję dominujących czynników restrykcyjnych w tych liniach komórkowych. Te nowe warunkowe metody trans-komplementacji będą przydatne do przesiewowej analizy szerokiego panelu linii komórkowych i komórek pierwotnych pod kątem ekspresji specyficznych dla HCV dominujących czynników restrykcyjnych.

Protokół

Fuzja komórek za pomocą PEG

1. Hodowla komórkowa

  1. Hodować naiwne lub pakujące linie komórkowe Huh-7.5, HeLa i Hep56.1D 12 na 15 cm szalkach hodowlanych w pełnej pożywce DMEM (DMEM cplt), która jest pożywką DMEM uzupełnioną o 2 mM L-glutaminy, 1x nieistotne aminokwasy, 100 U/mL penicyliny, 100 μg/mL streptomycyny oraz 10% płodowej surowicy cielęcej. W przypadku stabilnych linii komórkowych zastosować odpowiednią selekcję zgodnie z treścią Table 1.

2. Transfekcja RNA HCV

  1. Komórki Huh-7.5 (jedna w pełni zrosła szalka 15 cm) przemyć dwukrotnie roztworem PBS, poddać trypsynizacji i resuspender w stężeniu 1,5x107 komórek/mL w buforze Cytomix (120 mM KCl, 0,15 mM CaCl2, 10 mM K2HPO4 [pH 7,6], 25 mM HEPES, 2 mM EGTA, 5 mM MgCl2, pH dostosowane do 7,6 za pomocą KOH i wysterylizowane przez filtrację) zawierającym 2 mM ATP oraz 5 mM glutationu.
  2. 400 μL zawiesiny komórkowej (6x106 komórek) transfekować metodą elektroporacji 10 μg HCV RNA (pFKi389Luc-EI/NS3-3'_JFH1_dg 13), używając kuwet o szerokości szczeliny 0,4 cm i systemu Gene pulser Xcell (Biorad) ustawionego na 975 μF i 270 V, zgodnie z wcześniejszym opisem 14.
  3. Transfekowane komórki Huh-7.5 natychmiast przenieść do 10 mL kompletnej pożywki DMEM i wysiać całą zawiesinę na jedną szalkę hodowlaną o średnicy 10 cm. Hodować komórki przez 24 h w temperaturze 37 °C i 5% CO2.

3. Indukcja fuzji za pomocą PEG

  1. Zebrać komórki zgodnie z opisem w sekcji 2.1, resuspendować w pełnej pożywce DMEM i rozcieńczyć do stężenia 5x105 komórek/mL.
  2. Przygotować zawiesiny pojedynczych komórek linii Huh-7.5, HeLa oraz komórek pakujących Hep56.1D i rozcieńczyć je odpowiednio do stężeń 5x105 komórek/mL, 2x105 komórek/mL oraz 2x105 komórek/mL. Należy pamiętać, że komórki pakujące ektopowo eksponują białka HCV: core, E1, E2, p7 i NS2 po transdukcji dwoma niezależnymi wektorami lentiwirusowymi wprowadzającymi odpowiednio kasetę ekspresyjną C-E1 oraz E2-p7-NS2 13, 15.
  3. Przygotować 6-dołkowe płytki hodowlane z 2-3 sterylnymi szkiełkami nakrywkowymi na dołek do późniejszej analizy wydajności fuzji.
  4. Połączyć 1 mL transfektowanych komórek Huh-7.5 zawierających replikon subgenomowy z 1 mL komórek pakujących, wysiać do jednego dołka płytki 6-dołkowej i inkubować przez 24 h w temperaturze 37 °C i 5% CO2.
  5. W tym punkcie czasowym gęstość komórek powinna wynosić od 60-80% konfluencji przed indukcją fuzji, aby komórki znajdowały się w bliskim sąsiedztwie, co umożliwi fuzję błon komórkowych.
  6. Odssać pożywkę z kokultury komórek i przemyć raz 1 mL PBS, następnie ostrożnie dodać 500 μL uprzednio ogrzanego 40% PEG-1500 lub PBS jako kontroli i inkubować przez 5 min w 37 °C w celu indukowania powstawania heterokaryonów.
  7. Odssać PEG i ostrożnie przemyć 3-5 razy przez 1 minutę (min) na każde przemycie 2 mL PBS, aby usunąć nadmiar PEG, a na koniec dodać 2 mL pełnej pożywki DMEM do każdego dołka i inkubować w 37 °C i 5% CO2.
  8. Czterdzieści osiem godzin po fuzji zebrać każdy nadsącz i przefiltrować go przez filtr 0,45 μm.
  9. Zmierzyć produkcję cząstek zakaźnych w zfuzjowanych heterokaryonach poprzez inokulację naiwnych komórek Huh-7.5 (8x104 komórek/dołek wysianych na płytce 12-dołkowej 24 h przed inokulacją) za pomocą 500 μL bezkomórkowego płynu hodowlanego, a następnie określić aktywność lucyferazy 14.

