Wygodna i ogólna platforma do produkcji wydzielanych białek z komórek ludzkich

Podsumowanie

W erze post-ludzkiej genomiki, dostępność rekombinowanych białek w natywnych konformacjach jest kluczowa dla strukturalnych, funkcjonalnych i terapeutycznych badań i rozwoju. W tym miejscu opisujemy testowy i wielkoskalowy system ekspresji białek w ludzkich embrionalnych komórkach 293T nerki, który można wykorzystać do produkcji różnych rekombinowanych białek.

Streszczenie

Ekspresja białek rekombinowanych u bakterii, zazwyczaj E. coli, była najbardziej skuteczną strategią ekspresji białek w miligramach. Jednak gospodarze prokariotyczni często nie są tak odpowiedni do ekspresji białek ludzkich, wirusowych lub eukariotycznych ze względu na toksyczność obcej makrocząsteczki, różnice w maszynerii fałdowania białek lub z powodu braku szczególnych modyfikacji ko- lub potranslacyjnych u bakterii. Systemy ekspresji oparte na drożdżach (P. pastoris lub S. cerevisiae) ^1,2, komórkach owadów zakażonych bakulowirusem (S. frugiperda lub T. ni) ³ oraz bezkomórkowych systemach translacji in vitro ^2,4 zostały z powodzeniem wykorzystane do produkcji białek ssaków. Intuicyjnie najlepszym rozwiązaniem jest użycie żywiciela ssaków, aby zapewnić produkcję rekombinowanych białek, które zawierają odpowiednie modyfikacje potranslacyjne. Wiele linii komórkowych ssaków (ludzka nerka embrionalna (HEK) 293, komórki CV-1 w Origin przenoszące duży antygen T SV40 (COS), jajnik chomika chińskiego (CHO) i inne) zostały z powodzeniem wykorzystane do nadekspresji miligramowych ilości wielu ludzkich białek ^5-9. Jednak korzyści płynące z wykorzystania komórek ssaków są często niwelowane przez wyższe koszty, wymóg specjalistycznego sprzętu laboratoryjnego, niższą wydajność białka i długi czas tworzenia stabilnych linii komórek ekspresyjnych. Zwiększenie wydajności i szybsza produkcja białek, przy jednoczesnym utrzymaniu niskich kosztów, to główne czynniki dla wielu laboratoriów akademickich i komercyjnych.

Tutaj opisujemy efektywną czasowo i kosztowo, dwuczęściową procedurę ekspresji wydzielanych ludzkich białek z przylegających komórek HEK 293T. System ten jest zdolny do wytwarzania mikrogramów do miligramów funkcjonalnych ilości białka do badań strukturalnych, biofizycznych i biochemicznych. W pierwszej części wiele konstruktów genu będącego przedmiotem zainteresowania jest wytwarzanych równolegle i przejściowo transfekowanych do przylegających komórek HEK 293T w małej skali. Wykrywanie i analiza rekombinowanego białka wydzielanego do pożywki do hodowli komórkowej odbywa się za pomocą analizy western blot przy użyciu dostępnych na rynku przeciwciał skierowanych przeciwko znacznikowi oczyszczania białka kodowanemu przez wektor. Następnie odpowiednie konstrukty do produkcji białek na dużą skalę są przejściowo transfekowane przy użyciu polietylenoiminy (PEI) w 10-warstwowych fabrykach komórek. Białka wydzielane do litrów kondycjonowanej pożywki są zagęszczane do możliwych do opanowania ilości za pomocą filtracji o przepływie stycznym, a następnie oczyszczane za pomocą chromatografii powinowactwa anty-HA. Użyteczność tej platformy została udowodniona przez jej zdolność do wyrażania miligramowych ilości cytokin, receptorów cytokin, receptorów na powierzchni komórek, wewnętrznych czynników restrykcyjnych i glikoprotein wirusowych. Metoda ta została również z powodzeniem zastosowana w oznaczaniu strukturalnym trimerycznej glikoproteiny ^5,10 wirusa ebola.

