Artykuł metodologiczny

Model mysi wewnątrzluminalnego MCAO: ocena zawału mózgu za pomocą barwienia fioletem krezylu

68K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/4038

⸱

6 listopada 2012

 ,  , 
1Laboratory of Biochemical Neuroendocrinology, Clinical Research Institute of Montreal, 2CHUQ Research Centre, Laval University

W tym artykule

Podsumowanie

W niniejszej pracy przedstawiono model intraluminalnego zamknięcia tętnicy środkowej mózgu u myszy. Zakres zawału mózgu oceniano za pomocą skali neurologicznej oraz barwienia fioletem krezylowym, który stanowi alternatywę dla barwienia TTC, oferując znaczącą zaletę w postaci możliwości równoległego badania wielu interesujących markerów.

Streszczenie

Udar jest trzecią przyczyną śmiertelności i główną przyczyną niepełnosprawności na świecie. Udar niedokrwienny odpowiada za około 80% wszystkich udarów. Jednakże trombolityczny aktywator plazminogenu tkankowego (tPA) jest jedyną istniejącą metodą leczenia ostrego udaru niedokrwiennego. Skłoniło to badaczy do opracowania kilku modeli udaru niedokrwiennego u różnych gatunków. Opracowano dwa główne typy modeli gryzoni: modele globalnego niedokrwienia mózgu lub ogniskowego niedokrwienia mózgu. Aby naśladować udar niedokrwienny u pacjentów, u których około 80% udarów zakrzepowych lub zatorowych występuje w obszarze tętnicy środkowej mózgu (MCA), model wewnątrzświatowego zamknięcia tętnicy środkowej mózgu (MCAO) jest bardzo istotny w badaniach nad udarem. Model ten został opracowany po raz pierwszy u szczurów przez Koizumi et al. w 1986 roku 1. Ze względu na łatwość manipulacji genetycznych u myszy, modele te opracowano również u tego gatunku 2-3.

W niniejszym opracowaniu przedstawiamy procedurę przejściowego zamknięcia tętnicy środkowej mózgu (MCA) u myszy C57/Bl6. Wcześniejsze badania wykazały, że właściwości fizyczne okludera, takie jak średnica końcówki, długość, kształt i elastyczność, mają kluczowe znaczenie dla powtarzalności objętości zawału 4. W niniejszej metodzie zastosowano komercyjne monofilamenty powlekane silikonem (Doccol Corporation). Kolejną istotną zaletą jest fakt, że monofilament ten zmniejsza ryzyko wywołania krwawień podpajęczynówkowych. Przy użyciu stereomikroskopu Zeiss Stemi 2000 monofilament powlekany silikonem wprowadzono do tętnicy szyjnej wewnętrznej (ICA) via nacięcie w tętnicy szyjnej zewnętrznej (ECA), aż do momentu zamknięcia podstawy MCA przez monofilament. Przepływ krwi przywrócono po 1 godzinie poprzez usunięcie monofilamentu, aby naśladować przywrócenie przepływu krwi po lizie skrzepu tromboembolicznego u ludzi. Zakres zawału mózgu można ocenić najpierw za pomocą skali neurologicznej oraz poprzez pomiar objętości zawału. Myszy z niedokrwieniem analizowano pod kątem wyniku neurologicznemu w różnych odstępach czasu po reperfuzji. W celu oceny objętości zawału zazwyczaj stosuje się barwienie chlorkiem 2,3,5-trifenylotetrazoliom (TTC). W niniejszym przypadku zastosowano barwienie fioletem krezylowym, ponieważ umożliwia ono badanie wielu krytycznych markerów metodą immunohistochemiczną. W niniejszym filmie opisujemy procedurę MCAO, ocenę neurologiczną oraz wyznaczanie objętości zawału za pomocą barwienia fioletem krezylowym.

