Niniejszy artykuł opisuje najpierw procedurę izolacji ludzkich komórek śródbłonka z żył pępkowych, a następnie pokazuje, jak wykorzystać te komórki do badania transmigracji neutrofili w warunkach przepływu. Dzięki zastosowaniu komory przepływowej o małej objętości, wykonanej z polimeru o właściwościach optycznych szkła, możliwe jest również obrazowanie fluorescencyjne żywych komórek rzadkich populacji komórkowych.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Izolacja ludzkich komórek śródbłonka żyły pępkowej oraz ich zastosowanie w badaniu transmigracji neutrofili w warunkach przepływu
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Neutrofile są najliczniejszym typem białych krwinek. Stanowią one kluczowy element wrodzonego układu odpornościowego1. Podczas ostrego stanu zapalnego neutrofile są pierwszymi komórkami zapalnymi migrującymi do miejsca uszkodzenia. Rekrutacja neutrofili do miejsca uszkodzenia jest procesem wieloetapowym, który obejmuje kolejno: rozszerzenie naczyń krwionośnych w celu zwiększenia przepływu krwi; zmiany strukturalne w naczyniach mikrokrwionośnych i ucieczkę białek osocza z krwiobiegu; toczenie, adhezję i transmigrację neutrofili przez endotelium; oraz gromadzenie się neutrofili w miejscu uszkodzenia2,3. Opracowano szeroki wachlarz metod in vivo i in vitro, które umożliwiają badanie tych procesów4. Niniejsza metoda koncentruje się na transmigracji neutrofili przez ludzkie komórki śródbłonka.
Jedną z popularnych metod badania procesów molekularnych zaangażowanych w transmigrację neutrofilów jest wykorzystanie neutrofilów ludzkich wchodzących w interakcję z pierwotnymi ludzkimi komórkami śródbłonka żyły pępkowej (HUVEC)5. Izolacja neutrofilów została opisana wizualnie w innym opracowaniu6; dlatego niniejszy artykuł przedstawi metodę izolacji HUVEC. Po izolacji i namnożeniu do stanu konfluencji komórki śródbłonka są aktywowane, co prowadzi do upregulacji cząsteczek adhezyjnych i aktywacyjnych. Na przykład aktywacja komórek śródbłonka cytokinami takimi jak TNF-α skutkuje zwiększoną ekspresją E-selektyny i IL-87. E-selektyna pośredniczy w wychwytywaniu i toczeniu się neutrofilów, natomiast IL-8 pośredniczy w ich aktywacji i trwałej adhezji. Po adhezji neutrofile transmigrują. Transmigracja może zachodzić parakomórkowo (poprzez połączenia między komórkami śródbłonka) lub transkomórkowo (poprzez samą komórkę śródbłonka). W większości przypadków interakcje te zachodzą w warunkach przepływu występujących w naczyniach krwionośnych7,8.
Komora przepływu z równoległymi płytkami jest powszechnie stosowanym systemem, który naśladuje hydrodynamiczne naprężenia ścinające występujące in vivo i umożliwia badanie rekrutacji neutrofili w warunkach przepływu in vitro9,10. Istnieje kilka firm produkujących komory przepływu z równoległymi płytkami, a każda z nich ma swoje zalety i wady. Jeśli wymagane jest obrazowanie fluorescencyjne, należy zastosować szkło lub polimer o podobnych właściwościach optycznych. Komórki śródbłonka nie rosną dobrze na szkle.
Przedstawiamy prostą i szybką metodę obrazowania w kontraście fazowym, DIC oraz fluorescencyjnym procesu transmigracji neutrofili z wykorzystaniem niskowolumenowego szkiełka z kanałem ibidi, wykonanego z polimeru, który wspomaga szybką adhezję i wzrost ludzkich komórek śródbłonka oraz posiada właściwości optyczne porównywalne ze szkłem. W tej metodzie komórki śródbłonka były hodowane i stymulowane w mikroprzewodzie ibidi μslide. Neutrofile wprowadzano w warunkach przepływu, a następnie oceniano transmigrację. Fluorescencyjne obrazowanie połączeń umożliwiło w czasie rzeczywistym określenie zakresu transmigracji parakomórkowej w stosunku do transkomórkowej.