Podsumowując, ta platforma oferuje łatwość użycia, szybkość i skalowalność, jednocześnie maksymalizując jakość i funkcjonalność białka. Ponadto nie jest wymagane żadne dodatkowe wyposażenie, poza standardowym nawilżanym inkubatorem_CO2. Procedura ta może być szybko rozszerzona na systemy o większej złożoności, takie jak koekspresja kompleksów białkowych, antygenów i przeciwciał, produkcja cząstek wirusopodobnych do szczepionek lub produkcja adenowirusów lub lentiwirusów do transdukcji trudnych linii komórkowych.

Protokół

1. Prace przygotowawcze - Konstrukty i hodowle komórkowe

Przed rozpoczęciem protokołu, interesujący nas gen powinien zostać zoptymalizowany pod kątem kodonów do ekspresji w komórkach ssaków i sklonowany do odpowiedniego wektora ekspresji przy użyciu standardowych technik biologii molekularnej. Aby zapewnić jak największą szansę na udaną ekspresję, należy wygenerować wiele wariantów genu będącego przedmiotem zainteresowania. Wiele wektorów ekspresji ssaków jest dostępnych na rynku i ma różne znaczniki oczyszczające (między innymi polihistydyna, hemaglutynina, streptawidyna, HALO-Tag, S-transferaza glutationu). Wolimy używać wektora pDISPLAY, który koduje silny ludzki promotor wirusa cytomegalii, sygnał wydzielania Ig κ, znacznik oczyszczania hemaglutyniny i ma C-końcową kotwicę transbłonową do kierowania białka przez szlak wydzielniczy do wyświetlenia na błonie plazmatycznej. Zwykle wstawiamy kodon stop przed zakotwiczoną transbłonowo kotwicą kodowaną przez wektor, aby umożliwić wydzielanie białka do kondycjonowanego podłoża.

Dodatkowe rozważania dotyczące testowej i wielkoskalowej ekspresji białek są omówione w ^11-15.

2. Wyrażenie testowe na małą skalę

Po zaprojektowaniu i wygenerowaniu konstrukcji, można przeprowadzić testowe transfekcje na małą skalę przy użyciu komórek HEK 293T; schemat podsumowujący proces jest przedstawiony poniżej (Rys. 1).

1. Użyć kolb do hodowli komórkowych T75 cm² lub T225 cm² (w zależności od liczby wyrażeń testowych, które mają być wykonane) do wyhodowania komórek HEK 293T i dzielenia komórek co 2-3 dni, gdy komórki są w 100% zlewające się (ramka 1).
2. Wysiewać 2,5 x 10⁵ komórek HEK 293T na studzienkę na płytce 6-dołkowej i dodać 2 ml DMEM z 1X wstrzykiwaczem/paciorkowcami i 10% (v/v) FBS, delikatnie zamieszać płytkę, aby zapewnić równomierne rozproszenie komórek w każdym dołku, i inkubować przez noc w temperaturze 37 °C w 5% nawilżonej komorze CO₂
.
3. Gdy komórki HEK 293T osiągną 40% konfluencji, wyrzuć pożywkę i dodaj świeże 2 ml DMEM z 1X pen / strep i 10% (v / v) FBS do studzienek. Wykonaj testy transfekcji.
4. Podać 90 μl DMEM bez surowicy do sterylnej probówki do mikrowirówki o pojemności 1,5 ml. Odpipetować 3 μl GeneJuice do DMEM bez surowicy i delikatnie wymieszać probówkę (finger vortex). Inkubować przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
5. Dodaj 1 μg oczyszczonego plazmidowego DNA MiniPrep (zapas DNA = 100 ng / μl) do mieszaniny DMEM-GeneJuice, wirować palcami i inkubować przez 15 minut w temperaturze pokojowej.
6. Pipetować mieszaninę transfekcji kroplami na komórki HEK 293T i delikatnie obracać 6-dołkową płytką, aby umożliwić równomierne rozprowadzenie mieszaniny transfekcyjnej. Inkubować 6-dołkową płytkę w temperaturze 37 °C w komorze nawilżanej o stężeniu 5% CO_{2 .}
7. Dodaj 1 ml świeżego DMEM z 1X wstrzykiwaczem/paciorkowym i 10% (v/v) FBS do każdego dołka 24 godziny po transfekcji i inkubować przez kolejne 48 godzin (łącznie 72 godziny).
8. Pobrać 1 ml supernatantu z każdej studzienki po trzech dniach od transfekcji i mikroodwirować próbki o masie 16 000 g przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Przeprowadzić analizę western blot zgodnie z opisem w ramce 2. Próbki mogą być przechowywane w temperaturze 4 °C. Czas przechowywania w temperaturze 4 °C zależy od białka.