Protokół

Przejściowe zamknięcie tętnicy środkowej mózgu (MCAO)

1. Procedura chirurgiczna (Rysunek 1)

Przejściowe zamknięcie tętnicy środkowej mózgu (tMCAO) wykonuje się u samców myszy C57Bl/6 w wieku od 2 do 3 miesięcy (22-28g). Protokół ten został zatwierdzony przez komisję bioetyczną ds. opieki nad zwierzętami IRCM. Narzędzia chirurgiczne sterylizowano w autoklawie (121 °C przy 15 psi przez 60 min). Pomiędzy kolejnymi zwierzętami narzędzia sterylizowano za pomocą sterylizatora koralikowego (15 sek). Stół operacyjny i pozostały sprzęt dezynfekuje się 70% etanolem.

Na dwie godziny przed operacją myszom podano buprenorfinę w celu uśmierzenia bólu (0,03 mg/kg b.w. i.p.).

Rysunek 1A.

  1. Mysz wprowadza się w stan głębokiej narkozy za pomocą 5% izofluranu, a następnie utrzymuje znieczulenie przy stężeniu 2,5% izofluranu. Podczas operacji temperatura ciała myszy jest utrzymywana na stałym poziomie za pomocą mata grzewczego.
  2. Sierść i skórę dezynfekuje się 70% etanolem lub Betadine. Ponieważ golenie powoduje uwalnianie fragmentów włosa, powstawanie mikrościernięć oraz stan zapalny, które mogą wpływać na patofizjologię udaru, nie golimy futra myszy.
  3. Wykonuje się cięcie w linii pośrodkowej szyi i delikatnie rozsuwa tkanki miękkie.
  4. Pod mikroskopem stereoskopowym (Stemi 2000, Zeiss) przeprowadza się tępe rozcięcie w celu odsłonięcia tchawicy i odsuniecia mięśni, aby zlokalizować tętnicę szyjną wspólną.
  5. Lewą tętnicę szyjną wspólną (CCA) ostrożnie oddziela się od otaczających tkanek, a następnie czasowo zamyka za pomocą tymczasowej szwy (1), używając jedwabnej nici 5-0 pociętej na odcinki 20 mm. Należy zachować szczególną ostrożność, aby nie uszkodzić nerwu błędnego.
  6. Wyodrębnia się miejsce rozgałęzienia lewej tętnicy szyjnej wewnętrznej (ICA) i tętnicy szyjnej zewnętrznej (ECA). Szew stały (2) zakłada się wokół ECA tak dystalnie, jak to możliwe, a kolejny szew tymczasowy, lekko zaciśnięty (3), zakłada się na ECA dystalnie od rozwidlenia.
  7. Zaciska się lewą ICA (4) za pomocą pęsety z odwrotnym działaniem, aby zapobiec krwawieniu. Należy zachować szczególną ostrożność, aby nie uszkodzić nerwu błędnego.
  8. W ECA wykonuje się mały otwór (5) pomiędzy szwem stałym (2) a tymczasowym (3).

Rycina 1B.

  1. Wprowadź 12 mm długą jednonitkową sznurówkę 6-0 z powłoką silikonową (powłoka silikonowa o długości ok. 9-10 mm) (Doccol Corporation) do tętnicy szyjnej zewnętrznej (ECA) (6), całkowicie przetnij ECA dystalnie względem stałej szwy i wprowadź okluder do tętnicy szyjnej wewnętrznej (ICA). Sznurówkę należy ciasno zawiązać wokół monofilamentu, aby zapobiec krwawieniu, a następnie wyjąć pęsetę z odwróconym działaniem.
  2. Okluder wprowadza się w celu zamknięcia ujścia tętnicy środkowej mózgu (MCA) w kręgu Willisa. Wprowadzanie należy przerwać na ok. 9-10 mm za rozwidleniem ECA i tętnicy szyjnej wspólnej (CCA). Okluder zostaje zablokowany i nie może się już przesuwać. Należy zachować ostrożność, aby nie przebić tętnicy skrzydłowopodniebiennej. Sznurówkę (3) na ECA należy ciasno zawiązać, aby utrwalić monofilament w pozycji.
  3. Zamknij skórę za pomocą systemu zamykania ran autoclip.
  4. Wstrzyknij 1 ml roztworu soli fizjologicznej podskórnie i umieść myszy pod lampą grzewczą na podczerwień przez cały okres po okluzji (60 min).

