Protokół pobierania próbek trzustki ludzkiej

Summary

Ten film demonstruje procedurę preparacji ludzkiej trzustki do wielu formatów przechowywania. Orientacja anatomiczna jest zachowana w całym obszarze trzustki, aby umożliwić określenie regionalnego składu i gęstości wysp trzustkowych.

Abstract

Ta procedura preparacji i pobierania próbek została opracowana dla programu Sieci Dawców Narządów Trzustki z Cukrzycą (nPOD) w celu standaryzacji przygotowania trzustki pobranej od dawców narządów ze zwłok. Trzustka jest podzielona na 3 główne obszary (głowa, tułów, ogon), po których następują szeregowe przekroje poprzeczne wzdłuż osi przyśrodkowej do bocznej. Naprzemienne sekcje są używane do utrwalonych bloków parafiny i świeżo zamrożonych, a pozostałe próbki są mielone w celu przygotowania próbek do natychmiastowego zamrożenia, z inhibitorami RNAzy lub bez, w celu izolacji DNA, RNA lub białka. Ogólnym celem zabiegu preparacji trzustki jest pobranie próbki z całej trzustki przy zachowaniu orientacji anatomicznej.

Niejednorodność komórek endokrynologicznych pod względem składu, rozmiaru i liczby wysepek jest podawana dla ludzkich wysepek w porównaniu do wysepek gryzoni ¹. Większość ludzkich wysp trzustkowych, głowy, tułowia i ogona składa się z komórek β zawierających insulinę, a następnie z komórek α zawierających glukagon i komórek δ zawierających somatostatynę. Komórki PP zawierające polipeptyd trzustki i komórki epsilon zawierające grelinę są również obecne, ale w niewielkich ilościach. W przeciwieństwie do tego, obszar uncinate zawiera wyspy, które składają się głównie z komórek PP zawierających polipeptyd trzustki ². Te regionalne różnice w wysepkach wynikają z różnic rozwojowych. Trzustka rozwija się z brzusznych i grzbietowych zawiązków trzustki w jelicie przednim, a po rotacji żołądka i dwunastnicy płat brzuszny porusza się i łączy z grzbietem ³. Płat brzuszny tworzy tylną część głowy, w tym wyrostek nienaruszony, podczas gdy płat grzbietowy daje początek reszcie narządu. Odnotowuje się również regionalne zróżnicowanie trzustki, przy czym obszar ogonowy ma większą gęstość wysp trzustkowych w porównaniu z innymi regionami, a składniki pochodzące z płata grzbietowego ulegają selektywnej atrofii w cukrzycy typu 1^4,5.

Często pobierane są dodatkowe narządy i tkanki od dawców narządów, w tym węzły chłonne trzustki, śledziony i węzły chłonne nietrzustkowe. Próbki te są odzyskiwane w podobnych formatach jak w przypadku trzustki, z dodatkiem izolacji komórek kriokonserwowanych. Gdy proksymalna dwunastnica jest włączona do trzustki, błona śluzowa dwunastnicy może być pobierana do parafiny i mrożonych bloków oraz mielonych preparatów mrożonych.

