Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Wygodna i uniwersalna platforma ekspresyjna do produkcji białek wydzielanych z komórek ludzkich

21.1K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/4041

⸱

31 lipca 2012

 ,  ,  , 
1Department of Laboratory Medicine and Pathobiology, University of Toronto

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

W erze genomiki post-humanistycznej dostępność białek rekombinowanych w natywnych konformacjach jest kluczowa dla badań i rozwoju w obszarze strukturalnym, funkcjonalnym oraz terapeutycznym. W niniejszej pracy opisujemy system ekspresji białek w skali testowej i przemysłowej z wykorzystaniem ludzkich komórek embrionalnej nerki 293T, który może być stosowany do produkcji różnorodnych białek rekombinowanych.

Streszczenie

Ekspresja białek rekombinowanych w bakteriach, zazwyczaj *E. coli*, okazała się najskuteczniejszą strategią ekspresji białek w ilościach miligramowych. Jednakże gospodarze prokariotyczne często nie są odpowiednie do ekspresji białek ludzkich, wirusowych lub eukariotycznych ze względu na toksyczność obcej makrocząsteczki, różnice w mechanizmach fałdowania białek lub brak określonych modyfikacji ko- lub potranslacyjnych w bakteriach. Systemy ekspresyjne oparte na drożdżach (P. pastoris lub S. cerevisiae) 1,2, owad zainfekowany bakulowirusem (S. frugiperda lub T. ni) komórki 3, oraz bezkomórkowy in vitro systemy translacyjne 2,4 zostały z powodzeniem wykorzystane do produkcji białek ssaków. Intuicyjnie najlepszym rozwiązaniem jest użycie gospodarza z grupy ssaków, aby zapewnić produkcję białek rekombinowanych zawierających odpowiednie modyfikacje potranslacyjne. Liczne linie komórkowe ssaków (komórki embrionalnej nerki człowieka (HEK) 293, Ckomórki V-1 w Opochodzenia niosącego SV40 larget T-antigen (COS), komórki jajnika chomika chińskiego (CHO) oraz inne systemy zostały z sukcesem wykorzystane do nadekspresji białek ludzkich w ilościach liczonych w miligramach 5-9Jednakże zalety wykorzystania komórek ssaków są często niwelowane przez wyższe koszty, konieczność posiadania specjalistycznego wyposażenia laboratoryjnego, niższą wydajność białek oraz czasochłonny proces opracowywania stabilnych linii komórkowych ekspresyjnych. Zwiększenie wydajności oraz przyspieszenie produkcji białek przy jednoczesnym zachowaniu niskich kosztów stanowią kluczowe czynniki dla wielu laboratoriów akademickich i komercyjnych.

W niniejszej pracy opisujemy wydajną pod względem czasu i kosztów, dwuetapową procedurę ekspresji wydzielanych ludzkich białek z adhezyjnych komórek HEK 293T. System ten umożliwia otrzymanie mikrogramowych i miligramowych ilości funkcjonalnego białka do badań strukturalnych, biofizycznych i biochemicznych. W pierwszej części równolegle wytwarzane są liczne konstrukty interesującego nas genu, które następnie są przejściowo transfekowane do adhezyjnych komórek HEK 293T w małej skali. Detekcję i analizę rekombinowanego białka wydzielanego do pożywki hodowlanej przeprowadza się za pomocą analizy western blot, stosując komercyjnie dostępne przeciwciała skierowane przeciwko kodowanemu w wektorze znacznikowi oczyszczania białek. Następnie odpowiednie konstrukty do wielkoskalowej produkcji białka są przejściowo transfekowane przy użyciu polietylenoiminy (PEI) w 10-warstwowych fabrykach komórkowych (cell factories). Białka wydzielone do litrowych objętości warunkowanej pożywki są zagęszczane do ilości możliwych do dalszej obróbki za pomocą filtracji przepływu stycznego, a następnie oczyszczane metodą chromatografii powinowactwa anti-HA. Użyteczność tej platformy została potwierdzona zdolnością do ekspresji miligramowych ilości cytokin, receptorów cytokin, receptorów powierzchniowych komórek, wewnętrznych czynników restrykcyjnych oraz wirusowych glikoprotein. Metoda ta została również z sukcesem zastosowana w wyznaczeniu struktury trymerycznej glikoproteiny ebolavirus 5,10.

Podsumowując, platforma ta oferuje łatwość obsługi, szybkość i skalowalność, maksymalizując jednocześnie jakość i funkcjonalność białek. Ponadto nie jest wymagany żaden dodatkowy sprzęt poza standardowym inkubatorem z nawilżaniem i CO2. Procedura ta może zostać szybko rozszerzona na systemy o większej złożoności, takie jak koekspresja kompleksów białkowych, antygenów i przeciwciał, produkcja cząstek wirusopodobnych do szczepionek lub produkcja adenowirusów lub lentiwirusów do transdukcji trudnych linii komórkowych.