3. Ekspresja testowa na dużą skalę i oczyszczanie

Po zidentyfikowaniu konstruktu, ekspresja ilości miligramów rekombinowanego białka jest osiągana przez transfekcję PEI przylegających komórek HEK 293T przy użyciu 10-warstwowych fabryk komórek (Rys. 2; 6360 cm² powierzchni). W przypadku bardziej eksploracyjnych badań można użyć mniejszych fabryk komórek lub kolb T (Tabela 1).

1. Oczyść 1 mg DNA do transfekcji za pomocą zestawu do oczyszczania plazmidu MaxiPrep. Hodowla niebieskich komórek XL-1 w ciągu nocy w 500 ml powinna wytworzyć co najmniej 1 mg czystego DNA. Sprawdź czystość DNA, mierząc stosunek A₂₆₀/_{A 280}; powinna wynosić powyżej 1,8.
2. Skalowanie w górę komórek HEK 293T do 2,0 x 10⁸ komórek. Każda kolba T225 cm² wyhodowana do 100% zbiegu zawiera i średnio ~2,25 x 10⁷ komórek.
3. Dodać 1,2 l DMEM z 5% (v/v) FBS do 10-warstwowej fabryki ogniw. Dodaj 2,0 x 10⁸ komórek HEK 293T do fabryki ogniw i równomiernie rozprowadź komórki we wszystkich warstwach naczynia. Bardzo trudno jest zobrazować zbieganie się komórek w fabryce komórek. Alternatywnie należy ustawić kolbę T75 cm² z odpowiednią liczbą komórek, stosując ten sam stosunek liczby komórek do powierzchni, jaki ma to miejsce w przypadku naczynia 10-warstwowego. Monitorować tę kolbę pod kątem szybkości wzrostu. Zapoznaj się z powiązanym filmem, aby uzyskać instrukcje dotyczące obsługi fabryki ogniw. Inkubować przez noc w temperaturze 37 °C z 5% CO₂ w celu umożliwienia przyłączenia i wzrostu komórek.
4. Wykonaj transfekcję na dużą skalę, gdy przylegające komórki HEK 293T są w 70% zlewne. Przygotować mieszaninę transfekcji PEI-DNA (stosunek PEI do DNA w stosunku 3:1 w/w do DNA) w komorze bezpieczeństwa biologicznego przy użyciu sterylnej kolby T75 cm². Wymieszaj 0,84 mg DNA z 84 ml sterylnego 1X PBS, a następnie dodaj 2,5 ml PEI (2,5 mg całkowitego PEI). Inkubować w temperaturze pokojowej przez 15 minut. Roztwór powinien stać się mętny.
5. Mieszaninę do transfekcji PEI-DNA należy powoli wlać do fabryki komórek i dokładnie rozprowadzić na wszystkich warstwach naczynia. Opcjonalnie: w celu zwiększenia wydajności ekspresji dodać kwas walproinowy (stężenie końcowe 4 mM). Inkubować w temperaturze 37 °C z 5% CO₂ przez cztery dni.
6. Zebrać supernatant cztery dni po transfekcji. Odwirować kondycjonowaną pożywkę o sile 6000 x g przez 30 minut w temperaturze 4 °C. Dalej przefiltrować supernatant za pomocą próżniowego aparatu filtrującego Stericup 0,22 μm. Fabryka ogniw 10-warstwowych może być ponownie wykorzystana, instrukcje dotyczące czyszczenia znajdują się w ramce 3. Kluczowe jest, aby czyszczenie rozpoczynało się natychmiast po zbiorze supernatantu; Nie pozwól, aby komórki wyschły na powierzchni naczynia.
7. Zagęścić supernatant do 75 ml za pomocą systemu filtracji z przepływem stycznym Centramate.
8. Dodać 500 ml PBS i ponownie zagęścić do 75 ml. Powtórzyć trzy razy więcej w celu całkowitej wymiany buforowej próbki.
9. Zrównoważyć 1 ml kolumny o powinowactwie anty-HA z 1X PBS i nanieść zagęszczoną próbkę przez przepływ grawitacyjny z szybkością <1 ml/min.
10. Przemyć kolumnę 30 ml 1X PBS-Tween20.
11. Rozpuścić peptyd HA w 1X PBS (1,0 mg/ml) i inkubować w temperaturze 37 °C.
12. Nanieść 1 ml peptydu HA na kolumnę anty-HA i pozwolić peptydowi spłynąć do żywicy. Zbierz przepływ. Zatrzymaj przepływ, gdy roztwór peptydu osiągnie wysokość złoża.
13. Inkubować całą kolumnę anty-HA w temperaturze 37 °C przez 15 minut.
14. Powtórz krok 12 jeszcze dwa razy.
15. Nałóż 1 ml 1X PBS na kolumnę anty-HA i slej do żywicy, aż osiągnie wysokość złoża. Zbierz przepływ.
16. Zregeneruj kolumnę anty-HA za pomocą 10 ml 0,1 M glicyny o pH 2,2. Przemyć 10 ml PBS i przechowywać kolumnę powinowactwa w temperaturze 4 °C w PBS z 0,02% (w/v) NaN₃.
17. Wykonaj analizę SDS-PAGE i odpowiednio połącz frakcje. Uwaga: Peptyd HA będzie zakłócał pomiary stężenia białka przez A₂₈₀ lub Bradforda. Aby oszacować ilość obecnego białka, należy standardowo załadować 5, 10, 15, 25 μg BSA na żel SDS-PAGE i porównać intensywności pasm.