4. Immunofluorescencja w celu określenia wydajności fuzji

  1. Po zebraniu nadsączów z kultur komórkowych (rozdział 3.8), wypłucz raz dołki zawierające szkiełka podstawowe 1 mL PBS przez 1 min. Wszystkie kolejne kroki należy przeprowadzać w temperaturze pokojowej (RT), a płukanie powinno odbywać się przy użyciu 1 mL PBS przez 1 min na każde płukanie.
  2. Utrwal komórki, dodając 600 μL 3% paraformaldehydu (PFA) w PBS przez 15 min, a następnie wypłucz 3x w PBS. Ostrożnie przenieś szkiełka podstawowe do płytki 24-dołkowej za pomocą pęsety.
  3. Przeprowadź permeabilizację komórek, stosując 500 μL 0,5% Triton X-100 w PBS przez 5 min, a następnie wypłucz 3x w PBS.
  4. Przygotuj roztwór przeciwciał pierwszorzędowych w PBS uzupełnionym o 5% surowicy koziej. Użyj przeciwciała anty-NS5A (9E10) w stężeniu 0,5 μg/mL oraz ludzkiego monoklonalnego przeciwciała anty-E2 (CBH-23) w stężeniu 6,4 ng/mL. Nanieś 250 μL do każdego dołka i inkubuj w RT przez 45 min.
  5. Wypłucz 3x w PBS i wykryj związane przeciwciała pierwszorzędowe, stosując 250 μL wtórnych przeciwciał kozich anty-mysich lub kozich anty-ludzkich specyficznych dla IgG, sprzężonych z Alexa-Fluor 546 lub Alexa-Fluor 488, w stężeniu 2 μg/mL w PBS uzupełnionym o 5% surowicy koziej. Inkubuj przez 30 min w RT w ciemności.
  6. Następnie wypłucz 1x w PBS i zabarw jądra komórkowe, stosując 250 μL DAPI (4',6'- diamidino-2-phenylindole dihydrochloride) rozcieńczonego 1:3000 w PBS; inkubuj przez 1 min w RT w ciemności.
  7. Wypłucz 4x w PBS i 1x w H2O, a następnie zamontuj szkiełka podstawowe odwrócone do góry dnem na kropli Fluoromount na szkiełku przedmiotowym, pozostaw do wyschnięcia w ciemności i oceń próbkę za pomocą pośredniej mikroskopii fluorescencyjnej.

Fuzja poprzez przejściową transfekcję glikoproteiny prototypowego wirusa pienistego (PFV)

5. Przygotowanie inokulum wirusowego

  1. Przygotować stok wirusa o wysokim mianie poprzez transfekcję RNA HCV transkrybowanego in vitro do komórek Huh-7.5 oraz zebranie supernatantu z hodowli komórkowej po 48 h i 72 h zgodnie z wcześniej opisaną procedurą 14. Miano wirusa określić za pomocą testu rozcieńczeń ograniczających (TCID50) 13.