Protokół

1. Prace przygotowawcze – konstrukty i hodowle komórkowe

Przed rozpoczęciem protokołu geny docelowe powinny zostać zoptymalizowane pod kątem kodonów dla ekspresji w komórkach ssaków i sklonowane do odpowiedniego wektora ekspresyjnego przy użyciu standardowych technik biologii molekularnej. W celu zapewnienia najwyższej szansy na pomyślną ekspresję należy wygenerować wiele wariantów genu docelowego. Wiele wektorów ekspresyjnych dla ssaków jest dostępnych w sprzedaży i posiada różne znaczniki oczyszczające (m.in. polihistydynę, hemaglutyninę, streptawidynę, HALO-Tag, S-transferazę glutationową). Preferujemy stosowanie wektora pDISPLAY, który koduje silny promotor ludzkiego cytomegalowirusa, sygnał sekrecyjny Ig κ oraz znacznik oczyszczający hemaglutyninę, a także posiada C-terminalną kotwicę transbłonową, która kieruje białko przez szlak wydzielniczy w celu ekspozycji na błonie plazmatycznej. Zazwyczaj wstawiamy kodon stop przed kodowaną przez wektor kotwicą transbłonową, aby umożliwić wydzielanie białka do medium kondycjonowanego.

Ludzkie embrionalne komórki nerek (HEK) 293T są powszechnie dostępne, łatwe w hodowli i transfekcji. Komórki HEK 293T są rutynowo wykorzystywane do ekspresji białek ssaczych, jednak są uznawane za materiał biologicznie niebezpieczny i powinny być hodowane na poziomie bezpieczeństwa biologicznego 2. Należy stosować odpowiednią odzież ochronną; prace powinny być wykonywane w zatwierdzonym komorze z laminarnym przepływem powietrza z zachowaniem technik aseptycznych. Wszystkie odpady oraz powierzchnie powinny być dezynfekowane zgodnie z wytycznymi instytucjonalnymi i rządowymi. Zaleca się, aby przed użyciem komórki zostały przebadane pod kątem zanieczyszczenia mykoplazmami. W celu wyeliminowania potencjalnych zanieczyszczeń mycoplasma spp. komórki można inkubować z cyprofloksacyną (10 μg/ml) przez dziesięć dni. Ogólne protokoły namnażania komórek HEK 293T przedstawiono osobno (Ramka 1).

Dodatkowe kwestie dotyczące ekspresji białek w skali próbnej i wielkoskalowej zostały omówione w 11-15.

2. Testowa ekspresja w małej skali

Po zaprojektowaniu i wytworzeniu konstruktów można przeprowadzić małoscale testowe transfekcje z użyciem komórek HEK 293T; schemat podsumowujący ten proces przedstawiono poniżej (Rys. 1).

  1. Do hodowli komórek HEK 293T należy użyć kolb do hodowli komórkowej T75 cm2 lub T225 cm2 (w zależności od liczby planowanych testów ekspresji) i pasażować komórki co 2-3 dni, gdy osiągną 100% konfluencji (Box 1).
  2. Wysiać 2,5 x 105 komórek HEK 293T na każdą studzienkę płytki 6-dołkowej, dodać 2 ml DMEM z 1X pen/strep i 10% (v/v) FBS, delikatnie zakręcić płytką, aby zapewnić równomierny rozkład komórek w każdej studience, a następnie inkubować przez noc w temperaturze 37 °C w wilgotnej komorze z 5% CO2.
  3. Gdy komórki HEK 293T osiągną 40% konfluencji, usunąć pożywkę i dodać do studzienek świeże 2 ml DMEM z 1X pen/strep i 10% (v/v) FBS. Przeprowadzić testy transfekcji.
  4. Do sterylnej probówki do mikrocentryfugi o pojemności 1,5 ml odmierzyć 90 μl DMEM bez surowicy. Do DMEM bez surowicy pipetować 3 μl GeneJuice i delikatnie wymieszać zawartość probówki (metodą finger vortex). Inkubować przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
  5. Do mieszaniny DMEM-GeneJuice dodać 1 μg oczyszczonego plasmidowego DNA metodą MiniPrep (stok DNA = 100 ng/μl), wymieszać metodą finger vortex i inkubować przez 15 minut w temperaturze pokojowej.
  6. Mieszaninę transfekcyjną nanosić kroplowo na komórki HEK 293T, a następnie delikatnie zakręcić płytką 6-dołkową, aby umożliwić równomierne rozłożenie mieszaniny. Inkubować płytkę w temperaturze 37 °C w wilgotnej komorze z 5% CO2.
  7. 24 godziny po transfekcji do każdej studzienki dodać 1 ml świeżego DMEM z 1X pen/strep i 10% (v/v) FBS i inkubować przez kolejne 48 godzin (łącznie 72 godziny).
  8. Trzy dni po transfekcji zebrać 1 ml supernatantu z każdej studzienki i odwirować próbki w mikrocentryfudze przy 16 000 g przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Przeprowadzić analizę western blot zgodnie z opisem w Box 2. Próbki można przechowywać w temperaturze 4 °C. Czas przechowywania w 4 °C zależy od rodzaju białka.