Kroki 9-17 można powtórzyć, aby wychwycić dodatkowe białko z kondycjonowanej pożywki.

4. Reprezentatywne wyniki

W tym artykule opisujemy i demonstrujemy wygodną platformę ekspresji do produkcji białek ludzkich w miligramach, która może być następnie wykorzystana do badań strukturalnych i funkcjonalnych. Badania przesiewowe ludzkich konstruktów białkowych przy użyciu komórek HEK 293T na płytkach 6-dołkowych są wydajne i skuteczne w identyfikacji konstruktów nadających się do produkcji na większą skalę. Komercyjne wektory ekspresyjne mogą być skutecznie transfekowane w komórkach HEK 293T przy użyciu różnych odczynników do transfekcji, takich jak GeneJuice, FuGene HD lub PEI. Zalecamy użycie komercyjnego odczynnika do transfekcji, takiego jak GeneJuice lub FuGene HD, do ekspresji testowych, ponieważ odczynniki te są bardziej skuteczne w przypadku białek o gorszej ekspresji (ryc. 3). Konstrukty wybrane do ekspresji na większą skalę powinny charakteryzować się pojedynczym, silnym pasmem intensywności, odpowiadającym właściwej masie cząsteczkowej na western blot (ryc. 3). Glikoproteiny mogą migrować jako szersze pasmo ze względu na niejednorodność glikozylacji. Wykazaliśmy, że różne makrocząsteczki, począwszy od glikoprotein wirusowych, cytokin, receptorów cytokin i innych białek powierzchniowych, mogą być wyrażane i oczyszczane w celu uzyskania miligramowych ilości białka przy użyciu tej ogólnej platformy ekspresji (ryc. 4).