Protocol

1. Konfiguracja

1. Etykietowanie kaset na bloki parafiny należy ręcznie za pomocą ołówka lub automatycznie za pomocą drukarki kasetowej. Dołącz identyfikator dawcy (CaseID), typ próbki, numer podwielokrotności i wszelkie dodatkowe unikalne dane identyfikacyjne (arkusz przypadku, Załącznik 1).
2. Formy OCT należy oznaczyć jak dla kaset markerem permanentnym. Wytnij 5-10 cm prostokąty z folii aluminiowej.
3. Wydrukuj lub ręcznie oznacz markerem permanentnym wszystkie fiolki i probówki. Dołącz wystarczającą ilość fiolek na mielone, zamrożone próbki i probówki z pożywką RPMI do świeżych przesyłek. W przypadku zatrzaskowo zamrożonych fiolek z RNAlater, dodaj 1 ml RNAlater do każdego kriowialu.
4. Ustaw tablice preparacyjne w okapie bezpieczeństwa biologicznego i blatach ze sterylizowanymi narzędziami preparacyjnymi (kleszcze, skalpele, ostrza, gaziki (4x4)) oraz kasetami i formami OCT ułożonymi w kolejności użycia.
5. Przygotuj kąpiel zamrażającą, umieszczając suchy lód w średniej wielkości styropianowym pudełku (10x10 cm) na głębokość co najmniej 3 cm i dodawaj izopentan, aż suchy lód zostanie całkowicie pokryty.
6. Opcjonalnie: Napełnij mały pojemnik Dewara ciekłym azotem.
7. Jeśli trzustka jest potrzebna do mikroskopii elektronowej (EM), przygotuj utrwalacz TAAB, dodając 1,25 ml 16% paraformaldehydu, 1,25 ml 8% aldehydu glutarowego i 7,5 ml 0,1 M PBS. Przygotuj utrwalacz Lowicryl, dodając 2,5 ml 16% paraformaldehydu do 7,5 ml 0,1 M PBS.
8. Przygotuj roztwory używane do izolowania komórek. Do 500 ml butelki DMEF (z glutaminą) postępuj zgodnie z technikami aseptycznymi, dodając:
   1. Płodowa surowica bydlęca (FBS): dodać 50 ml, ostatnie 10%.
   2. Penicylina/Streptomycyna (Pen/Strep, 10 000 U/ml / 10 000 ug/ml zapasu) - dodaj 5 ml zapasu Pen/Strep do RPMI, aby uzyskać końcowe stężenie 100 U/ml / 100ug/ml. Dodać również 5 ml do 500 ml butelki DPBS, jeśli jest używany do przechowywania węzłów chłonnych lub śledziony próbki.

2. Personel

1. Procedura jest optymalnie wykonywana przez trzech członków personelu, jednak procedura może być przeprowadzona przez jedną dobrze przeszkoloną osobę. Dwie osoby mogą zazwyczaj wykonać procedurę w ciągu 90 minut. Rzeczywisty czas trwania zależy od liczby pobranych tkanek i łatwości odnalezienia węzłów chłonnych trzustki. Próbki do izolacji komórek przechowuje się w temperaturze 4 °C do czasu zakończenia sekcji tkanek, podczas gdy próbki surowicy są przetwarzane równolegle.
2. Patolog, asystent patologii lub jego odpowiednik - doświadczony członek personelu kieruje obsługą tkanek i wykonuje główne sekcje, w tym podziały głowy trzustki i pobieranie węzłów chłonnych trzustki. Początkowe wysiłki skierowane są na trzustkę, a następnie badanie tłuszczu okołotrzustkowego pod kątem węzłów chłonnych.
3. Technolog laboratoryjny lub osoba na stanowisku równorzędnym – pracownik przeszkolony w zakresie wykrawania tkanek, którego główne obowiązki polegają na ważeniu trzustki i jej okolic oraz przycinaniu tkanek w przypadku stałych i zamrożonych bloków oraz fiolek mrożonych zatrzaskowo. Otrzymuje dwunastnicę i śledzionę od asystenta patologii i przetwarza te narządy, podczas gdy asystent patologii przetwarza trzustkę.
4. Asystent laboratoryjny - członek personelu, który pomaga innym, w tym etykietowanie bloków i fiolek, mielenie próbek do kriowiali i przetwarzanie surowicy.