3. Ekspresja testowa i oczyszczanie na dużą skalę

Po zidentyfikowaniu konstruktu ekspresję białka rekombinowanego w ilościach miligramowych uzyskuje się poprzez transfekcję PEI adherentnych komórek HEK 293T przy użyciu 10-warstwowych fabryk komórkowych (Rys. 2; powierzchnia 6360 cm2). W przypadku badań eksploracyjnych można zastosować mniejsze fabryki komórkowe lub kolby typu T (Tabela 1).

  1. Oczyść 1 mg DNA do transfekcji, używając zestawu do oczyszczania plazmidów MaxiPrep. Hodowla komórek XL-1 Blue o objętości 500 ml z nocnej inkubacji powinna dostarczyć co najmniej 1 mg czystego DNA. Sprawdź czystość DNA, mierząc stosunek A260/A280; powinien on wynosić powyżej 1,8.
  2. Zwiększ liczbę komórek HEK 293T do 2,0 x 108 komórek. Każda kolba T225 cm2 hodowana do 100% konfluencji zawiera średnio ~2,25 x 107 komórek.
  3. Dodaj 1,2 L DMEM z 5% (v/v) FBS do 10-warstwowej fabryki komórkowej (cell factory). Przenieś 2,0 x 108 komórek HEK 293T do fabryki komórkowej i rozmieść komórki równomiernie na wszystkich warstwach naczynia. Wizualna ocena konfluencji komórek w fabryce komórkowej jest bardzo trudna. Alternatywnie można przygotować kolbę T75 cm2 z odpowiednią liczbą komórek, stosując taki sam stosunek liczby komórek do powierzchni jak w naczyniu 10-warstwowym. Monitoruj tempo wzrostu w tej kolbie. Instrukcje dotyczące obsługi fabryki komórkowej znajdują się w powiązanym filmie. Inkubuj przez noc w temperaturze 37 °C przy 5% CO2, aby umożliwić adhezję i wzrost komórek.
  4. Przeprowadź transfekcję na dużą skalę, gdy adherentne komórki HEK 293T osiągną 70% konfluencji. Przygotuj mieszaninę transfekcyjną PEI-DNA (stosunek masowy PEI do DNA 3:1) w komorze laminarnej, używając sterylnej kolby T75 cm2. Wymieszaj 0,84 mg DNA z 84 ml sterylnego 1X PBS, następnie dodaj 2,5 ml PEI (łącznie 2,5 mg PEI). Inkubuj w temperaturze pokojowej przez 15 minut. Roztwór powinien stać się mętny.
  5. Powoli wlej mieszaninę transfekcyjną PEI-DNA do fabryki komórkowej i dokładnie rozprowadź na wszystkich warstwach naczynia. Opcjonalnie: w celu zwiększenia wydajności ekspresji dodaj kwas walproowy (stężenie końcowe 4 mM). Inkubuj w temperaturze 37 °C przy 5% CO2 przez cztery dni.
  6. Zbierz supernatant cztery dni po transfekcji. Odwiruj warunkowane medium przy 6000 x g przez 30 minut w temperaturze 4 °C. Następnie przefiltruj supernatant, używając aparatury do filtracji próżniowej Stericup 0,22 μm. 10-warstwowa fabryka komórkowa może zostać użyta ponownie; instrukcje dotyczące czyszczenia znajdują się w Boksie 3. Kluczowe jest rozpoczęcie czyszczenia natychmiast po zbiorze supernatantu; nie pozwól, aby komórki wyschły na powierzchni naczynia.
  7. Skoncentruj supernatant do 75 ml, używając systemu filtracji przepływu stycznego Centramate.
  8. Dodaj 500 ml PBS i ponownie skoncentruj do 75 ml. Powtórz tę czynność trzy dodatkowe razy, aby całkowicie wymienić bufor w próbce.
  9. Zrównoważ kolumnę powinowactwa anty-HA o objętości 1 ml za pomocą 1X PBS i nałóż skoncentrowaną próbkę metodą przepływu grawitacyjnego z prędkością <1 ml/min.
  10. Przemyj kolumnę 30 ml 1X PBS-Tween20.
  11. Rozpuść peptyd HA w 1X PBS (1,0 mg/ml) i inkubuj w temperaturze 37 °C.
  12. Nałóż 1 ml peptydu HA na kolumnę anty-HA i pozwól peptydowi wpłynąć do żywicy. Zbierz przelew. Zatrzymaj przepływ, gdy roztwór peptydu osiągnie wysokość złoża.
  13. Inkubuj całą kolumnę anty-HA w temperaturze 37 °C przez 15 minut.
  14. Powtórz krok 12 dwa dodatkowe razy.
  15. Nałóż 1 ml 1X PBS na kolumnę anty-HA i przepuść przez żywicę, aż roztwór osiągnie wysokość złoża. Zbierz przelew.
  16. Zregeneruj kolumnę anty-HA za pomocą 10 ml 0,1 M glicyny o pH 2,2. Przemyj 10 ml PBS i przechowuj kolumnę powinowactwa w temperaturze 4 °C w PBS z dodatkiem 0,02% (w/v) NaN3.
  17. Przeprowadź analizę SDS-PAGE i odpowiednio połącz frakcje. Uwaga: Peptyd HA będzie zakłócać pomiary stężenia białka metodą A280 lub metodą Bradforda. Aby oszacować ilość obecnego białka, nałóż na żel SDS-PAGE 5, 10, 15 i 25 μg BSA jako standard i porównaj intensywność prążków.