Rysunek 1. Schemat przepływu pracy dla operacji na małą skalę. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą postać.

Rysunek 2. Corning 10-warstwowy CellSTACK do ekspresji białek na większą skalę. Każda warstwa zawiera 636 cm² powierzchni do mocowania komórek. Standardowy laboratoryjny inkubator CO₂ (6,0 stóp sześciennych) wygodnie pomieści cztery fabryki komórek 10-warstwowych.

Rysunek 3. Ekspresja różnych wydzielanych białek na małą skalę. Przeprowadziliśmy serię ekspresji testowych na małą skalę przy użyciu popularnych odczynników do transfekcji: GeneJuice, FuGene HD i PEI. (a) Badania przesiewowe Western blot wybranych ludzkich białek komórkowych (tetheryna), receptorów (podjednostka IL-2R β) i cytokin (IL-2). Tetheryna jest ludzką glikoproteiną błonową, która ogranicza uwalnianie powstających wirionów HIV-1 ¹⁶. Zewnątrzkomórkowa domena tetheryny występuje w postaci glikozylowanego, dwusiarczkowego dimeru ~36 kDa. W warunkach redukujących, jak pokazano tutaj, tetheryna migruje jako monomer o pozornej masie cząsteczkowej ~22 kDa. Interleukina-2 (IL-2) jest cytokiną (~17 kDa) biorącą udział w proliferacji limfocytów ¹⁷. Oddziałuje z kompleksem receptora IL-2, ^{którego składnikiem} jest podjednostka β IL-2R (~26 kDa). CD21 jest białkiem błonowym biorącym udział w aktywacji i dojrzewaniu limfocytów B przez układ dopełniacza, a także jest receptorem dla wirusa Epsteina-Barr. Glikozylowana domena zewnątrzkomórkowa CD21 migruje jako monomer o pozornej masie cząsteczkowej ~20 kDa. (b) Badania przesiewowe Western blot wybranych powierzchniowych glikoprotein wirusowych (XMRV Env i wirus ebolawirus GP). XMRV i glikoproteiny wirusa ebola (usunięta kotwica transbłonowa) istnieją na błonie wirusa jako trimeryczne kolce i biorą udział w przyłączaniu i fuzji komórek gospodarza. Ektodomena XMRV Env i EBOV GP jest silnie ozdobiona glikanami sprzężonymi z N i migruje z pozorną masą cząsteczkową odpowiednio 70 kDa i 75 kDa.

Rysunek 4. Oczyszczone ludzkie białka komórkowe z wielkoskalowych kultur HEK 293T. Wszystkie białka poddano ekspresji przy użyciu 10-warstwowej fabryki komórek, a następnie zagęszczono i oczyszczono za pomocą chromatografii anty-HA. Jak wykazano w analizie SDS-PAGE barwionej Coomassie, domeny zewnątrzkomórkowe podjednostek receptora interleukiny-2 (IL-2R) α i γ migrują z masami cząsteczkowymi odpowiednio 40 kDa i 46 kDa. Zewnątrzkomórkowa domena tetheryny migruje w postaci dimeru, w warunkach nieredukujących, o pozornej masie cząsteczkowej 36 kDa. Należy zauważyć, że istnieje pewne zanieczyszczenie BSA, które pojawia się przy pozornej masie cząsteczkowej 60 kDa. Ponadto niejednorodność glikanów sprzężonych z N obecnych na tetherynie, IL-2R α i IL-2R γ powoduje poszerzenie pasma na żelu SDS-PAGE. Te glikany połączone z kompleksem typu N można usunąć za pomocą peptydu: N-glikozydazy F.

naczynie powierzchnia Płytka 6-dołkowa 9,5 cm² (każda studzienka) Talerze 100 mm 55 cm² Talerze 245 mm 500 cm² Kolba T75 cm² 75 cm² Kolba T175 cm² 175 cm² Kolba T225 cm² 225 cm² Butelka na kółkach - zwykła 850 cm² Butelka rolkowa - rozszerzona powierzchnia 1700 cm² 1-warstwowy CellSTACK 636 cm² 2-warstwowy CellSTACK 1272 cm² 5-warstwowy CellSTACK 3180 cm² 10-warstwowy CellSTACK 6360 cm² 40-warstwowy CellSTACK 25 440 cm²

Tabela 1. Porównanie naczyń do hodowli komórkowych wykorzystywanych do ekspresji białek.