2. Przywrócenie przepływu krwi w tętnicy środkowej mózgu

Przed ponownym znieczuleniem można sprawdzić wynik neurologiczny (neuroscore), aby ocenić powodzenie operacji.

  1. Zanurz myszy w narkozie zgodnie z wcześniejszym opisem i usuń autoklipsy.
  2. Lekko rozluźnij szew (3) na tętnicy szyjnej zewnętrznej (ECA), aby umożliwić wyjęcie monofilamentu i reperfuzję krwi.
  3. Na stałe zawiąż tymczasowy szew na ECA, aby zapobiec utracie krwi. Monofilament należy zachować do ponownego użycia.
  4. Usuń tymczasowy szew (1) na tętnicy szyjnej wspólnej (CCA), aby umożliwić ponowny przepływ krwi.
  5. Zamknij ranę. Myszy powinny otrzymać podskórnie kolejny 1 ml roztworu soli fizjologicznej.
  6. Umieść myszy pod lampą grzewczą na podczerwień na 1 hr. Po upewnieniu się, że zwierzę odzyskało sprawność ruchową, mysz zostaje przeniesiona do klatki i pozostawiona na podkładce grzewczej i ręcznikach przez 72 hr. Należy pamiętać, aby na podkładce grzewczej umieścić tylko połowę klatki, co pozwoli myszom na wybór środowiska. Ponieważ zazwyczaj obserwuje się utratę masy ciała po operacji, w szalce Petriego należy umieścić rozgnieciony pokarm, aby zachęcić zwierzęta do jedzenia.
    Dwanaście godzin po zabiegu myszy otrzymały kolejną dawkę buprenorfiny (0.03 mg/kg b.w. i.p).

3. Operacja pozorowana

W przypadku operacji pozorowanych wszystkie procedury są identyczne, z wyjątkiem tego, że okluder nie jest wprowadzany.

4. Neuroscore

Deficyty neurologiczne pozwalają na ocenę powodzenia tMCAO bezpośrednio po reperfuzji, a w późniejszym czasie na oszacowanie stopnia nasilenia uszkodzenia. Deficyty neurologiczne są punktowane zgodnie z wcześniejszym opisem 5, a ocenę przeprowadza się w 1, 24, 48 i 72 h po reperfuzji. Stosowana jest rozszerzona skala sześciopunktowa:

  • 0: prawidłowy.
  • 1: łagodne zachowanie krążenia z niespójną lub bez niespójnej rotacją podczas podniesienia za ogon, <50% prób rotacji na stronę przeciwległą.
  • 2: łagodne, spójne krążenie, >50% prób rotacji na stronę przeciwległą.
  • 3: spójne, silne i natychmiastowe krążenie, mysz utrzymuje pozycję rotacyjną przez ponad 1-2 sec, z nosem niemal dotykającym ogona.
  • 4: silna rotacja przechodząca w ruch obrotowy (barreling), utrata zdolności chodzenia lub odruchu prostowania.
  • 5: stan śpiączki lub stan agonalny.

5. Barwienie fioletem krezylowym (Rysunek 2)

Po perfuzji roztworem PBS mózgi są szybko mrożone w izopentanie i przechowywane w temperaturze -80 °C. W zależności od planowanych badań immunohistochemicznych, mózgi myszy mogą być również perfundowane 4% paraformaldehydem (PFA). Wykonuje się przekroje koronalne mózgu (17 μm) przy użyciu kriostatu. Jeden przekrój z każdych 30 jest zbierany na tym samym szkiełku, aby uzyskać reprezentatywny obraz uszkodzenia mózgu. W celu kwantyfikacji objętości, 2 szkiełka barwi się fioletem krezylu, a do oceny zmiany wykorzystuje się system analizy obrazu (Scion Corporation, Frederick, MD). Objętość uszkodzenia obliczano w jednostkach arbitralnych (pikselach) i wyrażano jako procent przeciwległego, nieuszkodzonego obszaru dla każdego przekroju. Pozostałe szkiełka przechowuje się w temperaturze -80 °C do badań immunohistochemicznych. Alternatywnie, utrwalony w PFA mózg można kroić w grubości 30-50 μm przy użyciu wibratomu, a objętość zawału mierzyć zgodnie z zaleceniami Han et al. (2009)6.