Protokół
1. Izolacja i hodowla ludzkich komórek śródbłonka naczyniowego
- Podczas pracy z ludzką krwią i tkankami należy stosować procedury bezpieczeństwa biologicznego poziomu 2. Za pomocą nożyczek odetnij pępowinę od łożyska, a następnie dokładnie sprawdź pępowinę pod kątem zakrzepów krwi oraz uszkodzeń powstałych w wyniku zaciskania pępowiny podczas porodu. Wytnij i wyrzuć te fragmenty pępowiny.
- Przygotuj świeży roztwór kolagenazy o stężeniu 1 mg/ml, wlewając 50 ml ciepłego buforu do pępowiny do probówki zawierającej 50 mg kolagenazy.
- Załóż sterylne rękawiczki i w komorze z laminarnym przepływem powietrza otwórz autoklawowaną tacę z narzędziami zawierającą wysterylizowane kaniule tępe, zaciski do pępowiny, nożyczki, kurki trójdrożne oraz gazę.
- Zidentyfikuj dwie tętnice i jedną żyłę znajdujące się w pępowinie. Tętnice są mniejsze i mają tendencję do silnego skurczu, podczas gdy żyła jest duża i łatwa do kaniulacji. Aby wypłukać krew z żyły, delikatnie wprowadź do jednego końca żyły kaniulę z przymocowaną kurkiem dwudrożnym i załóż zacisk na kaniulę, aby mocno utrzymać ją w pozycji. Przelej bufor do pępowiny przez żyłę. Powtarzaj czynność, aż wypływ będzie przejrzysty, a następnie zacisznij koniec pępowiny.
- Wprowadź kolagenazę do żyły, zamknij kurek, umieść pępowinę w zlewce zawierającej ciepły bufor do pępowiny i inkubuj przez 10 minut. Po 10 minutach wyjmij pępowinę i delikatnie ją masuj, aby poluzować komórki śródbłonka z światła żyły. Zlej roztwór do probówki zawierającej pożywkę do komórek śródbłonka (ECM). Przepłucz dwukrotnie buforem do pępowiny, aby usunąć pozostałe komórki. Zlej roztwór do tej samej probówki.
- Wirować komórki przy 350 x g przez 10 minut, aby uzyskać osad komórek śródbłonka.
- Usuń nadsącz i dodaj 10 ml ECM do osadu. Delikatnie resuspenduj komórki w ECM, a następnie przenieś komórki do kolby T75 uprzednio pokrytej 0,2% żelatyną. Pokrywanie żelatyną powinno być przeprowadzone przez co najmniej 1 godzinę w temperaturze 37 °C. Hoduj komórki w 37 °C i 5% CO2.
- Następnego dnia delikatnie potrząśnij kolbą, aby odłączyć ewentualne erytrocyty, następnie usuń nadsącz i przemyj ciepłym zrównoważonym roztworem soli Hanksa (HBSS). Usuń HBSS i zasil komórki 10 ml ciepłego ECM. Obejrzyj komórki pod mikroskopem, aby upewnić się, że erytrocyty zostały usunięte. Oceń stopień konfluencji i morfologię komórek śródbłonka. Komórki śródbłonka na tym etapie powinny być wydłużone i nie wykazywać obecności wakuol.
- Kontynuuj wymianę pożywki co trzy dni, aż komórki osiągną konfluencję, a następnie podziel komórki, używając 0,08% roztworu trypsyny zawierającego 1mM EDTA. Wysiej komórki śródbłonka do odpowiednich naczyń uprzednio pokrytych 0,2% żelatyną. Komórki powinny osiągnąć konfluencję w ciągu 3-6 dni.
- Przy użyciu komór ibidi, pokryj każdą komorę 0,2% żelatyną. Usuń nadmiar żelatyny i fibronektyny, a następnie dodaj do komory 1,5 X 106/mL komórek śródbłonka zawieszonych w ECM. Wymieniaj pożywkę co drugi dzień aż do uzyskania konfluencji. Komórki powinny osiągnąć konfluencję w ciągu 2-3 dni, w zależności od pępowiny.
2. Przygotowanie neutrofili
- Neutrofile wyizolowano z krwi obwodowej zdrowych ochotników za pomocą wirowania gęstościowego. Szczegółowy protokół wraz z demonstracją wizualną izolacji neutrofili znajduje się w poprzednim numerze tego czasopisma 6. Po izolacji należy zawiesić neutrofile w stężeniu 1x106/mL w buforze HBSS zawierającym 0,5% albuminy ludzkiej.
