Protokół pobierania trzustki ludzkiej

Podsumowanie

W niniejszym filmie przedstawiono procedurę sekcji służącą do przetwarzania ludzkiej trzustki w celu uzyskania wielu formatów przechowywania. Orientacja anatomiczna jest zachowana we wszystkich obszarach trzustki, aby umożliwić określenie regionalnego składu i gęstości wysepek.

Streszczenie

Niniejsza procedura sekcji i pobierania próbek została opracowana dla programu Network for Pancreatic Organ Donors with Diabetes (nPOD) w celu standaryzacji przygotowania trzustek pobranych od pośmiertnych dawców organów. Trzustkę dzieli się na 3 główne regiony (głowę, trzon i ogon), a następnie wykonuje seryjne przekroje poprzeczne wzdłuż osi od strony przyśrodkowej do bocznej. Naprzemienne sekcje są wykorzystywane do przygotowania bloków w parafini oraz bloków świeżo zamrożonych, natomiast pozostałe próbki są rozdrabniane do przygotowania próbek gwałtownie zamrożonych, z zastosowaniem lub bez inhibitorów RNazy, w celu izolacji DNA, RNA lub białek. Ogólnym celem procedury sekcji trzustki jest pobranie próbek z całej trzustki przy jednoczesnym zachowaniu orientacji anatomicznej.

W przypadku ludzkich wysepek w porównaniu z wysepkami gryzoni zgłasza się heterogeniczność komórek endokrynnych pod względem składu, wielkości i liczby wysepek ¹. Większość ludzkich wysepek z obszarów głowy, trzonu i ogona trzustki składa się z komórek β zawierających insulinę, a następnie z mniejszych proporcji komórek α zawierających glukagon oraz komórek δ zawierających somatostatynę. Obecne są również komórki PP zawierające polipeptyd trzustkowy oraz komórki epsilon zawierające grelinę, lecz w niewielkiej liczbie. W przeciwieństwie do tego, obszar haczykowaty zawiera wysepki składające się głównie z komórek PP zawierających polipeptyd trzustkowy ². Te regionalne różnice w budowie wysepek wynikają z różnic rozwojowych. Trzustka rozwija się z brzusznego i grzbietowego pączka trzustkowego w przedjelicie, a po rotacji żołądka i dwunastnicy płat brzuszny przemieszcza się i łączy z grzbietowym ³. Płat brzuszny tworzy tylną część głowy, w tym wyrostek haczykowaty, natomiast płat grzbietowy daje początek pozostałej części narządu. Zgłaszane są również regionalne różnice w budowie trzustki, przy czym obszar ogona charakteryzuje się wyższą gęstością wysepek w porównaniu z innymi regionami, a komponenty pochodzące z płata grzbietowego ulegają selektywnej atrofii w cukrzycy typu 1^4,5.

Często pobiera się dodatkowe narządy i tkanki od dawców, w tym węzły chłonne trzustki, śledzionę oraz węzły chłonne pozatrzustkowe. Próbki te są pobierane w sposób analogiczny do trzustki, z dodatkiem izolacji komórek do krio konserwacji. W przypadku, gdy wraz z trzustką pobierana jest bliższa część dwunastnicy, można zebrać błonę śluzową dwunastnicy do bloków parafinowych i mrożonych oraz do preparatów rozdrobnionych i błyskawicznie zamrożonych.