Kroki od 9 do 17 można powtórzyć, aby wyizolować dodatkowe białko z medium warunkującego.

4. Reprezentatywne wyniki

W niniejszym artykule opisujemy i prezentujemy wygodną platformę ekspresyjną do produkcji białek ludzkich w ilościach miligramowych, które mogą być następnie wykorzystane do badań strukturalnych i funkcjonalnych. Przesiewanie konstruktów białek ludzkich z wykorzystaniem komórek HEK 293T w płytkach 6-dołkowych jest wydajne i skuteczne w identyfikacji konstruktów nadających się do produkcji na większą skalę. Komercyjne wektory ekspresyjne mogą być efektywnie transfekowane do komórek HEK 293T przy użyciu różnych odczynników transfekcyjnych, takich jak GeneJuice, FuGene HD lub PEI. Do ekspresji testowych zalecamy stosowanie komercyjnych odczynników transfekcyjnych, takich jak GeneJuice lub FuGene HD, ponieważ są one bardziej skuteczne w przypadku białek o słabszej ekspresji (Rys. 3). Konstrukty wybrane do ekspresji na większą skalę powinny charakteryzować się pojedynczym, silnym prążkiem o odpowiedniej masie cząsteczkowej w analizie western blot (Rys. 3). Glikoproteiny mogą migrować jako szerszy prążek ze względu na heterogeniczność glikozylacji. Wykazaliśmy, że za pomocą tej ogólnej platformy ekspresyjnej można uzyskać miligramowe ilości białka poprzez ekspresję i oczyszczanie różnych makrocząsteczek, od glikoprotein wirusowych, cytokin, receptorów cytokinowych, po inne białka powierzchniowe (Rys. 4).

Schemat procesu transfekcji plazmidowego DNA; obejmuje rozcieńczanie, mieszanie, inkubację, komórki HEK 293T.
Rycina 1. Schemat przebiegu transfekcji w małej skali. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną rycinę.

Inkubator z 10-warstwowym systemem CellSTACK do hodowli komórkowych w ustawieniu eksperymentu z badań biologicznych.
Rycina 2. System Corning 10-layer CellSTACK do ekspresji białek na większą skalę. Każda warstwa posiada powierzchnię przyczepienia komórek o wielkości 636 cm2. Standardowy laboratoryjny inkubator CO2 (6,0 stóp sześciennych) pomieści bez problemu cztery 10-warstwowe fabryki komórkowe.

Wyniki elektroforezy białek; eksperyment z wykorzystaniem GeneJuice, FuGene HD, PEI; analiza masy cząsteczkowej.
Rysunek 3. Małoskalowa ekspresja różnych białek wydzielniczych. Przeprowadzono serię małoskalowych ekspresji testowych przy użyciu powszechnie stosowanych odczynników do transfekcji: GeneJuice, FuGene HD oraz PEI. (a) Przesiewowe badanie metodą Western blot wybranych ludzkich białek komórkowych (tetheryna), receptorów (podjednostka β IL-2R) i cytokin (IL-2). Tetheryna jest ludzką glikoproteiną błonową, która ogranicza uwalnianie nowo powstających wirionów HIV-1 16. Domena zewnątrzkomórkowa tetheryny występuje jako glikozylowany, połączony mostkami dwusiarczkowymi dimer o masie ~36 kDa. W warunkach redukujących, jak pokazano tutaj, tetheryna migruje jako monomer o pozornej masie cząsteczkowej ~22 kDa. Interleukina-2 (IL-2) jest cytokiną (~17 kDa) uczestniczącą w proliferacji limfocytów 17. Oddziałuje ona z kompleksem receptora IL-2, którego elementem jest podjednostka β IL-2R (~26 kDa) 18. CD21 jest białkiem błonowym uczestniczącym w aktywacji i dojrzewaniu limfocytów B przez układ dopełniacza, a także receptorem dla wirusa Epsteina-Barra. Glikozylowana domena zewnątrzkomórkowa CD21 migruje jako monomer o pozornej masie cząsteczkowej ~20 kDa. (b) Przesiewowe badanie metodą Western blot wybranych powierzchniowych glikoprotein wirusowych (XMRV Env i ebolavirus GP). Glikoproteiny XMRV i ebolawirusa (z usuniętą kotwicą transbłonową) występują w błonie wirusowej jako kolce trymeryczne i uczestniczą w przytwierdzaniu oraz fuzji z komórką gospodarza. Ektodomena XMRV Env i EBOV GP są silnie zmodyfikowane glikanami N-łączonymi i migrują z pozornymi masami cząsteczkowymi odpowiednio 70 kDa i 75 kDa.