6. Hodowla komórek, fuzja komórek poprzez transfekcję fusogennej glikoproteiny PFV

  1. Hodować komórki Lunet N, HeLa oraz Hep56.1D hCD81 zgodnie z instrukcjami w Tabeli 1 w pełnej pożywce DMEM zawierającej odpowiednie selekcje.
  2. Odczepić komórki zgodnie z opisem w punkcie 2.1, przygotować zawiesiny pojedynczych komórek w pełnej pożywce DMEM i współhodować komórki Lunet N z liniami komórkowymi HeLa lub Hep56.1D hCD81 w odpowiednich stosunkach (np. 1:2 dla Hep56.1D hCD81 lub 1:1 dla komórek HeLa), aby uzyskać całkowitą gęstość komórek 1.5x105 komórek na dołek płytki 12-dołkowej, a następnie inkubować przez 24 h w temperaturze 37 °C i 5% CO2.
  3. Następnego dnia przeprowadzić przejściową transfekcję komórek wysoce fuzogennym białkiem otoczki PFV (pczHFVenvEM066 16) przy użyciu Lipofectamine 2000 zgodnie z instrukcjami producenta.

7. Test infekcyjny

  1. Zaszczepić heterokariony 30 h po transfekcji 350 μL zapasu wirusa (MOI ~2,3) na 12 h w ciągu nocy, przemyć raz PBS i dodać 1 mL pełnej pożywki DMEM na dołek. Inkubować przez 48 h w temperaturze 37 °C i 5% CO2.
  2. Zebrać nadsącz z hodowli heterokaryonów, przefiltrować przez filtr 0,45 μm i zaszczepić komórki Huh-7.5, wysiane dzień wcześniej w płytkach 96-dołkowych (1x104 komórek/dołek), w teście rozcieńczeń ograniczających 13.
  3. Po 72 h zbarwić zainfekowane komórki Huh-7.5 przeciwciałem specyficznym dla HCV (NS5A; 9E10), aby określić ilość produkowanych zakaźnych cząstek potomnych.

8. Wizualizacja fuzji komórek

  1. Aby zwizualizować zdarzenia fuzji, należy przygotować 5 do 10 μM roztwory barwników CellTracker w medium DMEM bez dodatków i wykonać poniższe kroki na 6 h przed kokulturą (opisane w sekcjach 6.2 i 6.3).
  2. Adherentne komórki należy przepłukać raz 5 mL PBS, a następnie inkubować z 4 mL roztworu barwiącego na szalkę 10 cm przez 45 min w 37 °C i 5% CO2 (komórki Lunet N barwić barwnikiem CellTracker Orange CMTMR, a komórki HeLa lub Hep56.1D hCD81 barwnikiem CellTracker Green CMFDA, oddzielnie).
  3. Komórki należy przepłukać raz 5 mL PBS przez 1 min, dodać kompletne medium DMEM i inkubować przez 6 h w 37 °C i 5% CO2.
  4. Przygotowanie do wysiewu i transfekcji zabarwionych komórek należy przeprowadzić zgodnie z opisem w sekcjach 6.2 i powyżej. Należy jednak dodać szkiełko nakrywkowe do szalki z kulturą komórkową przed wysiewem.
  5. 30 h po transfekcji komórki należy ostrożnie przepłukać 1 mL PBS przez 1 min, a następnie utrwalić 250 μL 3% PFA przez 15 min w RT. Komórki należy przepłukać raz 1 mL PBS przez 1 min, zabarwić DAPI przez 1 min zgodnie z opisem w sekcji 4.6, przepłukać raz 1 mL PBS przez 1 min, powtórzyć płukanie H2O i zamontować szkiełka nakrywkowe na szkiełkach przedmiotowych (patrz sekcja 4.7). Komórki należy przeanalizować za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego.
GatunekLinia komórkowaPochodzeniePożywka wzrostowa i selekcja
CzłowiekHuh-7.5Subklon linii komórkowej hepatomy Huh-7 17DMEM cplt
 Huh-7.5 [CE1][E2p7NS2]Stabilnie eksponująca białka wirusowe core, E1, E2, p7 i NS2, transdukowana lentiwirusowym transferem genów z dwóch niezależnych kaset genowychDMEM cplt + Blasticidin 5 μg/mL
 Huh-7 Lunet NSubklon linii komórkowej hepatomy Huh-7 9DMEM cplt
 HeLaLinia komórkowa gruczolakoraka szyjki macicy (numer ATCC: CCL-2)DMEM cplt
 HeLa [CE1][E2p7NS2]Stabilnie eksponująca białka wirusowe core, E1, E2, p7 i NS2, transdukowana lentiwirusowym transferem genów z dwóch niezależnych kaset genowychDMEM cplt + G418 750 μg/mL; Blasticidin 5 μg/mL
MyszHep56.1DPierwotny rak hepatokomórkowy (uprzejmy dar od J. Encke)
Dorosłe myszy C57BL/6J		DMEM cplt
 Hep56.1D [CE1][E2p7NS2]Stabilnie eksponująca białka wirusowe core, E1, E2, p7 i NS2, transdukowana lentiwirusowym transferem genów z dwóch niezależnych kaset genowychDMEM cplt + G418 750 μg/mL; Blasticidin 5 μg/mL
 Hep56.1D hCD81Stabilnie eksponująca ludzkie CD81, transdukowana lentiwirusowym transferem genówDMEM cplt + Blasticidin 5 μg/mL