Protokół

1. Przygotowanie

1. Oznakuj kasety do bloków parafinowych ręcznie ołówkiem lub automatycznie za pomocą drukarki do kaset. Uwzględnij identyfikator dawcy (CaseID), rodzaj próbki, numer alikwoty oraz wszelkie dodatkowe oznaczenia unikalne (arkusz sprawy, Dodatek 1).
2. Oznakuj formy OCT w ten sam sposób co kasety, używając niezmywalnego markeru. Wytnij prostokąty z folii aluminiowej o wymiarach 5-10 cm.
3. Wydrukuj etykiety lub ręcznie oznakuj niezmywalnym markerem wszystkie fiolki i probówki. Przygotuj odpowiednią liczbę fiolek dla rozdrobnionych próbek zamrożonych błyskawicznie oraz probówek z medium RPMI dla przesyłek świeżych. Do fiolek do szybkiego mrożenia z RNAlater dodaj 1 mL RNAlater do każdej kriofiolki.
4. Przygotuj deski sekcyjne w komorze z laminarnym przepływem powietrza oraz blaty z wysterylizowanymi narzędziami do sekcji (pincety, skalpele, ostrza, gaziki (4x4)), a także kasety i formy OCT ułożone w kolejności użycia.
5. Przygotuj kąpiel mrożącą, wsypując suchy lód do średniej wielkości pudełka styropianowego (10x10 cm) na głębokość co najmniej 3 cm, a następnie dolej izopentan, aż suchy lód zostanie całkowicie przykryty.
6. Opcjonalnie: Napełnij mały naczynie typu Dewar ciekłym azotem.
7. Jeśli trzustka jest potrzebna do mikroskopii elektronowej (EM), przygotuj utrwalacz TAAB, dodając 1,25 mL 16% paraformaldehydu, 1,25 mL 8% glutaraldehydu i 7,5 mL 0,1M PBS. Przygotuj utrwalacz Lowicryl, dodając 2,5 mL 16% paraformaldehydu do 7,5 mL 0,1M PBS.
8. Przygotuj roztwory stosowane do izolacji komórek. Do butelki 500 ml z DMEF (z glutaminą), stosując techniki aseptyczne, dodaj następujące składniki:
   1. Płodowa surowica bydlęca (FBS): dodaj 50mL, stężenie końcowe 10%.
   2. Penicylina/Streptomycyna (Pen/Strep, roztwór stokowy 10 000 U/mL / 10 000 ug/mL) – dodaj 5 mL roztworu stokowego Pen/Strep do RPMI, aby uzyskać stężenie końcowe 100 U/mL / 100ug/mL. Dodaj również 5 ml do butelki 500 ml DPBS, jeśli jest używany do przechowywania próbek węzłów chłonnych lub śledziony.

2. Personel

1. Procedurę optymalnie wykonuje trzech członków personelu, jednak może ona zostać przeprowadzona przez jedną, dobrze przeszkoloną osobę. Dwie osoby są zazwyczaj w stanie ukończyć procedurę w 90 minut. Rzeczywisty czas zależy od liczby otrzymanych tkanek oraz łatwości zlokalizowania węzłów chłonnych trzustki. Próbki do izolacji komórek przechowuje się w temperaturze 4 °C do czasu zakończenia sekcji tkanek, podczas gdy próbki surowicy są przetwarzane równolegle.
2. Patolog, asystent patologa lub osoba o równorzędnych kwalifikacjach – doświadczony członek personelu kieruje obchodzeniem się z tkanką i przeprowadza główne sekcje, w tym podział głowy trzustki oraz pobieranie węzłów chłonnych trzustki. W pierwszej kolejności działania koncentrują się na trzustce, a następnie następuje badanie tkanki tłuszczowej okołotrzustkowej w celu znalezienia węzłów chłonnych.
3. Technik laboratoryjny lub osoba o równorzędnych kwalifikacjach – członek personelu przeszkolony w przycinaniu tkanek, którego głównymi obowiązkami są ważenie trzustki i poszczególnych obszarów oraz przycinanie tkanek do kasetek z utrwalonym i zamrożonym materiałem oraz do probówek do szybkiego mrożenia. Odbiera dwunastnicę i śledzionę od asystenta patologa i przetwarza te organy, podczas gdy asystent patologa przetwarza trzustkę.
4. Asystent laboratoryjny – członek personelu, który pomaga pozostałym osobom, w tym przy etykietowaniu kasetek i probówek, rozdrabnianiu próbek do krioprobówek oraz przetwarzaniu surowicy.