Lista receptur odczynników

100X Ciprofloksacyna Na 10 ml roztworu dodaj 10 ml wody dejonizowanej do 10 mg cyprofloksacyny. Dodać 10 μl 6N HCl, aby całkowicie rozpuścić cyprofloksacynę.

PEI (1 mg/mL) Dla roztworu o objętości 100 ml rozpuść 100 mg liniowego PEI o stężeniu 25 kDa w wodzie dejonizowanej i podgrzej do 80 °C. Schłodź roztwór do temperatury pokojowej, dostosuj pH do 7,2, filtr 0,22 μm sterylizuj, podamuluj i zamrażaj w temperaturze -20 °C do długotrwałego przechowywania.

1X PBS Dla 1 L roztworu wodnego: 8,0 g NaCl, 0,2 g KCl, 1,4 g Na₂HPO₄ (bezwodny), 0,24 g KH₂PO₄. Dostosuj pH roztworu do 7,4 i napełnij do 1,0 l.

1X PBS-Tween-20 Dla 1 l roztworu wodnego: 8,0 g NaCl, 0,2 g KCl, 1,4 g Na₂HPO₄ (bezwodny), 0,24 g KH₂PO₄, 1 ml Tween-20. Dostosuj pH roztworu do 7,4 i napełnij do 1,0 l.

1X bufor transferowy Dla 1 L roztworu wodnego: 3,0 g zasady Tris, 14,4 g glicyny, 150 ml metanolu.

1X SDS-PAGE uruchomiony bufor Dla 1 l roztworu wodnego: 3,0 g zasady Tris, 14,4 g glicyny, 1,0 g SDS.

SDS-PAGE redukujący bufor próbki Dla 10 ml roztworu: 0,6 g SDS, 3 ml glicerolu, 1,8 ml 1,0 Tris-HCl pH 6,8, 1 mg błękitu bromofenolowego, 5% (v/v) 2-merkaptoetanol.

Pole 1. Ogólne protokoły namnażania komórek

1. Hoduj komórki HEK 293T w zmodyfikowanym pożywce Eagle's Medium (DMEM) firmy Dulbecco uzupełnionej 10% (v/v) płodowej surowicy bydlęcej (FBS), 1X długopis / paciorkowiec w temperaturze 37 °C w atmosferze nawilżonej 5% CO₂.
2. Obserwuj komórki pod odwróconym mikroskopem. Gdy komórki osiągną 100% zbieżności, usuń i wyrzuć pożywkę hodowlaną.
3. Przepłukać komórki 5 ml sterylnego 1X PBS, aby usunąć ślady surowicy. Wyrzuć pranie PBS.
4. Dodać 2 ml 0,05% (m/v) roztworu trypsyny-EDTA do kolby T225 cm² (lub 1 ml 0,05% (m/v) trypsyny-EDTA do kolby T75 cm²) i inkubować w temperaturze pokojowej, aż komórki oderwą się od powierzchni. Możliwe jest również użycie sterylnego 1X PBS-EDTA do odłączenia komórek HEK 293T.
5. Dodać 13 ml DMEM z 10% (v/v) FBS do kolby T225 cm² (lub 9 ml DMEM z 10% (v/v) FBS dla kolby T75 cm²) w celu zahamowania reakcji trypsyny.
6. Podziel komórki 1:5. W^{przypadku kolby} T225 cm2 dodać 3 ml zawiesiny komórek do 27 ml świeżego DMEM z 1X pen/strep i 10% (v/v) FBS w nowym naczyniu hodowlanym. W przypadku kolby T75^cm2 dodać 2 ml zawiesiny komórek do 8 ml świeżej pożywki wzrostowej. Inkubować kultury w temperaturze 37 °C w atmosferze wilgotnej 5% CO₂. Komórki powinny osiągnąć 100% zbieżności w ciągu dwóch dni.