3. Przygotowanie komory Ibidi
- Hoduj komórki śródbłonka w komorze ibidi pokrytej żelatyną. Badaj je codziennie za pomocą mikroskopii fazokontrastowej, aż staną się ściśle konfluentne.
- Stymuluj komórki śródbłonka w celu zwiększenia ekspresji cząsteczek adhezji i aktywacji. Na potrzeby niniejszego protokołu komórki śródbłonka stymulowano rekombinowanym TNF-α w stężeniu 10 ng/mL przez cztery godziny w temperaturze 37 °C i 5% CO2 przed przygotowaniem komory ibidi do obrazowania w warunkach przepływu.
- Przygotuj mikroskop oraz pompę strzykawkową zgodnie z opisem wizualnym przedstawionym przez Wiese i współpracowników 11, używając pustej komory ibidi.
- Kluczowe różnice między niniejszym protokołem a procedurą Wiese obejmują uprzednie napełnienie rurek w celu zapobiegania wystawieniu komórek śródbłonka na działanie powietrza, utrzymywanie buforu w temperaturze 37 °C za pomocą łaźni wodnej, stosowanie rurek PharMed, aby zapobiec utracie temperatury buforu, oraz używanie różnych obiektywów mikroskopu w zależności od tego, czy obrazowanie odbywa się w kontraście fazowym, czy fluorescencyjnym.
- Po skonfigurowaniu mikroskopu i napełnieniu rurek roztworem HBSS, zamknij wszystkie kurki i usuń pustą komorę ibidi.
- Podłącz do rurek komorę ibidi zawierającą stymulowane TNF-α komórki śródbłonka.
4. Rekrutacja i transmigracja neutrofili
- Zwizualizuj monowarstwę komórek śródbłonka pod mikroskopem, używając obiektywu z kontrastem fazowym 10x.
- Ustaw pompę strzykawkową na pobieranie i rozpocznij przepływ HBSS z pożądanym naprężeniem ścinającym (zazwyczaj od 0,5 do 2 dyn/cm2).
- Po stronie wlotowej przełącz przepływ z HBSS na izolowane neutrofile (1x106/mL), obracając trójdrożny kurek.
- Rozpocznij rejestrację za pomocą kamery CCD podłączonej do rejestratora DVD lub bezpośrednio do komputera. Uruchom stoper w momencie, gdy neutrofile wpłyną do komory. Perfunduj neutrofile przez cztery minuty. Do jednego eksperymentu wystarcza łącznie 3 mL zawiesiny neutrofili.
- Po czterech minutach przełącz przepływ z powrotem na HBSS, aby zapobiec przywieraniu nowych neutrofili. Jeśli wymagane są dane dotyczące całkowitego oddziaływania, toczenia się (rolling) i silnej adhezji, zarejestruj obrazy 6 losowych pól przez 10 sekund każde, używając obiektywu z kontrastem fazowym 10x pomiędzy 4. a 5. minutą.
- Przełącz na obiektyw 40x i zarejestruj pojedyncze pole widzenia między 5. a 10. minutą. W 10. minucie zarejestruj od 5 do 10 losowych pól widzenia.
- Zatrzymaj przepływ i przejdź do następnej komory.
5. Obrazowanie fluorescencyjne w warunkach przepływu z użyciem komory Ibidi
- Oznakuj komórki śródbłonka lub neutrofile wybraną sondą fluorescencyjną. Na przykład, do wizualizacji połączeń międzykomórkowych śródbłonka można zastosować przeciwciało anty-VE-cadherin sprzężone z Alexa-[547].
- Zamontuj komorę ibidi na mikroskopie z możliwością obrazowania w kontraście interferencyjnym (DIC) oraz fluorescencyjnym. Wykorzystujemy konfokalny mikroskop FluoView 1000 (Olympus) z komorą środowiskową. Ustaw ostrość, używając obiektywu przeznaczonego do pracy w DIC i fluorescencji.
- Rejestruj jednoczesne obrazy DIC i fluorescencyjne przy użyciu oprogramowania dostarczonego przez producenta, stosując przebieg czasowy opisany w sekcji 4.
6. Analiza rekrutacji neutrofilów
- Analiza komórek toczących się i oddziałujących została opisana przez Wiese et al11.