3. Disekcja trzustki

1. Usunąć dwunastnicę oraz śledzionę, a następnie oczyścić trzustkę z nadmiaru tkanki tłuszczowej, naczyń i nerwów, stosując rozcięcie tępym i ostrym narzędziem
2. Umieścić oczyszczoną trzustkę na stole sekcyjnym wyłożonym ręcznikami papierowymi. Zanurzyć aplikator z bawełnianą końcówką w niebieskim tuszu i rozprowadzić go na powierzchni przedniej trzustki. Odchłonąć nadmiar tuszu
3. Opcjonalnie: zanurzyć nowy aplikator w czarnym tuszu i rozprowadzić go na powierzchni tylnej trzustki. Przywrócić trzustce normalną orientację, tak aby powierzchnia przednia była skierowana w stronę sekcjonującego
4. Podzielić trzustkę na 3 regiony: głowę, trzon i ogon (Rycina 1). Przeciąć miejsce połączenia głowy z trzonem, a następnie podzielić pozostałą część na w przybliżeniu równe fragmenty stanowiące trzon i ogon
5. Zważyć każdy region trzustki i zapisać masy (Arkusz analizy przypadku (Załącznik 1))
6. Wyciąć przekroje poprzeczne (ok. 0.5 cm) z każdego regionu trzustki metodą „kromkowania chleba” (Rycina 1)
7. Wykorzystać przekroje z obu połączeń między regionami do przygotowania próbek rozdrobnionych. W zależności od wielkości trzustki, pobranie próbki z regionu połączenia trzonu z ogonem może być trudne, w takim przypadku można zmniejszyć liczbę bloków parafinowych w celu uzyskania próbek rozdrobnionych lub pobrać próbki wyłącznie z regionu połączenia głowy z trzonem. Oznaczyć probówki kriogeniczne jako „głowa” lub „trzon”, aby wskazać region proksymalny na połączeniu.
   1. Rozdrobnić fragmenty i podzielić je równomiernie między probówki kriogeniczne (≥1 gram na probówkę). Szybko zamrozić probówki bez RNALater w ciekłym azocie lub w mieszaninie suchego lodu z izopentanem, a następnie przenieść do zamrażarki -80 °C
   2. Przechowywać probówki z RNALater w temperaturze pokojowej przez 30 minut w celu wyrównania temperatury, ponownie wymieszać i szybko zamrozić w ciekłym azocie lub w mieszaninie suchego lodu z izopentanem, a następnie przenieść do zamrażarki -80 °C
8. Pobierać naprzemiennie przekroje do bloków parafinowych i bloków OCT, zaczynając od parafiny (Rycina 1)
9. Ułożyć wszystkie przekroje poprzeczne z lekkim nachyleniem w prawą stronę
10. Umieścić przekroje o wymiarach ok. 1.5 x 1.5 x 0.5 cm w kasetkach. Jeśli przekroje poprzeczne są zbyt duże, przeciąć je na pół (Rycina 2b). Oznaczyć kasetki z niebieską połową przednią jako „A” i połową tylną jako „B”
11. Jeśli fragmenty nadal są zbyt duże, przeciąć każdy przekrój prostopadle do poprzedniego cięcia (Rycina 2c). Oznaczyć kasetki A-D zgodnie z ruchem wskazówek zegara. W razie potrzeby dodatkowo przyciąć fragmenty, aby zmieściły się w kasetkach
12. Ponumerować bloki sekwencyjnie w obrębie regionu, zaczynając od przekroju najbardziej przyśrodkowego
13. W przypadku bloków parafinowych ustawić kasetki tak, aby etykieta znajdowała się po lewej stronie, a następnie umieścić tkankę w kasetce, zachowując jej orientację. Zamknąć pokrywę kasetki i przenieść do pojemnika z ok. 500 ml 10% obojętnie buforowanej formaliny (NBF). Rozpocząć odliczanie czasu utrwalania w momencie umieszczenia ostatniej kasetki w utrwalaczu
14. W przypadku bloków OCT wlać cienką warstwę medium OCT do wcześniej oznakowanej formy, następnie ułożyć tkankę w formie, dbając o zachowanie orientacji i pokryć tkankę medium OCT. Szybko zanurzyć formy OCT w mieszaninie suchego lodu z izopentanem na ok. 1 minutę. Wyjąć z mieszaniny i umieścić na suchym lodzie do tymczasowego przechowywania lub w zamrażarce -80 °C do długotrwałego przechowywania
15. Pobrać skrawki o wymiarach ok. 0.5 x 0.5 cm z połączenia głowy z trzonem do mikroskopii elektronowej (EM). Umieścić jeden skrawki w utrwalaczu TAAB, a drugi w utrwalaczu Lowicryl. Przechowywać oba rodzaje utrwalacza z próbkami w temperaturze 4 °C przez co najmniej 48 godzin i/lub do czasu dalszego przetwarzania do EM

