Izolacja ludzkich komórek śródbłonka żyły pępkowej oraz ich zastosowanie w badaniu transmigracji neutrofili w warunkach przepływu

Podsumowanie

Niniejszy artykuł opisuje najpierw procedurę izolacji ludzkich komórek śródbłonka z żył pępkowych, a następnie pokazuje, jak wykorzystać te komórki do badania transmigracji neutrofili w warunkach przepływu. Dzięki zastosowaniu komory przepływowej o małej objętości, wykonanej z polimeru o właściwościach optycznych szkła, możliwe jest również obrazowanie fluorescencyjne żywych komórek rzadkich populacji komórkowych.

Streszczenie

Neutrofile są najliczniejszym typem białych krwinek. Stanowią one kluczowy element wrodzonego układu odpornościowego¹. Podczas ostrego stanu zapalnego neutrofile są pierwszymi komórkami zapalnymi migrującymi do miejsca uszkodzenia. Rekrutacja neutrofili do miejsca uszkodzenia jest procesem wieloetapowym, który obejmuje kolejno: rozszerzenie naczyń krwionośnych w celu zwiększenia przepływu krwi; zmiany strukturalne w naczyniach mikrokrwionośnych i ucieczkę białek osocza z krwiobiegu; toczenie, adhezję i transmigrację neutrofili przez endotelium; oraz gromadzenie się neutrofili w miejscu uszkodzenia^2,3. Opracowano szeroki wachlarz metod in vivo i in vitro, które umożliwiają badanie tych procesów⁴. Niniejsza metoda koncentruje się na transmigracji neutrofili przez ludzkie komórki śródbłonka.

Jedną z popularnych metod badania procesów molekularnych zaangażowanych w transmigrację neutrofilów jest wykorzystanie neutrofilów ludzkich wchodzących w interakcję z pierwotnymi ludzkimi komórkami śródbłonka żyły pępkowej (HUVEC)⁵. Izolacja neutrofilów została opisana wizualnie w innym opracowaniu⁶; dlatego niniejszy artykuł przedstawi metodę izolacji HUVEC. Po izolacji i namnożeniu do stanu konfluencji komórki śródbłonka są aktywowane, co prowadzi do upregulacji cząsteczek adhezyjnych i aktywacyjnych. Na przykład aktywacja komórek śródbłonka cytokinami takimi jak TNF-α skutkuje zwiększoną ekspresją E-selektyny i IL-8⁷. E-selektyna pośredniczy w wychwytywaniu i toczeniu się neutrofilów, natomiast IL-8 pośredniczy w ich aktywacji i trwałej adhezji. Po adhezji neutrofile transmigrują. Transmigracja może zachodzić parakomórkowo (poprzez połączenia między komórkami śródbłonka) lub transkomórkowo (poprzez samą komórkę śródbłonka). W większości przypadków interakcje te zachodzą w warunkach przepływu występujących w naczyniach krwionośnych^7,8.

Komora przepływu z równoległymi płytkami jest powszechnie stosowanym systemem, który naśladuje hydrodynamiczne naprężenia ścinające występujące in vivo i umożliwia badanie rekrutacji neutrofili w warunkach przepływu in vitro^9,10. Istnieje kilka firm produkujących komory przepływu z równoległymi płytkami, a każda z nich ma swoje zalety i wady. Jeśli wymagane jest obrazowanie fluorescencyjne, należy zastosować szkło lub polimer o podobnych właściwościach optycznych. Komórki śródbłonka nie rosną dobrze na szkle.

Przedstawiamy prostą i szybką metodę obrazowania w kontraście fazowym, DIC oraz fluorescencyjnym procesu transmigracji neutrofili z wykorzystaniem niskowolumenowego szkiełka z kanałem ibidi, wykonanego z polimeru, który wspomaga szybką adhezję i wzrost ludzkich komórek śródbłonka oraz posiada właściwości optyczne porównywalne ze szkłem. W tej metodzie komórki śródbłonka były hodowane i stymulowane w mikroprzewodzie ibidi μslide. Neutrofile wprowadzano w warunkach przepływu, a następnie oceniano transmigrację. Fluorescencyjne obrazowanie połączeń umożliwiło w czasie rzeczywistym określenie zakresu transmigracji parakomórkowej w stosunku do transkomórkowej.