Pole 2. Analiza Western blot

1. Dodać 10 μl buforu redukującego SDS-PAGE do 30 μl supernatantu do hodowli komórkowych. Załaduj próbki i wstępnie wybarwione markery masy cząsteczkowej na żele poliakryloamidowe i elektroforezę za pomocą bufora 1X SDS-PAGE pod napięciem 175 V przez 1 godzinę lub do momentu, gdy markery masy cząsteczkowej zostaną dobrze rozwiązane.
2. Namocz membranę PVDF Immobilon-P w 100% metanolu na 1 minutę, aby się aktywować.
3. Zmontuj aparat western blot. Upewnij się, że membrana PVDF jest skierowana w stronę elektrody dodatniej i utrzymuj wszystkie elementy mokre za pomocą bufora transferowego 1X. Należy unikać powstawania pęcherzyków powietrza między żelem poliakrylamidowym a membraną.
4. Całkowicie napełnij komorę elektroforezy buforem transferowym 1X i przesyłaj przez 1 godzinę przy napięciu 100 V.
5. Zablokuj membranę 5% (w/v) odtłuszczonym mlekiem w 1X PBS-Tween20 na 1 godzinę w temperaturze pokojowej lub przez noc w temperaturze 4 °C.
6. Inkubować z pierwszorzędowym przeciwciałem monoklonalnym (tj. mAb anty-HA w rozcieńczeniu 1:1000 lub innym odpowiednim przeciwciałem) rozpuszczonym w 5% (m/v) odtłuszczonym mleku w 1X PBS-Tween20 przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej lub przez noc w temperaturze 4 °C.
7. Umyj membrany w 1X PBS-Tween20 przez 10 minut. Powtórz dwa dodatkowe razy.
8. Inkubować z drugorzędowym przeciwciałem monoklonalnym sprzężonym z fosfatazą alkaliczną (rozcieńczenie 1:1000 w 5% (w/v) odtłuszczonym mleku w 1X PBS-Tween20) przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej lub przez noc w temperaturze 4 °C.
9. Umyj membrany w 1X PBS-Tween20 przez 10 minut. Powtórz dwa dodatkowe razy.
10. Umieścić membranę w małym pojemniku, dodać 5 ml roztworu substratu fosfatazy alkalicznej (BCIP/NBT). Rozwój koloru powinien nastąpić w ciągu 1-5 minut. Po osiągnięciu pożądanej intensywności pasma umyj wodą dejonizowaną i wysusz na powietrzu. Kolor może z czasem wyblaknąć; Elektronicznie zeskanuj membrany po wyschnięciu.

Pole 3. Czyszczenie i recykling naczyń do hodowli komórkowych

Chociaż fabryki komórek są zaprojektowane do jednorazowego użytku, te naczynia mogą być poddane recyklingowi w celu przeprowadzenia dodatkowych transfekcji na dużą skalę, korzystając z następującego protokołu czyszczenia:

1. Natychmiast po dekantacji supernatantu z fabryki 10-warstwowych ogniw dodaj 20% (v/v) wybielacza i energicznie wstrząśnij, aby oderwać komórki. Inkubować w temperaturze pokojowej przez trzy godziny.
2. Opróżnij naczynie i dodaj świeży 20% (v/v) wybielacz i inkubuj w temperaturze pokojowej przez noc.
3. Opróżnij naczynie i umyj 1,5 l wody dejonizowanej. Powtórz trzy razy.
4. Opróżnij fabrykę 10-warstwowych komórek i dodaj 0,5 l sterylnego 1X PBS uzupełnionego 10X roztworem antybiotyku/antybiotyku. Przechowuj naczynie w temperaturze pokojowej i załóż korki odpowietrzające do napełniania portów (standardowe nasadki z gwintem 33 mm) przed następnym użyciem. Uwaga: wszystkie warstwy powinny być całkowicie przezroczyste po czyszczeniu, jeśli nie, nie używaj i nie utylizuj fabryki ogniw zgodnie z wytycznymi instytucjonalnymi.