Wyniki SDS-PAGE; prążki białkowe; markery masy cząsteczkowej; receptor IL-2; tetheryna; kontrola BSA.
Rysunek 4. Oczyszczone ludzkie białka komórkowe z hodowli HEK 293T w dużej skali. Wszystkie białka zostały wyekspresowane z wykorzystaniem 10-warstwowej fabryki komórkowej, a następnie skoncentrowane i oczyszczone metodą chromatografii anty-HA. Jak wykazano w analizie SDS-PAGE z barwieniem Coomassie, domeny zewnątrzkomórkowe podjednostek α i γ receptora interleukiny-2 (IL-2R) migrują przy masach cząsteczkowych odpowiednio 40 kDa i 46 kDa. Domena zewnątrzkomórkowa tetheryny migruje w warunkach nieredukujących jako dimer o pozornej masie cząsteczkowej 36 kDa. Należy zauważyć obecność zanieczyszczenia BSA, które pojawia się przy pozornej masie cząsteczkowej 60 kDa. Ponadto heterogeniczność glikanów N-stacjonarnych obecnych w tetherynie, IL-2R α i IL-2R γ powoduje poszerzenie prążków na żelu SDS-PAGE. Te N-glikany typu złożonego mogą zostać usunięte przy użyciu peptydu: N-glikozydazy F.

NaczyniePowierzchnia
Płytka 6-dołkowa9,5 cm2 (każdy dołek)
Szalki 100 mm55 cm2
Szalki 245 mm500 cm2
Kolba T75 cm275 cm2
Kolba T175 cm2175 cm2
Kolba T225 cm2225 cm2
Butelka obrotowa – standardowa850 cm2
Butelka obrotowa – o powiększonej powierzchni1700 cm2
CellSTACK 1-warstwowy636 cm2
CellSTACK 2-warstwowy1272 cm2
CellSTACK 5-warstwowy3180 cm2
CellSTACK 10-warstwowy6360 cm2
CellSTACK 40-warstwowy25 440 cm2

Tabela 1. Porównanie naczyń hodowlanych stosowanych do ekspresji białek.

Lista receptur odczynników

100X CiprofloksacynaAby przygotować 10 ml roztworu, należy dodać 10 ml wody dejonizowanej do 10 mg ciprofloksacyny. Dodać 10 μl 6N HCl, aby całkowicie rozpuścić ciprofloksacynę.

PEI (1 mg/mL) Aby przygotować 100 ml roztworu, rozpuścić 100 mg liniowego PEI 25 kDa w wodzie dejonizowanej i podgrzać do 80 °C. Schłodzić roztwór do temperatury pokojowej, dostosować pH do 7,2, wysterylizować przez filtr 0,22 μm, podzielić na aalikwoty i zamrozić w temperaturze -20 °C w celu długoterminowego przechowywania.

1X PBS Dla 1 L roztworu wodnego: 8,0 g NaCl, 0,2 g KCl, 1,4 g Na2HPO4 (bezwodny), 0,24 g KH2PO4. Dostosować pH roztworu do 7,4 i uzupełnić do 1,0 L.

1X PBS-Tween-20 Dla 1 L roztworu wodnego: 8,0 g NaCl, 0,2 g KCl, 1,4 g Na2HPO4 (bezwodny), 0,24 g KH2PO4, 1 ml Tween-20. Dostosować pH roztworu do 7,4 i doprowadzić objętość do 1,0 L.

Bufor do transferu 1X Na 1 L roztworu wodnego: 3,0 g Tris base, 14,4 g glicyny, 150 ml metanolu.

Bufor do elektroforezy SDS-PAGE 1X Do przygotowania 1 L roztworu wodnego: 3,0 g Tris base, 14,4 g glicyny, 1,0 g SDS.

Bufor do próbek redukujących SDS-PAGE Dla 10 ml roztworu: 0.6 g SDS, 3 ml glicerolu, 1.8 ml 1.0 Tris-HCl pH 6.8, 1 mg błękitu bromofenolowego, 5% (v/v) 2-merkaptoetanolu.