3. Rozwarstwienie trzustki

1. Usuń dwunastnicę i śledzionę oraz oczyść trzustkę z obcego tłuszczu, naczyń i nerwów za pomocą i ostrej sekcji
2. Oczyszczoną trzustkę ułożyć na desce sekcyjnej przykrytej ręcznikami papierowymi. Zanurz aplikator z bawełnianą końcówką w niebieskim tuszu i rozprowadź na przedniej powierzchni trzustki. Zetrzyj nadmiar.
3. Opcjonalnie: Zanurz nowy aplikator w czarnym tuszu i rozprowadź na tylnej powierzchni trzustki. Przywróć trzustkę do normalnej orientacji z przednią powierzchnią skierowaną w stronę prosektora.
4. Pokrój trzustkę na 3 obszary: głowę, tułów i ogon (ryc. 1). Przetnij połączenie między głową a tułowiem, a następnie podziel pozostałą część na ~ równe porcje na tułów i ogon.
5. Zważ każdy obszar trzustki i zapisz wagi (arkusz analizy przypadku (Załącznik 1)).
6. Przekrój (~0,5 cm) każdy obszar trzustki w poprzeczny sposób "bochenka chleba" (ryc. 1).
7. Użyj sekcji z obu skrzyżowań między regionami dla próbek mielonych. W zależności od wielkości trzustki, próbka z obszaru połączenia ciało-ogon może być trudna do uzyskania, w takim przypadku liczbę bloków parafiny można zmniejszyć, aby uzyskać próbki mielone lub można uzyskać tylko próbki z obszaru trzustki, głowa i ciało. Oznacz kriowiale zgodnie z głową lub ciałem, aby oznaczyć obszar proksymalny na skrzyżowaniu.
   1. Zmielić kawałki i równo podzielić między kriowiale (≥1 gram na fiolkę). Szybko zamrozić fiolki bez RNALater w ciekłym azocie lub w zawiesinie z suchego lodu - izopentanu, a następnie przenieść do zamrażarki o temperaturze -80 °C.
   2. Przechowywać fiolki z RNALater w temperaturze pokojowej przez 30 minut, aby umożliwić zrównoważenie, zmieszać i szybko zamrozić w ciekłym azocie lub w zawiesinie suchego lodu i izopentanu, a następnie przenieść do zamrażarki o temperaturze -80 °C.
8. Usuń naprzemienne sekcje dla bloków parafiny i OCT, zaczynając od parafiny (rysunek 1).
9. Pochyl wszystkie przekroje poprzeczne w prawo.
10. Umieść sekcje ~1,5 x 1,5 x 0,5 cm w kasetach. Jeśli sekcje poprzeczne są zbyt duże, przeciąć je na pół (rysunek 2b). Oznacz kasety dla niebieskiej przedniej połowy jako "A" i tylnej połowy jako "B".
11. Jeśli kawałki są nadal zbyt duże, przytnij każdą sekcję prostopadle do poprzedniego cięcia (Rysunek 2c). Kasety należy oznaczyć od A do D w kierunku zgodnym z ruchem wskazówek zegara. W razie potrzeby przytnij elementy dalej, aby zmieściły się w kasetach.
12. Bloki liczbowe są sekwencyjne w obrębie regionu, zaczynając od najbardziej środkowej sekcji.
13. W przypadku bloków parafinowych należy ustawić kasety tak, aby etykieta znajdowała się po lewej stronie i umieścić tkankę w kasecie, zachowując jej orientację. Zamknij pokrywę kasety i przenieś do pojemnika z ~500 ml 10% neutralnej buforowanej formaliny (NBF). Rozpocznij fiksację czasu po umieszczeniu ostatniej kasety w utrwalaczu.
14. W przypadku bloków OCT wlej cienką warstwę pożywki OCT do wstępnie oznaczonej formy, a następnie połóż tkankę w formie, upewniając się, że zachowałeś orientację i przykryj tkankę OCT. Szybko zanurz formy OCT w zawiesinie suchego lodu - izopentanu na ~1 minutę. Wyjąć z gnojowicy i umieścić na suchym lodzie do tymczasowego przechowywania lub w zamrażarce w temperaturze -80 °C do długotrwałego przechowywania.
15. Uzyskaj plastry ~0,5 x 0,5 cm ze złącza głowa-ciało do mikroskopii elektronowej (EM). Umieść jeden plasterek w utrwalaczu TAAB, a drugi plasterek w utrwalaczu Lowicryl. Oba rodzaje utrwalaczy należy przechowywać wraz z próbkami w temperaturze 4 °C przez co najmniej 48 godzin i/lub przez czas nieokreślony do czasu dalszego przetwarzania w celu uzyskania EM.