Protokół

1. Izolacja i hodowla ludzkich komórek śródbłonka naczyniowego

1. Podczas pracy z ludzką krwią i tkankami należy stosować procedury bezpieczeństwa biologicznego poziomu 2. Za pomocą nożyczek odciąć pępowinę od łożyska, a następnie dokładnie zbadać pępowinę pod kątem obecności skrzepów krwi oraz uszkodzeń spowodowanych zaciskaniem pępowiny podczas porodu. Wyciąć i odrzucić te fragmenty pępowiny.
2. Przygotować świeży roztwór kolagenazy o stężeniu 1 mg/ml, wlewając 50 ml ciepłego buforu do pępowiny do probówki zawierającej 50 mg kolagenazy.
3. Założyć sterylne rękawiczki i w komorze z laminarnym przepływem powietrza otworzyć autoklawowaną tacę z narzędziami zawierającą sterylizowane kaniule tępokrawędziste, zaciski do pępowiny, nożyczki, kurki trójdrożne i gazę.
4. Zidentyfikować dwie tętnice i jedną żyłę znajdujące się w pępowinie. Tętnice są mniejsze i mają tendencję do silnego kurczenia się, podczas gdy żyła jest duża i łatwa do kaniulowania. Aby wypłukać krew z żyły, delikatnie wprowadzić do jednego końca żyły kaniulę z przymocowaną kurką dwudrożną i założyć zacisk wokół kaniuli, aby mocno utrzymać ją w pozycji. Przeperfundować żyłę buforem do pępowiny. Powtarzać czynność do momentu uzyskania klarownego przepływu, a następnie zacisnąć koniec pępowiny.
5. Wprowadzić kolagenazę do żyły, zamknąć kurkę, umieścić pępowinę w zlewce z ciepłym buforem do pępowiny i inkubować przez 10 minut. Po 10 minutach wyjąć pępowinę i delikatnie ją masować, aby oddzielić komórki śródbłonka z światła żyły. Zlać roztwór do probówki zawierającej pożywkę do komórek śródbłonka (ECM). Wypłukać dwukrotnie buforem do pępowiny, aby usunąć pozostałe komórki. Zlać roztwór do tej samej probówki.
6. Odwirować komórki przy 350 x g przez 10 minut w celu osadzenia komórek śródbłonka.
7. Usunąć nadosad i dodać 10 ml ECM do osadu. Delikatnie resuspender komórki w ECM, a następnie przenieść komórki do kolby T75 uprzednio powleczonej 0,2% żelatyną. Powlekanie żelatyną powinno trwać co najmniej 1 godzinę w temperaturze 37 °C. Hodować komórki w temperaturze 37 °C i 5% CO₂.
8. Następnego dnia delikatnie potrząsnąć kolbą, aby usunąć ewentualne erytrocyty, następnie usunąć nadosad i przemyć ciepłym zrównoważonym roztworem soli Hank'a (HBSS). Usunąć HBSS i nakarmić komórki 10 ml ciepłego ECM. Zbadać komórki pod mikroskopem, aby upewnić się, że erytrocyty zostały usunięte. Ocenić stopień konfluencji i morfologię komórek śródbłonka. Komórki śródbłonka na tym etapie powinny być wydłużone i nie wykazywać obecności wakuol.
9. Kontynuować wymianę pożywki co trzy dni, aż komórki osiągną konfluencję, a następnie podzielić komórki, używając 0,08% roztworu trypsyny zawierającego 1mM EDTA. Wysiać komórki śródbłonka do odpowiednich naczyń uprzednio powleczonych 0,2% żelatyną. Komórki powinny osiągnąć konfluencję w ciągu 3-6 dni.
10. Podczas korzystania z komór ibidi, każdą komorę należy uprzednio powlec 0,2% żelatyną. Usunąć nadmiar żelatyny i fibronektyny, a następnie wprowadzić do komory 1,5 X 10⁶/mL komórek śródbłonka zawieszonych w ECM. Wymieniać pożywkę co drugi dzień aż do uzyskania konfluencji. Komórki powinny stać się konfluentne w ciągu 2-3 dni, w zależności od pępowiny.

2. Przygotowanie neutrofili

1. Neutrofile wyizolowano z krwi obwodowej zdrowych ochotników przy użyciu wirowania gęstościowego. Szczegółowy protokół wraz z demonstracją wizualną izolacji neutrofili znajduje się w poprzednim numerze tego czasopisma ⁶. Po izolacji neutrofile resuspendowano w stężeniu 1x10⁶/mL w HBSS zawierającym 0,5% albuminy ludzkiej.