Wyniki

Ocena neuroscore potwierdza powodzenie tMCAO po udarze i określa efektywność tMCAO po reperfuzji. W naszych badaniach wszystkie myszy poddane procedurze wewnątrzluminalnej wykazywały co najmniej łagodne, stałe zwijanie się (neuroscore 2), a deficyty neurologiczne były zazwyczaj stabilne do 72 hr. Większość myszy wykazuje łagodne, stałe zwijanie się (neuroscore 2). Myszy niewykazujące zwijania się są wykluczane z badania. Jednakże ocena neuroscore nie pozwala nam odróżnić myszy z uszkodzonym hipokampem od myszy z nienaruszonym hipokampem.

W dniu operacji nie zaobserwowano śmiertelności, co sugeruje brak krwawień podpajęczynówkowych. W przypadku stwierdzenia krwotoku podpajęczynówkowego u myszy, zwierzę to jest systematycznie wykluczane z analizy. Zastosowanie monofilamentu powlekanego silikonem firmy Doccol Corporation, który jest gładszy od monofilamentów przygotowywanych samodzielnie, zwiększa skuteczność tMCAO i ogranicza występowanie krwawień podpajęczynówkowych. Śmiertelność między 24 hr a 72 hr w tym modelu wynosi 14%, co jest zgodne z ogólnymi doniesieniami dla 60 min okluzji. Obserwowana śmiertelność wynika prawdopodobnie z dużej objętości zawału u tego szczepu myszy. Odnotowano również wysoką powtarzalność zmian (odchylenie standardowe wynosi 15%), co jest bardzo istotne przy badaniu cząsteczek neuroprotekcyjnych, których działanie mogłoby zostać zamaskowane przez zmienność modelu.

Aby ocenić zakres uszkodzenia mózgu po tMCAO, zdecydowaliśmy się zastosować barwienie fioletem krezylowym (Ryc. 2>) zamiast TTC, aby dysponować większą ilością materiału do badania odpowiednich markerów6. Zakres zmiany chorobowej jest stosunkowo spójny. Zauważyliśmy jednak, że u niektórych myszy doszło do uszkodzenia hipokampa (około 30% myszy). Warto odnotować, że barwienie fioletem krezylowym można przeprowadzić do 1 tygodnia po zabiegu. W literaturze procentowy obszar zawału mózgu różni się w zależności od badania. Zależy on od wyboru szczepu myszy, zastosowanej anestezji, grubości przekrojów mózgu, użytego monofilamentu lub zastosowanej metody barwienia 6, 7.

Schemat tętnic mózgowych; drogi ACA, MCA, PCA, ECA; przedstawia rozkład przepływu krwi.
Rysunek 1. Schemat zamykania tętnicy środkowej mózgu przy użyciu monofilamentu wewnątrznaczyniowego pokrytego silikonem. A. Uproszczony schemat mózgu myszy i tętnic mózgowych przedstawiający kolejne szwy i klips przygotowujący wprowadzenie monofilamentu pokrytego silikonem. B. Przedstawiono położenie monofilamentu w obrębie kręgu Willisa. Monofilament jest wprowadzany do ICA poprzez ECA w celu zamknięcia podstawy MCA. ACA, tętnica przednia mózgu; BA, tętnica podstawna; CCA, wspólna tętnica szyjna; C. Willis, krąg Willisa; ECA, zewnętrzna tętnica szyjna; ICA, wewnętrzna tętnica szyjna; MCA, tętnica środkowa mózgu; PCA, tylna tętnica łącząca; PPA, tętnica skrzydłowopodniebna.

Przekroje histologiczne mózgu, eksperyment nad udarem u myszy; analiza porównawcza zawału mózgu.
Rycina 2. Reprezentatywne przekroje czołowe mózgu myszy barwione fioletem krezylowym 72 h po reperfuzji. Obszar zawału (głównie prążkowie, kora i przyległe obszary mózgu) widoczny jest w kolorze białym (niezbarwionym fioletem krezylowym). Objętość uszkodzenia (część biała, prawa półkula) została wyznaczona i wyrażona jako procent przeciwległego obszaru niezmienionego (lewa półkula).