Ramka 1. Ogólne protokoły namnażania komórek

  1. Hodować komórki HEK 293T w pożywce Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) uzupełnionej o 10% (v/v) płodowej surowicy bydlęcej (FBS) oraz 1X pen/strep w temperaturze 37 °C w atmosferze z 5% CO2 z dodatkiem nawilżacza.
  2. Obserwować komórki pod mikroskopem odwróconym. Gdy komórki osiągną 100% konfluencji, usunąć i odrzucić pożywkę hodowlaną.
  3. Przepłukać komórki 5 ml sterylnego 1X PBS w celu usunięcia śladów surowicy. Wylać roztwór PBS.
  4. Dodać 2 ml 0,05% (w/v) roztworu trypsyny-EDTA do kolby T225 cm2 (lub 1 ml 0,05% (w/v) trypsyny-EDTA do kolby T75 cm2) i inkubować w temperaturze pokojowej do czasu odklejenia się komórek od powierzchni. Do odklejenia komórek HEK 293T można również użyć sterylnego 1X PBS-EDTA.
  5. Dodać 13 ml DMEM z 10% (v/v) FBS do kolby T225 cm2 (lub 9 ml DMEM z 10% (v/v) FBS do kolby T75 cm2), aby zahamować działanie trypsyny.
  6. Przeszczepić komórki w stosunku 1:5. W przypadku kolby T225 cm2 dodać 3 ml zawiesiny komórkowej do 27 ml świeżej pożywki DMEM z 1X pen/strep i 10% (v/v) FBS w nowym naczyniu hodowlanym. W przypadku kolby T75 cm2 dodać 2 ml zawiesiny komórkowej do 8 ml świeżej pożywki wzrostowej. Inkubować hodowle w temperaturze 37 °C w atmosferze z 5% CO2 z dodatkiem nawilżacza. Komórki powinny osiągnąć 100% konfluencji w ciągu dwóch dni.

Ramka 2. Analiza Western blot

  1. Do 30 μl supernatantu z hodowli komórkowej dodać 10 μl redukującego buforu do próbek SDS-PAGE. Próbki oraz wstępnie barwione markery masy cząsteczkowej nałożyć na żele poliakrylamidowe, a następnie przeprowadzić elektroforezę w 1X buforze do elektroforezy SDS-PAGE przy napięciu 175 V przez 1 godzinę lub do momentu wyraźnego rozdzielenia markerów masy cząsteczkowej.
  2. Membranę PVDF Immobilon-P namoczyć w 100% metanolu przez 1 minutę w celu aktywacji.
  3. Złożyć aparat do western blottingu. Upewnić się, że membrana PVDF jest skierowana w stronę elektrody dodatniej i utrzymać wszystkie komponenty w stanie wilgotnym za pomocą 1X buforu do transferu. Unikać powstawania pęcherzyków powietrza między żelem poliakrylamidowym a membraną.
  4. Komorę elektroforetyczną całkowicie wypełnić 1X buforem do transferu i przeprowadzić transfer przez 1 godzinę przy napięciu 100 V.
  5. Membranę zablokować 5% (w/v) mlekiem odtłuszczonym w 1X PBS-Tween20 przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej lub przez noc w 4 °C.
  6. Inkubować z monoklonalnym przeciwciałem pierwszorzędowym (np. przeciwciałem anty-HA mAb w rozcieńczeniu 1:1000 lub innym odpowiednim przeciwciałem) rozpuszczonym w 5% (w/v) mleku odtłuszczonym w 1X PBS-Tween20 przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej lub przez noc w 4 °C.
  7. Membrany przemyć w 1X PBS-Tween20 przez 10 minut. Powtórzyć tę czynność jeszcze dwukrotnie.
  8. Inkubować z monoklonalnym przeciwciałem wtórnym sprzężonym z fosfatazą alkaliczną (rozcieńczenie 1:1000 w 5% (w/v) mleku odtłuszczonym w 1X PBS-Tween20) przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej lub przez noc w 4 °C.
  9. Membrany przemyć w 1X PBS-Tween20 przez 10 minut. Powtórzyć tę czynność jeszcze dwukrotnie.
  10. Membranę umieścić w małym pojemniku i dodać 5 ml roztworu substratu fosfatazy alkalicznej (BCIP/NBT). Wybarwienie powinno nastąpić w ciągu 1-5 minut. Po osiągnięciu pożądanej intensywności prążków przemyć wodą dejonizowaną i wysuszyć na powietrzu. Kolor może z czasem blednąć; po wyschnięciu membrany należy wykonać ich skan elektroniczny.