3. Przygotowanie komory Ibidi

1. Hodować komórki śródbłonka w komorze ibidi powlekonej żelatyną. Obserwować je codziennie za pomocą mikroskopii w kontraście fazowym aż do uzyskania pełnej konfluencji.
2. Stymulować komórki śródbłonka w celu zwiększenia ekspresji cząsteczek adhezyjnych i aktywacyjnych. Na potrzeby niniejszego protokołu komórki śródbłonka stymulowano 10 ng/mL rekombinowanego TNF-α przez cztery godziny w temperaturze 37 °C i 5% CO₂ przed przygotowaniem komory ibidi do obrazowania w warunkach przepływu.
3. Przygotować mikroskop oraz pompę strzykawkową, zgodnie z opisem wizualnym Wiese i współpracowników ¹¹, używając pustej komory ibidi.
4. Kluczowe różnice między tym protokołem a procedurą Wiese obejmują wstępne napełnienie przewodów w celu zapobiegania ekspozycji komórek śródbłonka na powietrze, utrzymywanie buforu w temperaturze 37 °C za pomocą kąpieli wodnej, zastosowanie przewodów PharMed, aby zapobiec utracie temperatury buforu, oraz użycie różnych obiektywów mikroskopu w zależności od tego, czy obrazowanie odbywa się w kontraście fazowym, czy fluorescencyjnym.
5. Po przygotowaniu mikroskopu i napełnieniu przewodów buforem HBSS, zamknąć wszystkie kurki i usunąć pustą komorę ibidi.
6. Podłączyć do przewodów komorę ibidi zawierającą stymulowane TNF-α komórki śródbłonka.

4. Rekrutacja i transmigracja neutrofili

1. Wizualizuj monowarstwę komórek śródbłonka pod mikroskopem, używając obiektywu fazowego 10x.
2. Ustaw pompę strzykawkową na pobieranie i rozpocznij przepływ HBSS z pożądanym naprężeniem ścinającym (zazwyczaj od 0,5 do 2 dyn/cm²).
3. Po stronie wlotowej przełącz z HBSS na izolowane neutrofile (1x10⁶/mL), obracając trójdrożny kran.
4. Rozpocznij rejestrację obrazu za pomocą kamery CCD podłączonej do rejestratora DVD lub bezpośrednio do komputera. Uruchom stoper w momencie, gdy neutrofile wpłyną do komory. Perfunduj neutrofile przez cztery minuty. Do jednego eksperymentu wystarczy łącznie 3 mL zawiesiny neutrofili.
5. Po czterech minutach przełącz z powrotem na HBSS, aby zapobiec przywieraniu nowych neutrofili. Jeśli wymagane są dane dotyczące całkowitej liczby interakcji, toczenia się i trwałej adhezji, obrazuj 6 losowych pól przez 10 sekund każde, używając obiektywu fazowego 10x między 4. a 5. minutą.
6. Przełącz na obiektyw 40x i zarejestruj jedno pole widzenia między 5. a 10. minutą. W 10. minucie zgromadź od 5 do 10 losowych pól widzenia.
7. Zatrzymaj przepływ i przejdź do następnej komory.

5. Obrazowanie fluorescencyjne w warunkach przepływu z użyciem komory Ibidi

1. Oznakuj komórki śródbłonka lub neutrofile wybraną sondą fluorescencyjną. Na przykład do wizualizacji połączeń komórek śródbłonka można użyć przeciwciała anty-VE-kadheryna sprzężonego z Alexa-[547].
2. Zamocuj komorę ibidi na mikroskopie z możliwością obrazowania w kontraście fazowym (DIC) oraz fluorescencyjnym. Wykorzystujemy konfokalny mikroskop FluoView 1000 (Olympus) z komorą inkubacyjną. Ustaw ostrość, korzystając z obiektywu przeznaczonego do pracy w DIC i fluorescencji.
3. Nabywaj jednoczesne obrazy DIC i fluorescencyjne przy użyciu oprogramowania dostarczonego przez producenta, stosując harmonogram czasowy opisany w sekcji 4.

6. Analiza rekrutacji neutrofili

1. Analiza komórek toczących się i oddziałujących została opisana przez Wiese et al¹¹.
2. Aby zmierzyć procent neutrofili toczących się po monowarstwie śródbłonka, należy policzyć liczbę neutrofili, które przemieściły się o więcej niż jedną średnicę komórki w ciągu 5 sekund. Liczbę tę należy podzielić przez całkowitą liczbę leukocytów w polu widzenia, aby wyznaczyć procent komórek toczących się. W konsekwencji pozostałe komórki uznaje się za silnie przylegające.
3. Prędkość toczenia się neutrofili mierzy się poprzez obliczenie odległości, jaką neutrofil przebył w określonym przedziale czasu, a następnie podzielenie tej wartości przez czas podany w sekundach.
4. Transmigrację określa się poprzez policzenie liczby neutrofili, które zmieniły kształt i przemieściły się pod monowarstwę¹⁰. Neutrofile te rozpoznaje się po tym, że zmieniają one jasność w kontraście fazowym z jasnej (gdy znajdują się na powierzchni monowarstwy) na ciemną (gdy znajdują się pod monowarstwą)¹⁰. Liczbę komórek, które uległy transmigracji, można wyrazić jako procent całkowitej liczby komórek w polu widzenia lub jako bezwzględną liczbę komórek transmigrowanych na jednostkę powierzchni. W tym modelu systemowym zazwyczaj 50% neutrofili transmigruje po 10 minutach.