- Aby zmierzyć odsetek neutrofili toczących się po monowarstwie śródbłonka, należy policzyć liczbę neutrofili, które przemieściły się o więcej niż jedną średnicę komórki w czasie 5 sekund. Liczbę tę należy podzielić przez całkowitą liczbę leukocytów w polu widzenia, aby wyznaczyć procent komórek toczących się. Z kolei pozostałe komórki uznaje się za silnie przylegające.
- Prędkość toczenia się neutrofili mierzy się poprzez obliczenie dystansu, jaki neutrofil pokonał w określonym przedziale czasu, a następnie podzielenie go przez ten czas wyrażony w sekundach.
- Transmigrację określa się poprzez policzenie liczby neutrofili, które zmieniły kształt i migrowały pod monowarstwę10. Neutrofile te rozpoznaje się po tym, że zmieniają się z jasnych w kontrastowym obrazie fazowym, gdy znajdują się na powierzchni monowarstwy, na ciemne, gdy znajdują się pod nią10. Liczbę komórek, które uległy transmigracji, można wyrazić jako procent całkowitej liczby komórek w polu widzenia lub jako surową liczbę komórek transmigrowanych na jednostkę powierzchni. W tym systemie modelowym zazwyczaj 50% neutrofili ulega transmigracji po 10 minutach.
7. Reprezentatywne wyniki
Niepobudzone komórki śródbłonka nie wspierają rekrutacji neutrofili. W przeciwieństwie do tego, stymulacja komórek śródbłonka za pomocą TNF-α prowadzi do toczenia się neutrofili, ich trwałej adhezji oraz transmigracji. Przykład tych danych przedstawiono na Rysunkach 1 i 2. Rysunek 1A przedstawia neutrofile wchodzące w interakcje z komórkami śródbłonka stymulowanymi TNF-α. Interakcje te można poddać kwantyfikacji, co pozwala określić całkowitą liczbę neutrofili oddziałujących z komórkami śródbłonka, a także liczbę neutrofili toczących się, trwale przyległych lub transmigrowanych (Rysunek 2). Transmigracja neutrofili może zachodzić w obrębie połączeń międzykomórkowych lub bezpośrednio przez komórki śródbłonka. Aby rozróżnić te dwa warianty, komórki śródbłonka znakuje się przeciwciałem anty-VE-kadheryna, a transmigrację ocenia się jako parakomórkową lub transkomórkową (Rysunek 1B i C). W tym modelu niemal cała transmigracja ma charakter parakomórkowy7.
Rycina 1. Symultaniczne obrazowanie DIC i fluorescencyjne w warunkach przepływu z użyciem komory ibidi. (A) Obraz DIC świeżo wyizolowanych ludzkich neutrofili migrujących przez ludzkie komórki śródbłonka żyły pępkowej. Żółta grot strzałki wskazuje adherentnego neutrofila; biała grot strzałki wskazuje neutrofila w trakcie transmigracji. (B) Złącza komórek śródbłonka zostały zabarwione przeciwciałem anty-VE-cadherin sprzężonym z Alexa-[547] i zobrazowane. (C) Nałożenie kanałów A i B wykazuje, że w tym modelu niemal cała transmigracja ma charakter parakomórkowy. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną rycinę.
Rysunek 2. Komórki śródbłonka pozostawiono bez stymulacji lub stymulowano 10 ng/mL TNF-α. Po 4 godzinach zamontowano komorę przepływową z równoległymi płytkami i przeprowadzono perfuzję neutrofili przy wartości 1 dyn/cm2. (A) Oddziaływania neutrofili badano i mierzono przy użyciu oprogramowania ImageJ z NIH. Całkowitą liczbę oddziałujących komórek określono jako (B) toczące się, silnie przylegające lub (C) transmigrujące. Dane przedstawiają średnią + SEM z 3 do 5 eksperymentów. Różnica między grupą kontrolną a grupą z TNF na panelach A i C była istotna (p<0.001).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Badacze rutynowo wykorzystują komórki śródbłonka z różnych łożysk naczyniowych do badania rekrutacji i transmigracji neutrofili. Przykłady obejmują, między innymi, komórki śródbłonka mikrońaczyniowego skóry12, komórki śródbłonka zatok wątrobowych13 oraz komórki śródbłonka z ludzkiej żyły pępowinowej10. Wśród nich HUVEC zyskały szeroką popularność ze względu na względną łatwość izolacji i dostępność. HUVEC stanowią potężny system modelowy in vitro, który naśladuje wiele procesów ś...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Nie zadeklarowano żadnych konfliktów interesów.