Dyskusja

Opracowano różne modele udaru, aby naśladować skutki udaru u pacjentów. Wybór modelu udaru zależy od stawianego pytania biologicznego. Intraluminalny model MCAO naśladuje jeden z najczęstszych typów udaru niedokrwiennego u pacjentów, jest mniej inwazyjny i bardziej powtarzalny niż model Tamury 4,7. Jest to niezwykle interesujący model do analiz neuroprotekcji, neuroregeneracji i śmierci komórkowej. Sukces modelu intraluminalnego zależy od wielu czynników, takich jak płeć, wiek i masa ciała zwierzęcia, temperatura, znieczulenie oraz czas trwania zabiegu, które muszą być kontrolowane. Właściwości fizyczne okludera (średnica końcówki, długość, kształt i elastyczność) mają krytyczne znaczenie dla powtarzalności MCAO 4. W niniejszej pracy stosujemy monofilament 6-0 o długości 12 mm, pokryty silikonem na odcinku 9-10 mm, firmy Doccol Corporation. Wielką zaletą tego monofilamentu jest redukcja krwawień podpajęczynówkowych, a ponieważ jego długość obejmuje całą długość ICA, zapobiega to pozostałemu przepływowi krwi pochodzącemu z przednich i tylnych tętnic łączących koła Willisa oraz PPA, co zmniejsza zmienność objętości zawału (zmienność na poziomie 15% w naszych badaniach) 8. Podwiązanie CCA również zmniejsza zmienność objętości zawału 9.

Zakres uszkodzenia mózgu po tMCAO można oceniać na różne sposoby. Deficyty neurologiczne można mierzyć w sposób wspomniany wcześniej, jednak trudno jest uzyskać za pomocą tej metody wydajny pomiar. Zakres zawału określa się zazwyczaj poprzez barwienie TTC. W ostatnim czasie stosowane są również techniki rezonansu magnetycznego, które stanowią szczególnie interesującą technologię w przypadku terapii neuroprotekcyjnych. Aby zrozumieć leżące u podłoża udaru mechanizmy komórkowe, takie jak neuroreparacja, śmierć komórek czy proliferacja komórek, krytyczne i bardzo informacyjne jest badanie różnych markerów metodą immunohistochemii. Zatem nasz protokół przygotowywania przekrojów mózgu ma tę wielką zaletę, że umożliwia przeprowadzenie tych analiz i minimalizuje liczbę wykorzystanych myszy. Ponadto Tureyen et al. 10 wykazali, że istnieje dobra korelacja między barwieniem fioletem krezylowym a barwieniem TTC.

Oświadczenia

Produkcja i bezpłatny dostęp do tego artykułu są sponsorowane przez firmę Zeiss, Inc.

Podziękowania

Niniejsze badanie było wspierane przez grant CIHR TEAM nr CTP 82946, grant CIHR nr MOP 102741, a także fundusz Canada chair nr 216684 oraz Strauss Foundation. E.R. otrzymała wsparcie w ramach stypendium z Canadian Heart & Stroke Foundation.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Mikroskop stereoskopowyfigure-materials-1 ZeissStemi 2000
Oświetlacz o wysokiej intensywności Fiber-LightDolan-Jenner Industries Inc.
System anestezjologiczny do izofluranu
IzofluranCDMV108737
Koc grzewczyGaymar MedsearchTP22G
Podczerwieniona lampa grzewcza
Pęseta ultraprecyzyjna, model 5Electron Microscopy Sciences78320-5TI
Nożyczki Vannasa, ostrze 3 mm, prosteElectron Microscopy Sciences72932-01
Model LA-1 i MPF-1, wszystkie ostrza gładkieElectron Microscopy Sciences77926-5S
Pęseta o działaniu odwróconym, model KOPINC 5Electron Microscopy Sciences72850-F
Nożyczki do sekcji 5 1/2", prosteCedarlane72960
Zestaw startowy AutoclipHarvard apparatus34-0557
System zamykania ran BD Autoclip, dł. 9 mm, 100/opak.Fisher01-804-5
Szew 5-0Harvard apparatus517763
Materiał szewny PDS II monofilament fioletowy, 5-0, RB-1; Z303HCDMV6167
Szew monofilamentowy powlekany silikonem 6-0, dł. 12 mmDoccol Corporation60SPRePK5
Strzykawki 1 mlFisher14-823-2F
Igły 26G1/2FisherBD-305111
C57BL/6 myszyIRCM