4. Disekcja śledziony, węzłów chłonnych i błony śluzowej dwunastnicy

1. Wyizolować węzły chłonne trzustki (PLN) z tkanki tłuszczowej i usunąć całą tkankę łączną aż do torebki węzła. Umieścić w sterylnej szalce do hodowli komórkowej zawierającej DMEF. W zależności od całkowitej liczby wyizolowanych węzłów, podzielić PLN na aliquoty do wysyłek świeżych próbek, izolacji komórek kriotransformowanych, bloków parafinowych i/lub OCT oraz do probówek. Posiekać duże węzły na kawałki nie większe niż 0.5 cm.
2. Posiekać węzły chłonne niepanukreatyczne oraz śledzionę na małe kostki (~0.5 cm). Umieścić w utrwalaczu, medium OCT i/lub DMEM w celu wysyłki świeżych próbek lub izolacji komórek kriotransformowanych, zależnie od ilości materiału wyjściowego.
3. Otworzyć dwunastnicę i delikatnie oczyścić śluzówkę dwunastnicy z wydzieliny za pomocą zwilżonego gazika. Wyciąć fragmenty śluzówki do bloków parafinowych i/lub zamrożonych bloków OCT oraz posiekane próbki do probówek, z dodatkiem RNAlater lub bez niego. Zamrozić w taki sam sposób jak pozostałe próbki.

5. Owiń bloki OCT uprzednio oznakowaną folią aluminiową, a następnie umieść bloki OCT i probówki w pudełkach do długotrwałego przechowywania w temperaturze -80 °C.

6. Przekaż utrwalone próbki do obróbki w parafinie

1. Utrwalcie tkanki przez 16 godzin (zakres 20 ±4 godzin), korzystając z automatycznego procesora do parafiny lub stosując pomiar czasu manualnie. Przygotujcie bloki parafinowe za pomocą procesora automatycznego (Dodatek 2).
2. Zatopcie przekroje w dokładnie takiej orientacji, w jakiej zostały umieszczone przez patomorfologa, z etykietą kasety po lewej stronie. Zatopcie błonę śluzową dwunastnicy powierzchnią cięcia do dołu, aby umożliwić badanie błony śluzowej prostopadle do błony podśluzowej.

7. Wyczyść obszary sekcyjne i zdezynfekuj je. Umyj instrumenty sekcyjne i ponownie je wysterylizuj. Pozostałości tkanek ludzkich umieść w utrwalaczu z formaliną w celu przechowywania jako odpady biomedyczne. Utylizuj odpady biomedyczne zgodnie z lokalnymi przepisami w ciągu jednego miesiąca.

8. Aktualizacja systemu inwentaryzacji próbek

9. Reprezentatywne wyniki

Niniejsza procedura opisuje proces obróbki nienaruszonej ludzkiej trzustki z reprezentatywnym pobieraniem próbek z całego narządu, w tym wyznaczeniem trzech głównych obszarów: głowy, trzonu i ogona w czasie 2 godzin. Obszar haczykowaty, znajdujący się w tylnej części głowy, jest uwzględniany w sekcji głowy. Średnia masa trzustki u dawców narządów bez cukrzycy wynosiła 82,4 g (52,7 - 139,0 g). Masa poszczególnych regionów trzustki była w przybliżeniu taka sama (Rycina 3).

Niniejsza procedura umożliwia również rekonstrukcję całego trzustki z wykorzystaniem barwionych preparatów z sekwencyjnych bloków parafinowych oraz OCT. Możliwe jest zastosowanie wielu formatów, co pozwala na maksymalne wykorzystanie bieżących i przyszłych technologii. Do dyspozycji udostępniono aktualny arkusz roboczy przypadku nPOD (Załącznik 1), który służy do dokumentowania odzyskanych próbek oraz ich późniejszego przetwarzania z podziałem na rodzaje i ilości alikwotów.