Tabela 1. Specyfikacje dotyczące pochodzenia i warunków hodowli użytych linii komórkowych. Cplt: kompletne, G418: genetycyna, h: ludzki.

9. Reprezentatywne wyniki

W niniejszym badaniu zastosowaliśmy dwie różne metody fuzji komórek somatycznych, które pozwalają nam na specyficzne zbadanie wpływu czynników restrykcyjnych na ukończenie cyklu replikacyjnego HCV w heterokaryonach. Należy zauważyć, że warunkowy projekt komplementacji trans po fuzji dwóch różnych typów komórek gwarantuje, że tylko w prawdziwych heterokaryonach powstałych z ludzkich komórek wątroby i linii komórkowych niepermisywnych dochodzi do montażu wirusa (podejście 1) lub wnikania wirusa i pełnego cyklu replikacyjnego HCV (podejście 2).

W pierwszym podejściu komórki Huh-7.5, wysoce podatne na HCV, zostały przejściowo transfekowane subgenomowym replikonem wykazującym ekspresję transgenu lucyferazy oraz białek niestrukturalnych HCV wspierających subgenomową replikację RNA HCV (komórki replikonowe Huh-7.5). Komórki te współhodowano i fuzowano z liniami komórkowymi wykazującymi ekspresję białek strukturalnych HCV: core, E1, E2, a także białek akcesoryjnych p7 i NS2. Rysunek 1A przedstawia schemat procedury eksperymentalnej. Co istotne, po fuzji indukowanej PEG-iem, wszystkie białka wymagane do montażu cząsteczek powinny być obecne w powstałym heterokaryonie, co można potwierdzić za pomocą immunofluorescencji przeciwko poszczególnym białkom wirusowym. Rysunek 1B przedstawia przykładowe zdarzenie fuzji, w którym sygnały zarówno dla NS5A eksponowanego w komórkach replikonowych Huh-7.5, jak i E2 eksponowanego w komórkach pakujących Huh-7.5[CE1][E2p7NS2] zostały wykryte w tej samej cytoplazmie po powstaniu heterokaryonu indukowanego PEG-iem. Gdy współhodowane komórki zostały zamiast tego potraktowane PBS, nie indukowano fuzji, w związku z czym zaobserwowano jedynie komórki pojedynczo dodatnie i brak kolokalizacji sygnałów. Ponadto, w celu kontroli ekspresji transgenu, przeprowadziliśmy testy ELISA specyficzne dla core i E2 (opisane szczegółowo wcześniej 15). Oprócz kontrolnej linii komórek pakujących Huh-7.5[CE1][E2p7NS2], wygenerowaliśmy komórki pakujące HeLa i Hep56.1D jako przedstawicieli odpowiednio ludzkich komórek pozawątrobowych i mysich komórek wątroby. Wydajność replikacji RNA HCV w tych ostatnich komórkach jest niska, a montaż i uwalnianie HCV nie zostały wykazane. Rysunek 1C ilustruje wyniki testu fuzji. Nadpłyn z współhodowli zebrano 48 h po indukcji fuzji i wykorzystano do inokulacji naiwnych komórek Huh-7.5 w celu przeprowadzenia późniejszych testów lucyferazy. Co znaczące, gdy komórki replikonowe Huh-7.5 fuzowano z naiwnymi liniami komórkowymi lub potraktowano PBS jako kontrolę, w płynach hodowlanych nie wykryto zakaźności. Jednakże, gdy fuzja komórek między replikonem Huh-7.5 a liniami komórek pakujących została indukowana przez PEG, trans-komplementacja między replikonem a konstytutywnie eksponowanymi białkami strukturalnymi przywróciła produkcję wirusa w powstałych heterokaryonach, a zakaźne cząsteczki wirusa zostały uwolnione do płynów hodowlanych. Wyciągnęliśmy zatem wniosek, że produkcja wirusa wymagała fuzji komórek i ekspresji