Podziękowania
Dziękujemy dr Pinie Colarusso oraz Live Cell Imaging Facility za pomoc w obrazowaniu i analizie obrazów; pani Lailey za pomoc techniczną; oraz oddziałowi 51 w szpitalu Foothills w Calgary, AB za dostarczenie ludzkich pępowin. Dr K.D. Patel jest naukowcem w ramach Alberta Innovates: Health Solutions. Praca ta była wspierana przez grant operacyjny z Canadian Institutes for Health Research oraz granty na sprzęt i infrastrukturę z Canadian Foundation for Innovation i Alberta Science and Research Authority.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Kolagenaza typu 1 | Worthington | 4197 | |
| Bufor do pępowiny | Skład: 140 mM NaCl 4 mM KCl 10 mM D-glukozy w 1mM buforze NaH2PO4/Na2HPO4 o pH 7,4 | ||
| Pożywka do komórek śródbłonka (ECM) | M199 z solami Eagle uzupełniona o 16% surowicy ludzkiej zawierającej 100 jednostek penicyliny, 100 μg streptomycyny i 0,3 mg L-glutaminy/ml | ||
| M199 | GIBCO | 31100-035 | |
| Penicylina Streptomycyna Glutaminian (100X) | Invitrogen | 10378-016 | |
| Komory Ibidi | Ibidi | 80606 | |
| TNF-α | Prepro Tech | 300-01A | |
| 20% roztwór albuminy ludzkiej | Gemini Bioproducts | 800120050 | |
| HBSS bez Ca2+ i Mg2+ | Sigma | H2487-10X | |
| HBSS z Ca2+ i Mg2+ | Sigma | H1387-10X |
Bibliografia
- Nathan, C. Neutrophils and immunity: challenges and opportunities. Nat. Rev. Immunol. 6, 173-182 (2006).
- Diacovo, T. G. Neutrophil rolling, arrest, and transmigration across activated, surface-adherent platelets via sequential action of P-selectin and the beta 2-integrin CD11b/CD18. Blood. 88, 146-157 (1996).
- Ley, K. Getting to the site of inflammation: the leukocyte adhesion cascade updated. Nat. Rev. Immunol. 7, 678-689 (2007).
- Petri, B. Endothelial LSP1 is involved in endothelial dome formation, minimizing vascular permeability changes during neutrophil transmigration in vivo. Blood. 117, 942-952 (2011).
- Chavakis, T. The junctional adhesion molecule-C promotes neutrophil transendothelial migration in vitro and in vivo. J. Biol. Chem. 279, 55602-55608 (2004).
- Oh, H., Siano, B., Diamond, S. Neutrophil Isolation Protocol. J. Vis. Exp. (17), e745(2008).
- Liu, Y. Regulation of leukocyte transmigration: cell surface interactions and signaling events. J. Immunol. 172, 7-13 (2004).
- Alcaide, P. Neutrophil recruitment under shear flow: it's all about endothelial cell rings and gaps. Microcirculation. 16, 43-57 (2009).
- Jutila, M. A. Measurement of neutrophil adhesion under conditions mimicking blood flow. Neutrophil Methods and Protocols. 412, 239-256 (2007).
- Cuvelier, S. L., Patel, K. D. Studying leukocyte rolling and adhesion in vitro under flow conditions. Basic Cell Culture Protocols. 290, 331-342 (2005).
- Wiese, G., Barthel, S. R., Dimitroff, C. J. Analysis of Physiologic E-Selectin-Mediated Leukocyte Rolling on Microvascular Endothelium. J. Vis. Exp. (24), e1009(2009).
- Petzelbauer, P. Heterogeneity of dermal microvascular endothelial cell antigen expression and cytokine responsiveness in situ and in cell culture. J. Immunol. 151, 5062-5072 (1993).
- Bonder, C. S., Kubes, P. Modulating leukocyte recruitment to splanchnic organs to reduce inflammation. Am J Phys - Gastrointestinal and Liver Phys. 284, G729-G733 (2003).
- Cuvelier, S. L. Eosinophil adhesion under flow conditions activates mechanosensitive signaling pathways in human endothelial cells. J. Exp. Med. 202, 865-876 (2005).
- Massia, S. P., Hubbell, J. A. Human endothelial cell interactions with surface-coupled adhesion peptides on a nonadhesive glass substrate and two polymeric biomaterials. J. Biomed. Mat. Res. 25, 223-242 (1991).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