4. Dysfabrykacje śledziony, węzłów chłonnych i błony śluzowej dwunastnicy

1. Odizolować węzły chłonne trzustki (PLN) od tłuszczu i przyciąć całą tkankę łączną do torebki węzła. Umieścić w sterylnym naczyniu do hodowli komórkowych zawierającym DMEF. W zależności od całkowitej liczby wyizolowanych, podziel PLN na porcje dla świeżych przesyłek, kriokonserwowanych izolacji komórek, bloków parafinowych i/lub OCT oraz fiolek. Zmiel duże węzły na kawałki nie większe niż 0,5 cm.
2. Węzły chłonne inne niż trzustka i śledziona pokrój w małe (~0,5 cm) kostkę. Umieścić w utrwalacza, pożywce OCT i/lub DMEM w przypadku dostaw świeżych próbek lub kriokonserwowanych izolacji komórek w zależności od ilości materiałów wyjściowych.
3. Otwórz dwunastnicę i delikatnie przetrzyj błonę śluzową dwunastnicy ze śluzu zwilżonym gazikiem. Wyciąć skrawki błony śluzowej na parafinę i/lub zamrożone bloki OCT oraz próbki mielone na fiolki, z RNAlater lub bez. Zamrozić jak w przypadku innych próbek.

5. Zawiń bloki OCT w folię aluminiową i umieść bloki OCT oraz fiolki w pudełkach do długotrwałego przechowywania w temperaturze -80 °C.

6. Prześlij stałe próbki do przetwarzania parafiny

1. Utrwalaj tkanki przez 16 godzin (zakres 20 ±4 godziny) za pomocą automatycznego procesora parafinowego lub ręcznego pomiaru czasu. Przetwarzanie na bloki parafiny za pomocą automatycznego procesora (Załącznik 2).
2. Osadź sekcje dokładnie w takiej orientacji, jak umieszczona przez prosektor, z etykietą kasety po lewej stronie. Osadź błonę śluzową dwunastnicy powierzchnią cięcia w dół, aby umożliwić badanie błony śluzowej prostopadłej do błony podśluzowej.

7. Oczyść obszary sekcji i zdezynfekuj. Umyj narzędzia preparacyjne i ponownie wysterylizuj. Umieść resztki tkanek ludzkich w utrwalaczu formaliny w celu przechowywania jako odpady biomedyczne. Odpady biomedyczne należy wyrzucić zgodnie z lokalnymi przepisami w ciągu jednego miesiąca.

8. Aktualizacja systemu inwentaryzacji próbek

9. Reprezentatywne wyniki

Ta procedura przetworzy nienaruszoną ludzką trzustkę z reprezentatywnym próbkowaniem całego narządu, w tym rozgraniczeniem trzech głównych regionów, a mianowicie głowy, ciała i ogona w ciągu 2 godzin. Obszar niewycięty, znajdujący się w tylnej części głowy, jest objęty rozwarstwieniem głowy. Mediana masy trzustki u dawców narządów bez cukrzycy wynosiła 82,4 grama (52,7 - 139,0 gramów). Masy regionalne trzustki były w przybliżeniu równe (ryc. 3).

Ta procedura może również pozwolić na rekonstrukcję całej trzustki za pomocą barwionych preparatów z sekwencyjnych bloków parafinowych i OCT. Możliwych jest wiele formatów, co pozwala na maksymalne wykorzystanie obecnych i przyszłych technologii. Dostępny jest aktualny arkusz przypadku nPOD (Załącznik 1), który służy do dokumentowania odzyskanych próbek i późniejszego przetwarzania według podwielokrotnych typów i ilości.