białek wirusowych w liniach komórek pakujących. Uderzające jest to, że nie tylko heterokaryony ludzkich komórek raka wątroby Huh-7.5, ale także heterokaryony z ludzkimi komórkami pozawątrobowymi (HeLa[CE1][E2p7NS2]) i mysimi komórkami wątroby (Hep56.1D[CE1][E2p7NS2]) umożliwiły uwalnianie wirusa, co wskazuje, że montaż i uwalnianie nie są dominująco hamowane przez potencjalne czynniki restrykcyjne w tych typach komórek. Ekspresja białek strukturalnych w liniach komórek pakujących oraz autentyczne wnikanie do komórek docelowych zostały wykazane przez Frentzena et al. 15.

W celu analizy możliwych ograniczeń wpływających na etapy wnikania wirusa do komórki, translacji RNA oraz replikacji RNA w cyklu replikacyjnym, a także aby wykluczyć, że wysokie obciążenie wirusowe w transfektowanych komórkach replikonu Huh 7.5 uniemożliwiłoby wykrycie czynników restrykcyjnych w wyniku nasycenia, zastosowano alternatywną metodę fuzji komórek. W tym celu opracowano niezależny test oparty na inokulacji heterokaryonów wirusem HCVcc i detekcji produkcji wirusa de novo w tych komórkach. Jak przedstawiono na Rysunku 2A, fuzję komórek somatycznych indukowano poprzez ekspresję fusogennego glikoproteiny po wspólnej hodowli komórek. Metodę tę wybrano ze względu na prawdopodobny wzrost czułości wynikający ze zwiększonej wydajności fuzji. Heterokaryony wizualizowano poprzez barwienie oddzielnych linii komórkowych barwnikami CellTracker przed wspólną hodowlą. Heterokaryon z homogenicznie rozłożonymi barwnikami w cytoplazmie wskazuje na fuzję dwóch typów komórek, co przedstawiono na Rysunku 2B. Tylko w heterokaryonach komórek Lunet N z komórkami HeLa lub Hep56.1D hCD81 wszystkie czynniki wnikania HCV są eksprimowane, co selektywnie czyni heterokaryony podatnymi na wnikanie HCV do komórki. Infekcja HCVcc doprowadziła do pełnej replikacji HCV w heterokaryonach, co jest widoczne w postaci produkcji potomstwa wirusowego zakaźnego de novo na poziomie około 10-krotnie wyższym niż tło testu (Rysunek 2C). W ramach kontroli komórki Lunet N fuzjonowano z komórkami Lunet N. Co istotne, zaobserwowano jedynie bardzo niskie poziomy zakaźnego HCV, bliskie granicy wykrywalności. Podobne wyniki uzyskano po fuzji komórek Lunet N z naiwnymi komórkami Hep56.1D. W obu przypadkach brakowało ludzkiego CD81, przez co HCV nie mogło produktywnie zainfekować heterokaryonów. Bardzo niska zakaźność wykryta w tych dwóch ostatnich przypadkach jest prawdopodobnie przypisana niskiemu poziomowi infekcji komórek Lunet N i/lub niskim poziomom resztkowego zakaźnego wirusa z inokulum. W przeciwieństwie do nich, komórki HeLa i Hep56.1D hCD81 eksprimują ludzkie CD81, uzupełniając tym samym brakujący czynnik wnikania do komórki w heterokaryonach i umożliwiając wnikanie HCV do komórki. Zatem 10-krotnie zwiększony poziom zakaźnego HCV wykryty w medium heterokaryonów z udziałem tych dwóch linii komórkowych prawdopodobnie odzwierciedla produkcję cząstek zakaźnych de novo w heterokaryonach. W konsekwencji wyciągnięto wniosek, że ukończenie cyklu replikacyjnego HCV nie jest ograniczone, co wyklucza ekspresję dominujących czynników restrykcyjnych HCV w tych liniach komórkowych.