Rysunek 1. Ogólny schemat procedury. Cała trzustka jest przetwarzana z zachowaniem orientacji anatomicznej. Obszar głowy jest dłuższy w osi górno-dolnej ze względu na obecność brzusznego płata trzustki w regionie tylnym, który obejmuje obszar haczykowaty. Zakreskowane obszary na połączeniach oznaczają regiony wykorzystane do pobrania posiekanych próbek do probówek kriogenicznych. P, parafina; O, OCT.

Rycina 2. Schemat oznaczania sekcji trzustki. Poprzeczne plastry trzustki można dalej podzielić na połowy lub ćwiartki i oznaczyć literami zgodnie z ruchem wskazówek zegara.

Rycina 3. Masa trzustki od dawców organów bez cukrzycy. Nienaruszoną trzustkę od dorosłych dawców (>17 lat) zważono, a następnie podzielono na regiony i wyznaczono masę poszczególnych części. Dane przedstawiono jako średnie ± SEM (N=15).

Dyskusja

Celem niniejszej procedury jest zdefiniowanie standardowego sposobu opracowania trzustki, który może zostać zharmonizowany w wielu ośrodkach pobrań, co umożliwi porównanie wyników uzyskanych przez różne grupy. Metoda sekcji opiera się na standardowych praktykach patomorfologii chirurgicznej z dodatkowymi etapami adnotacji głównych obszarów trzustki, a następnie ich podziałów wewnątrzregionalnych. Standaryzacja metod opracowywania biospecyminów jest niezbędna w celu ułatwienia gromadzenia wysokiej jakości próbek, czego pr...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Zestaw instrumentów do sekcji, w tym skalpele z ostrzami 22	Różne	Różne
Probówki wirówkowe (15 i 50 ml)	Fisher Scientific	05-539-5, 430828	Sterylne
Kriotubki (1,8 ml)	VWR North America	89004-300	Sterylne, kody kreskowe opcjonalne
RNAlater	Ambion	AM7021
Tusz do patomorfologii chirurgicznej
Kasety	Mercedes Medical	CAS ECO109
10% neutralnie buforowana formalina	Fisher Scientific	23-245-685
Pożywka do mrożenia OCT	TissueTek	4583
Formy	Thermo Fisher Scientific, Inc.	58952	Różne rozmiary
Izopentan	Fisher Scientific	O3551-4	Kąpiel chłodząca OCT
Suchy lód			Kąpiel chłodząca OCT
ciekły azot w naczyniu Dewara			Szybkie mrożenie w krioszczelnych probówkach
Szalka do hodowli komórkowej (100 mm)	Corning	430167	Sterylna
Hyclone DMEF	Thermo Fisher Scientific, Inc.	SH30023.01	Sterylna, przechowywać w lodówce, zawiera glutaminę
Płodowa surowica bydlęca	Cellgro	35-010-CV	Sterylna, przechowywać zmrożone alikwoty
Penicylina/Streptomycyna/Lek przeciwgrzybiczy	GIBCO, by Life Technologies	15240-062	Sterylne, przechowywać zmrożone alikwoty
Parafina typu 9	Richard-Allan Scientific	8337
1X D-PBS	GIBCO, by Life Technologies	14190-144	Sterylny
16% Paraformaldehyd	Electron Microscopy Sciences	15710	Przygotowywać na świeżo, przechowywać w lodówce
8% Glutaraldehyd	Electron Microscopy Sciences	16019	Przygotowywać na świeżo, przechowywać w lodówce
Dygestorium klasy bezpieczeństwa biologicznego 2	Różne
Zamrażarka ultra niskotemperaturowa	Różne
Drukarka do kaset Sakura	Sakura Finetek
Sakura VIP300	Sakura Finetek		Automatyczny procesor do parafiny
Stacja do zatapiania w parafinie	Thermo Fisher Scientific, Inc.
Tabela 1. Specyficzne odczynniki i sprzęt.