Bibliografia

  1. Koizumi, J., Yoshida, Y., Nakazawa, T., Ooneda, G. Experimental studies of ischemic brain edema, I: a new experimental model of cerebral embolism in rats in which recirculation can be introduced in the ischemic area. Jpn. J. Stroke. 8, 1-8 (1986).
  2. Chan, P. H., Kamii, H., Yang, G., Gafni, J., Epstein, C. J., Carlson, E., Reola, L. B. rain infarction is not reduced in SOD-1 transgenic mice after a permanent focal cerebral ischemia. Neuroreport. 5, 293-296 (1993).
  3. Yang, G., Chan, P. H., Chen, J., Carlson, E., Chen, S. F., Weinstein, P., Epstein, C. J., Kamii, H. Human copper-zinc superoxide dismutase transgenic mice are highly resistant to reperfusion injury after focal cerebral ischemia. Stroke. 25, 165-170 (1994).
  4. Liu, S., Zhen, G., Meloni, B. P., Campbell, K., Winn, H. R. Rodent stroke model guidelines for preclinical stroke trials (1st edition. J. Exp. Stroke Transl. Med. 2, 2-27 (2009).
  5. Jiang, S. X., Lertvorachon, J., Hou, S. T., Konishi, Y., Webster, J., Mealing, G., Brunette, E., Tauskela, J., Preston, E. Chlortetracycline and demeclocycline inhibit calpains and protect mouse neurons against glutamate toxicity and cerebral ischemia. J. Biol. Chem. 280, 33811-33888 (2005).
  6. Han, R. Q., Ouyang, Y. B., Xu, L., Agrawal, R., Patterson, A. J., Giffard, R. G. Postischemic brain injury is attenuated in mice lacking the beta2-adrenergic receptor. Anesth. Analg. 108, 280-287 (2009).
  7. Rousselet, E., Marcinkiewicz, J., Kriz, J., Zhou, A., Hatten, M. E., Prat, A., Seidah, N. G. PCSK9 reduces the protein levels of the LDL receptor in mouse brain during development and after ischemic stroke. J. Lipid Res. 52, 1383-1391 (2011).
  8. Tamura, A., Graham, D. I., McCulloch, J., Teasdale, G. M. Focal cerebral ischaemia in the rat: 1. Description of technique and early neuropathological consequences following middle cerebral artery occlusion. J. Cereb. Blood Flow Metab. 1, 53-60 (1986).
  9. Chen, Y., Ito, A., Takai, K., Saito, N. Blocking pterygopalatine arterial blood flow decreases infarct volume variability in a mouse model of intraluminal suture middle cerebral artery occlusion. J. Neurosci. Methods. 174, 18-24 (2008).
  10. Tsuchiya, D., Hong, S., Kayama, T., Panter, S. S., Weinstein, P. R. Effect of suture size and carotid clip application upon blood flow and infarct volume after permanent and temporary middle cerebral artery occlusion in mice. Brain Res. 970, 131-192 (2003).
  11. Tureyen, K., Vemuganti, R., Sailor, K. A., Dempsey, R. J. Infarct volume quantification in mouse focal cerebral ischemia: a comparison of triphenyltetrazolium chloride and cresyl violet staining techniques. J. Neurosci. Methods. 139, 203-207 (2004).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Model MCAOocena neurologicznaprzej ciowe MCAOt tnica rodkowa m zguobj to zawa ustereomikroskopsilikonowy monofilamentprzywr cenie przep ywu krwi

Powiązane artykuły