Proces fuzji wirusowo-komórkowej; schematy, wyniki mikroskopowe, test lucyferazy dla interakcji białek.
Rysunek 1. Trans-komplementacja montażu i uwalniania HCV w heterokaryonach. (A) Schematyczny przebieg procedury eksperymentalnej fuzji komórek indukowanej przez PEG. Replikon reporterowy lucyferazy JFH1 Luc-NS3-5B został przetransfekowany do naiwnych komórek Huh-7.5 drogą elektroporacji. Następnego dnia komórki oddzielono i współhodowano z komórkami naiwnymi lub komórkami pakującymi konstytutywnie eksprymującymi białka HCV core, E1, E2, p7 i NS2. 24 h po rozpoczęciu współhodowli indukowano tworzenie heterokaryonów poprzez traktowanie 40% PEG, stosując PBS jako kontrolę negatywną. Po 48 h pobrano supernatant wolny od komórek w celu inokulacji naiwnych komórek Huh-7.5. Zakaźność określono na podstawie aktywności lucyferazy. (B) W celu wykrycia heterokaryonów komórki poddano immunobarwieniu z użyciem przeciwciał monoklonalnych przeciwko E2 i NS5A. Jednoczesna ekspresja obu białek wewnątrz komórek świadczy o fuzji komórkowej. (C) Pomiary lucyferazy wykonano w celu ilościowego określenia zakaźności wirusów wytworzonych z heterokaryonów. Podano wartości średnie z trzech niezależnych eksperymentów oraz odchylenia standardowe średnich. Pozioma linia reprezentuje tło RLU określone w niezinfekowanych komórkach Huh-7.5. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększony rysunek.