7. Reprezentatywne wyniki

Niepobudzone komórki śródbłonka nie wspomagają rekrutacji neutrofili. Z kolei stymulacja komórek śródbłonka TNF-α prowadzi do toczenia się neutrofili, ich trwałej adhezji oraz transmigracji. Przykład tych danych przedstawiono na Rycynach 1 i 2. Rycina 1A przedstawia neutrofile oddziałujące z komórkami śródbłonka stymulowanymi TNF-α. Oddziaływania te można poddać kwantyfikacji, co pozwala określić całkowitą liczbę neutrofili oddziałujących z komórkami śródbłonka, a także liczbę neutrofili toczących się, trwale przytwierdzonych lub transmigrowanych (Rycina 2). Transmigracja neutrofili może zachodzić w połączeniach międzykomórkowych lub bezpośrednio przez komórki śródbłonka. Aby rozróżnić te dwa mechanizmy, komórki śródbłonka znakuje się przeciwciałem anty-VE-cadherin, a następnie ocenia się, czy transmigracja odbywa się drogą parakomórkową czy transkomórkową (Rycina 1B i C). W tym modelu niemal cała transmigracja ma charakter parakomórkowy⁷.

Rysunek 1. Jednoczesne obrazowanie DIC i fluorescencyjne w warunkach przepływu z zastosowaniem komory ibidi. (A) Obraz DIC świeżo wyizolowanych ludzkich neutrofili migrujących przez ludzkie komórki śródbłonka żyły pępkowej. Żółta grotówka wskazuje neutrofil przylegający; biała grotówka wskazuje neutrofil w trakcie transmigracji. (B) Złącza komórek śródbłonka zostały zabarwione przeciwciałem anty-VE-kadheryna skoniugowanym z Alexa-[547], a następnie poddane obrazowaniu. (C) Nałożenie kanałów A i B wykazuje, że niemal cała transmigracja w tym modelu ma charakter parakomórkowy. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większy rysunek.

Rycina 2. Komórki śródbłonka pozostawiono bez stymulacji lub stymulowano 10 ng/mL TNF-α. Po 4 godzinach zmontowano komorę przepływową z równoległymi płytkami i przeprowadzono perfuzję neutrofili przy wartości 1 dyn/cm². (A) Interakcje neutrofili badano i mierzono przy użyciu oprogramowania ImageJ z NIH. Całkowitą liczbę oddziałujących komórek podzielono na: (B) toczące się, silnie przylegające lub (C) transmigrujące. Dane przedstawiają średnią + SEM z 3 do 5 doświadczeń. Różnica między grupą kontrolną a grupą TNF na panelach A i C była istotna (p<0.001).

Dyskusja

Badacze rutynowo wykorzystują komórki śródbłonka z różnych łożysk naczyniowych do badania rekrutacji i transmigracji neutrofili. Przykłady obejmują, między innymi, komórki śródbłonka mikrońaczyniowego skóry¹², komórki śródbłonka zatok wątrobowych¹³ oraz komórki śródbłonka z ludzkiej żyły pępowinowej¹⁰. Wśród nich HUVEC zyskały szeroką popularność ze względu na względną łatwość izolacji i dostępność. HUVEC stanowią potężny system modelowy in vitro, który naśladuje wiele procesów ś...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Kolagenaza typu 1	Worthington	4197
Bufor do pępowiny			Skład: 140 mM NaCl 4 mM KCl 10 mM D-glukozy w 1mM buforze NaH2PO4/Na2HPO4 o pH 7,4
Pożywka do komórek śródbłonka (ECM)			M199 z solami Eagle uzupełniona o 16% surowicy ludzkiej zawierającej 100 jednostek penicyliny, 100 μg streptomycyny i 0,3 mg L-glutaminy/ml
M199	GIBCO	31100-035
Penicylina Streptomycyna Glutaminian (100X)	Invitrogen	10378-016
Komory Ibidi	Ibidi	80606
TNF-α	Prepro Tech	300-01A
20% roztwór albuminy ludzkiej	Gemini Bioproducts	800120050
HBSS bez Ca2+ i Mg2+	Sigma	H2487-10X
HBSS z Ca2+ i Mg2+	Sigma	H1387-10X