Rysunek 1. Ogólny schemat procedury. Cała trzustka jest przetwarzana przy zachowaniu orientacji anatomicznej. Obszar głowy jest dłuższy w osi górna-dolna ze względu na obecność brzusznego płata trzustki w tylnym obszarze, który obejmuje obszar nienasycony. Zakreskowany obszar na skrzyżowaniach oznacza obszary używane do rozdrabniania próbek w kriowialach. P, Parafina; O, PAŹDZIERNIK

Rysunek 2. Schemat literniczy dla odcinków trzustki. Poprzeczne plastry trzustki można dalej podzielić na połówki lub ćwiartki i opisać w kierunku zgodnym z ruchem wskazówek zegara.

Rysunek 3. Waga trzustki od dawców narządów bez cukrzycy. Nienaruszoną trzustkę od dorosłych dawców (>17 lat) zważono, a następnie podzielono na regiony i uzyskano wagi regionalne. Dane są średnimi ± SEM (N=15).

Discussion

Celem tej procedury jest zdefiniowanie standardowego przetwarzania trzustki, które może być zharmonizowane w wielu miejscach pobierania, a tym samym umożliwić porównanie wyników uzyskanych przez różne grupy. Metoda preparacji opiera się na standardowych praktykach patologii chirurgicznej z dodatkowymi krokami do adnotacji głównych obszarów trzustki, po których następują podziały wewnątrzregionalne. Standaryzacja metod przetwarzania próbek biologicznych jest konieczna, aby ułatwić pobieranie próbek wysokiej jakości, czego...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Przyrządy do preparacji, w tym skalpele z 22 ostrzami	Różne
różne probówki wirówkowe (15 i 50 ml)	Fisher Scientific	05-539-5, 430828	sterylne
krioprobówki (1,8 ml)	VWR Ameryka Północna	89004-300	Sterylne, kody kreskowe opcjonalnie
RNAlater	Ambion	AM7021
Tusz
Kasety	Mercedes Medical	CAS ECO109
10% neutralna buforowana formalina	Fisher Scientific	23-245-685
OCT	Zamrażarka TissueTek	4583
Formy	Thermo Fisher Scientific, Inc.	58952	Różne rozmiary
Isopentane	Fisher Scientific	O3551-4	OCT Kąpiel chłodząca OCT
z suchym lodem			Kąpiel chłodząca OCT
Ciekły azot w kolbie			Dewara Kriowiale do zamrażania zatrzaskowego
Naczynie do hodowli komórkowych (100 mm)	Corning	430167	Sterylny
hyklon DMEF	Thermo Fisher Scientific, Inc.	SH30023.01	Sterylne, przechowywać w lodówce, glutamina w zestawie
Surowica bydlęca	płodu Cellgro	35-010-CV	Sterylna, przechowywać zamrożone porcje
Penicylina/Streptomycyna/Przeciwgrzybicze	GIBCO, firmy Life Technologies	15240-062	Sterylne, przechowywać mrożone porcje
Typ 9 Parafina	Richard-Allan Scientific	8337
1X D-PBS	GIBCO, firmy Life Technologie	14190-144	Sterylna
16% paraformaldehydowa	mikroskopia elektronowa Nauki	15710	Wytwarzaj świeże, przechowuj w lodówce
8% aldehyd glutarowy	Mikroskopia elektronowa Nauki	16019	Wytwarzaj świeże, przechowuj w lodówce
Kaptur poziomu bezpieczeństwa biologicznego 2	Różne
Zamrażarka ultra-niska	Różne
Sakura Drukarka kasetowa	Sakura Finetek
Sakura VIP300	Sakura Finetek		Automatyczny procesor parafiny
Stacja zatapiania parafiny	Thermo Fisher Scientific, Inc.
Tabela 1. Konkretne odczynniki i sprzęt.