Schemat procesu infekcji HCV z obrazowaniem komórek, transfekcją wirusową i analizą TCID<sub>50</sub>.
Rysunek 2. Uzupełnienie cyklu replikacji HCV po inokulacji heterokaryonów. (A) Schematyczny przegląd procedury eksperymentalnej. Komórki Huh-7 Lunet N pozbawione CD81 współhodowano z wskazanymi liniami komórkowymi pozbawionymi lub wykazującymi ekspresję ludzkiego CD81. Co ważne, te ostatnie komórki są pozbawione co najmniej jednego czynnika wejścia HCV, a zatem nie mogą zostać zainfekowane produktywnie. Następnego dnia fuzję zainicjowano poprzez transfekcję fusogennego białka otoczki wirusowej z PFV. Po trzydziestu godzinach komórki poddano działaniu zakaźnych cząsteczek HCV. Aby zmierzyć wejście komórkowe, replikację RNA i produkcję wirusa podtrzymywaną przez te heterokaryony, oznaczono zakaźność uwolnioną do wolnych od komórek płynów hodowlanych 48 h po inokulacji. W tym celu naiwne komórki Huh-7.5 wykorzystano jako komórki docelowe w teście rozcieńczeń ograniczających (TCID50). (B) W celu detekcji heterokaryonów komórki barwiono CellTracker Green lub CellTracker Orange na 6 h przed współhodowlą i transfekcją. Po trzydziestu godzinach komórki utrwalono i zbarwiono DAPI. (C) Komórki Lunet N fuzowano z komórkami HeLa, naiwnymi komórkami Hep56.1D lub komórkami Hep56.1D wykazującymi ekspresję ludzkiego CD81. Hodowle te inokulowano HCVcc (MOI wynoszące 2,3). Płyny hodowlane zebrano 48 h później, a uwalnianie cząsteczek de novo z heterokaryonów określono za pomocą TCID50 z użyciem naiwnych komórek docelowych Huh-7.5. Podano wartości średnie z trzech niezależnych eksperymentów. Pozioma belka reprezentuje granicę wykrywalności testu. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększony rysunek.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Przedstawiamy dwie metody indukcji tworzenia heterokaryonów w hodowlach komórkowych w celu analizy dominantnich ograniczeń negatywnych, które uniemożliwiają replikację HCV. Wykorzystując te procedury, wykluczyliśmy obecność dominantniego czynnika konstytutywnie ekspresowanego lub indukowanego przez wirusa w różnych ludzkich liniach komórkowych poza wątrobą oraz w mysich liniach komórkowych wątroby. Pierwszy test służy przede wszystkim do analizy, czy czynniki restrykcyjne zapobiegają składaniu HCV i uwalnianiu zakaźnego ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

TP otrzymał honoraria za usługi konsultingowe od firmy Biotest.

Podziękowania

Jesteśmy wdzięczni Takaji Wakicie oraz Jensowi Bukhowi odpowiednio za izolaty JFH1 i J6CF. Ponadto dziękujemy Charlesowi Rice’owi za komórki Huh-7.5 i przeciwciało 9E10, Stevenowi Foungowi za przeciwciało CBH-23 specyficzne dla E2 oraz wszystkim członkom Department of Experimental Virology, Twincore za pomocne sugestie i dyskusje.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
DMEMInvitrogen, Karlsruhe, Niemcy41965-039
L-glutaminaInvitrogen, Karlsruhe, Niemcy25030-024
Niezbędne aminokwasyInvitrogen, Karlsruhe, Niemcy11140-035
Penicylina/streptomycynaInvitrogen, Karlsruhe, Niemcy15140-122
Płodowa surowica bydlęcaPAA, Cölbe, NiemcyA15151
α-E2 (CBH23)uprzejmie udostępnione przez Stevena Founga 10
ATPSigma, Steinheim, NiemcyA2833-106
GlutationSigma, Steinheim, NiemcyG4251-1G
BlastycydynaInvivo Gen, San Diego, USAAnt-bl-1
G418 (genetycyna)Invitrogen, Karlsruhe, Niemcy11811-064
Glikol polietylenowy-1500Roche, Mannheim, Niemcy10783641001
ParaformaldehydRoth, Karlsruhe, Niemcy0335.3
Triton X-100Roth, Karlsruhe, Niemcy3051.2
Surowica koziaSigma, Steinheim, NiemcyG9023-5mL
α-NS5A (9E10)uprzejmie udostępnione przez Charlesa Rice'a 7
DAPI (4',6'-diamidino-2-fenyloindolu dichlorowodorek)InvitrogenD1306
Alexa-Fluor 546 - kozi anty-ludzki IgGInvitrogen, Karlsruhe, NiemcyA21089
Alexa-Fluor 488 - kozi anty-mysi IgGInvitrogen, Karlsruhe, NiemcyA10680
Lipofectamine 2000Invitrogen, Karlsruhe, Niemcy11668-019
CellTracker CMTMRInvitrogen, Karlsruhe, NiemcyC2927
CellTracker CMFDAInvitrogen, Karlsruhe, NiemcyC2925
FluoromountSigma, Steinheim, NiemcyF4680-25ML
Wszystkie pozostałe odczynniki chemiczneRoth, Karlsruhe, Niemcy
Materiały do hodowli komórkowejSarstedt, Nümbrecht, Niemcy