Ramka 3. Czyszczenie i recykling naczyń do hodowli komórkowych

Choć fabryki komórkowe są przeznaczone do jednorazowego użytku, naczynia te można poddać recyklingowi w celu przeprowadzenia dodatkowych transfekcji na dużą skalę, stosując poniższy protokół czyszczenia:

  1. Bezpośrednio po zlaniu supernatantu z 10-warstwowej fabryki komórek, dodać 20% (v/v) podchlorynu sodu i energicznie wstrząsnąć, aby odkleić komórki. Inkubować w temperaturze pokojowej przez trzy godziny.
  2. Opróżnić naczynie, dodać świeży 20% (v/v) podchloryn sodu i inkubować w temperaturze pokojowej przez noc.
  3. Opróżnić naczynie i przemyć 1,5 L wody dejonizowanej. Powtórzyć czynność trzykrotnie.
  4. Opróżnić 10-warstwową fabrykę komórek i dodać 0,5 L sterylnego 1X PBS uzupełnionego o 10X roztwór antybiotyków/przeciwdziałający grzybiczce (Antibiotic/Antimycotic solution). Przechowywać naczynie w temperaturze pokojowej i przed kolejnym użyciem zastąpić nakrętki odpowietrzające w portach napełniających (standardowe nakrętki gwintowane 33 mm). Uwaga: po czyszczeniu wszystkie warstwy powinny być całkowicie przejrzyste; w przeciwnym razie nie używać i zutylizować fabrykę komórek zgodnie z wytycznymi instytucjonalnymi.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

10-warstwowe fabryki komórkowe (cell factories) stanowią efektywne naczynie do produkcji białek w ilościach liczonych w miligramach. Główną zaletą stosowania fabryki komórkowej w porównaniu z innymi tradycyjnymi naczyniami, takimi jak butle obrotowe, kolby wytrząsowe czy kolby z mieszadłem magnetycznym, jest fakt, że nie wymagają one zakupu żadnego dodatkowego sprzętu laboratoryjnego. Standardowy inkubator CO2 (~6,0 cu. ft.) bez problemu pomieści cztery 10-warstwowe fabryki komórkowe (Ryc. 2)....

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Nie zadeklarowano żadnych konfliktów interesów.

Podziękowania

Praca ta była wspierana przez grant badawczy Ontario HIV Treatment Network Research Operating Grant (ROG-G645) oraz Canadian Institutes of Health Research New Investigator Award (MSH-113554) przyznane dla JEL, a także stypendia University of Toronto dla HA, FCA i JDC. Autorzy chcieliby podziękować Marnie Fusco, Dafna Abelson oraz dr Ericie Ollmann Saphire ze The Scripps Research Institute (La Jolla, CA) za udostępnienie komórek, wektora ekspresyjnego GP ebolavirus oraz ogólne wskazówki.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Płynny substrat do fosfatazy zasadowej (BCIP/NBT)SigmaB6404
Antybiotyk/środek przeciwgrzybiczy, 100XInvitrogen15240062
Macierz powinowactwa anty-HA, klon 3F10Roche1815016
mysi mAb przeciwko HA, klon 16B12CovanceMMS-101P
Kolba do hodowli komórek, T75 cm2 przeznaczony do hodowli tkankowejCorning430641
Kolba do hodowli komórkowej, T225 cm2 przetworzone do hodowli tkankowejCorning431082
Płytki do hodowli komórkowej, 6-dołkowe, traktowane do hodowli tkanekCorning3516
Fabryka komórek, 10-warstwowy CellSTACKCorning3312
Kaseta Centramate Omega 5KPallOS005C12
Kaseta Centramate Omega 30KPallOS030C12
Szklana kolumna chromatograficzna, 1,0x10 cmKontes4204001010
CyprofloksacynaSigma17850
CO2
pożywka Eagle'a modyfikowana przez Dulbecco (DMEM)SigmaD5796
Płodowa surowica bydlęca (FBS), inaktywowana termicznieInvitrogen12484-028
odczyn do transfekcji FuGENE HDPromega4709691001
odczyn do transfekcji GeneJuiceEMD/Merck70967-6
GlicynaSigmaG8898
Kozie przeciwciała anty-mysie IgG F(ab')2 alkalicznyThermo Scientific31324
przeciwciało sprzężone z fosfatazą
Peptyd hemaglutyniny (HA), 100 mgGenscriptsynteza na zamówienie
(sekwencja: YPYDVPDYA; czystość 95%)
komórki HEK 293TATCCCRL-11268
Domowy wybielacz (4% m/v podchlorynu sodu)dostępne są różne marki
membrana PVDF Immobilon-PMilliporeIPVH07850
Zestaw do minipreparatywnego oczyszczania plazmidów, PureLink QuickInvitrogenK2100-11
Zestaw do oczyszczania plazmidów MaxiPrep, PureLink HiPureInvitrogenK2100-07
Błąd: brak danych wejściowych. Proszę podać tekst źródłowy do przetłumaczenia.3SigmaS8032
wektor ekspresyjny pDISPLAYInvitrogenV660-20
Penicylina/streptomycyna (pen/strep), 100XInvitrogen15140-122
Sól fizjologiczna z buforem fosforanowym (PBS), sterylna 1XSigmaD8537
Polyethylenoimina (PEI), liniowa 25 kDaWielonaukowość23966
odtłuszczone mleko w proszkuGoździk
jednorazowa jednostka do filtracji próżniowej Stericup-GP PES,MilliporeSCGPU05RE
0.22 μm, pojemność 500 ml
Błękit trypanowyInvitrogen15250061
Trypsyna-EDTA, 0,05% (m/v)Invitrogen25300-054
Tween-20SigmaP7949
Kwas walproinowySigmaP4543
System przepływu stycznego CentramatePall
CO2 inkubator z nawilżaczem, standardowy, 6 stóp sześciennychdostępne są różne marki
Układ do elektroforezy i transferudostępne są różne marki
Inkubator, 37°C °Cdostępne są różne marki