Dyskusja

10-warstwowe fabryki komórek są skutecznym naczyniem do produkcji miligramowych ilości białka. Dużą zaletą korzystania z fabryki ogniw w porównaniu z innymi tradycyjnymi naczyniami, takimi jak butelki rolkowe, kolby do wytrząsania czy kolby obrotowe, jest to, że nie wymagają one zakupu dodatkowego sprzętu laboratoryjnego. Standardowy inkubator CO₂ (~6,0 stóp sześciennych) z łatwością pomieści cztery 10-warstwowe fabryki komórek (rys. 2). Ponadto naczynia te wymagają mniej pracy i miejsca niż n...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Płynny roztwór substratu fosfatazy alkalicznej (BCIP/NBT)	Sigma	B6404
Antybiotyk/Antybiotyk, 100X	Invitrogen	15240062
Macierz powinowactwa anty-HA, klon 3F10	Roche	1815016
Mysi mAb anty-HA, klon 16B12	Covance	MMS-101P
Kolba do hodowli komórkowych, tkanka T75 cm2 kultura poddana działaniu	Corning	430641
Kolba do hodowli komórkowych, T225 cm2 kultura tkankowa poddana działaniu	Corning	431082
Płytki do hodowli komórkowych, 6-dołkowe hodowle tkankowe poddane działaniu	Corning	3516
Fabryka komórek, 10-warstwowa CellSTACK	Corning	3312
Centramate Omega 5K Cassette	Pall	OS005C12
Centramate Omega 30K Kaseta	Pall	OS030C12
Szklana kolumna chromatograficzna, 1,0x10 cm	Kontes	4204001010
Ciprofloksacyna	Sigma	17850
CO2
Zmodyfikowana pożywka Dulbecco Eagle's (DMEM)	Sigma	D5796
Bydło płodowe surowica (FBS), inaktywowana termicznie	Invitrogen	12484-028
Odczynnik do transfekcji FuGENE HD	Promega	4709691001
Odczynnik do transfekcji GeneJuice	EMD/Merck	70967-6
Glycine	Sigma	G8898
Kozia anty-mysia IgG F(ab')2 alkaliczna	Thermo Scientific	31324
Peptyd hemaglutyniny (HA)
(sekwencja: YPYDVPDYA; 95% czystości)
Komórki HEK 293T	ATCC	CRL-11268
Wybielacz domowy (4% w/v podchlorynu sodu)	dostępne
Membrana PVDF	Millipore	IPVH07850
zestaw do oczyszczania plazmidu MiniPrep, zestaw do oczyszczania plazmidu PureLink Quick	Invitrogen	K2100-11
MaxiPrep, PureLink HiPure	Invitrogen	K2100-07
NaN3	Sigma	S8032
pDISPLAY wektor ekspresyjny	Invitrogen	V660-20
Penicylina/streptomycyna (pióro/paciorkowiec), 100X	Invitrogen	15140-122
Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS), sterylna 1X	Sigma	D8537
Polietylenoimina (PEI), liniowa 25 kDa	Polyscience	23966
Odtłuszczone mleko w proszku	Goździk
Stericup-GP PES jednostka filtracji próżniowej,	Millipore	SCGPU05RE
0,22 &m; m, pojemność
Błękit trypanowy	Invitrogen	15250061
Trypsin-EDTA, 0,05% (w/v)	Invitrogen	25300-054
Tween-20	Sigma	P7949
Kwas walproinowy	Sigma	P4543
Centramate styczny system przepływu	palli
Inkubator nawilżany CO2, standard 6,0 stóp sześciennych			są różne marki
Jednostka do elektroforezy i transferu	dostępne
Inkubator, 37 & stopnie; C			są różne marki