Bibliografia

  1. Zhu, Q., Guo, J. T., Seeger, C. Replication of hepatitis C virus subgenomes in nonhepatic epithelial and mouse hepatoma cells. J. Virol. 77, 9204-9210 (2003).
  2. Kato, T. Nonhepatic cell lines HeLa and 293 support efficient replication of the hepatitis C virus genotype 2a subgenomic replicon. J. Virol. 79, 592-596 (2005).
  3. Ali, S., Pellerin, C., Lamarre, D., Kukolj, G. Hepatitis C virus subgenomic replicons in the human embryonic kidney 293 cell line. J. Virol. 78, 491-501 (2004).
  4. Date, T. Genotype 2a hepatitis C virus subgenomic replicon can replicate in HepG2 and IMY-N9 cells. J. Biol. Chem. 279, 22371-22376 (2004).
  5. Chang, K. S. Replication of hepatitis C virus (HCV) RNA in mouse embryonic fibroblasts: protein kinase R (PKR)-dependent and PKR-independent mechanisms for controlling HCV RNA replication and mediating interferon activities. J. Virol. 80, 7364-7374 (2006).
  6. Zhong, J. Robust hepatitis C virus infection in vitro. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102, 9294-9299 (2005).
  7. Lindenbach, B. D. Complete replication of hepatitis C virus in cell culture. Science. 309, 623-626 (2005).
  8. Wakita, T. Production of infectious hepatitis C virus in tissue culture from a cloned viral genome. Nat. Med. 11, 791-796 (2005).
  9. Witteveldt, J. CD81 is dispensable for hepatitis C virus cell-to-cell transmission in hepatoma cells. J. Gen. Virol. 90, 48-58 (2009).
  10. Bitzegeio, J. Adaptation of hepatitis C virus to mouse CD81 permits infection of mouse cells in the absence of human entry factors. PLoS Pathog. 6, e1000978(2010).
  11. Lindemann, D., Goepfert, P. A. The foamy virus envelope glycoproteins. Curr Top Microbiol Immunol. 277, 111-129 (2003).
  12. Brohm, C. Characterization of determinants important for hepatitis C virus p7 function in morphogenesis by using trans-complementation. J. Virol. 83, 11682-11693 (2009).
  13. Steinmann, E., Brohm, C., Kallis, S., Bartenschlager, R., Pietschmann, T. Efficient trans-encapsidation of hepatitis C virus RNAs into infectious virus-like particles. J. Virol. 82, 7034-7046 (2008).
  14. Koutsoudakis, G. Characterization of the early steps of hepatitis C virus infection by using luciferase reporter viruses. J. Virol. 80, 5308-5320 (2006).
  15. Frentzen, A. Completion of hepatitis C virus replication cycle in heterokaryons excludes dominant restrictions in human non-liver and mouse liver cell lines. PLoS Pathog. 7, e1002029(2011).
  16. Lindemann, D. A particle-associated glycoprotein signal peptide essential for virus maturation and infectivity. J. Virol. 75, 5762-5771 (2001).
  17. Blight, K. J., McKeating, J. A., Rice, C. M. Highly permissive cell lines for subgenomic and genomic hepatitis C virus RNA replication. J. Virol. 76, 13001-13014 (2002).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

fuzja kom rekglikol polietylenowyprototypowy wirus pienistymikroskopia fluorescencyjnatest lucyferazymetoda rozcie cze ograniczaj cychczynniki wej cia HCVdominuj ce czynniki restrykcyjne

Powiązane artykuły