Bibliografia

  1. Celik, E., Calik, P. Production of recombinant proteins by yeast cells. Biotechnol. Adv. , (2011).
  2. Yokoyama, S. Protein expression systems for structural genomics and proteomics. Curr. Opin. Chem. Biol. 7, 39-43 (2003).
  3. Nettleship, J. E., Assenberg, R., Diprose, J. M., Rahman-Huq, N., Owens, R. J. Recent advances in the production of proteins in insect and mammalian cells for structural biology. J. Struct. Biol. 172, 55-65 (2010).
  4. Carlson, E. D., Gan, R., Hodgman, C. E., Jewett, M. C. Cell-free protein synthesis: Applications come of age. Biotechnol. Adv. , (2011).
  5. Lee, J. E. Structure of the Ebola virus glycoprotein bound to an antibody from a human survivor. Nature. 454, 177-182 (2008).
  6. Bowden, T. A. Structural basis of Nipah and Hendra virus attachment to their cell-surface receptor ephrin-B2. Nat. Struct. Mol. Biol. 15, 567-572 (2008).
  7. Evans, M. J., Hartman, S. L., Wolff, D. W., Rollins, S. A., Squinto, S. P. Rapid expression of an anti-human C5 chimeric Fab utilizing a vector that replicates in COS and 293 cells. J. Immunol. Methods. 184, 123-138 (1995).
  8. Ye, J. High-level protein expression in scalable CHO transient transfection. Biotechnol. Bioeng. 103, 542-551 (2009).
  9. Wurm, F. M. Production of recombinant protein therapeutics in cultivated mammalian cells. Nat Biotechnol. 22, 1393-1398 (2004).
  10. Lee, J. E., Fusco, M. H., Hessell, A. J., Burton, D. R., Saphire, E. O. Techniques and tactics used in determining the structure of trimeric, prefusion Ebola virus GP. Acta Cryst. 65, 1162-1180 (2009).
  11. Aricescu, A. R. Eukaryotic expression: developments for structural proteomics. Acta. Crystallogr. D Biol. Crystallogr. 62, 1114-1124 (2006).
  12. Aricescu, A. R., Lu, W., Jones, E. Y. A time- and cost-efficient system for high-level protein production in mammalian cells. Acta. Crystallogr. D Biol. Crystallogr. D62, 1243-1250 (2006).
  13. Chang, V. T. Glycoprotein structural genomics: solving the glycosylation problem. Structure. 15, 267-273 (2007).
  14. Lee, J. E., Fusco, M. H., Saphire, E. O. An efficient platform for screening expression and crystallization of glycoproteins produced in human cells. Nature Protocols. 4, 592-604 (2009).
  15. Nettleship, J. E., Rahman-Huq, N., Owens, R. J. The production of glycoproteins by transient expression in Mammalian cells. Methods Mol. Biol. 498, 245-263 (2009).
  16. Neil, S. J., Zang, T., Bieniasz, P. D. Tetherin inhibits retrovirus release and is antagonized by HIV-1 Vpu. Nature. 451, 425-430 (2008).
  17. Nakamura, Y. Heterodimerization of the IL-2 receptor beta- and gamma-chain cytoplasmic domains is required for signalling. Nature. 369, 330-333 (1994).
  18. Wang, X., Rickert, M., Garcia, K. C. Structure of the quaternary complex of interleukin-2 with its alpha, beta, and gammac receptors. Science. 310, 1159-1163 (2005).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Komórki HEK 293Tekspresja białektransfekcja przejściowafiltracja przepływu stycznegochromatografia powinowactwaanaliza Western blotpolietylenoimina PEI10-warstwowe fabryki komórkoweprodukcja białek wydzielanychoczyszczanie białek rekombinowanych
Wygodna i uniwersalna platforma ekspresyjna do produkcji białek wydzielanych z komórek ludzkich
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.