Obrazowanie poklatkowe migracji neuroblastów w ostrych wycinkach przodomózgowia dorosłej myszy

1. Etykietowanie prekursorów neuronalnych

Neuroblasty mogą być wizualizowane za pomocą transgenicznych myszy, które selektywnie wyrażają białka fluorescencyjne w neuroblastach (np. Dcx-GFP, Gad67-GFP), poprzez stereotaktyczne wstrzykiwanie cząsteczek wirusowych kodujących białka fluorescencyjne do SVZ lub RMS, lub poprzez szczepienie prekursorów neuronalnych od myszy reporterowych (np. Dcx-GFP, Gad67-GFP) do SVZ myszy typu dzikiego. Opisujemy procedurę szczepienia i znakowania wirusowego prekursorów neuronów.

Dysocjacja neuroblastów od SVZ myszy reporterowych

1. Do dysocjacji neuroblastów wymagane są następujące roztwory.

40X rozwiązanie

10 ml Pen/Strept (Pióro standardowe 10 000 u/ml/Strept 1 000 ug/ml)

10 ml glukozy (zapas 200 mg/ml)

20 ml pirogronianu sodu (zapas 100 mM)

10 ml H₂O

Przygotuj porcje 1 ml

Roztwór preparacyjny (100 ml)

HBSS 1X - 97,4 ml

FILTR (1 M) - 0,1 ml

40X roztwór - 2,5 ml

Roztwór DNazy (20 tys. jednostek/ml)

DNaseI, typ IV z trzustki bydlęcej

150 000 jednostek rozpuszcza się w 7,5 ml H₂O

Filtrowane 0,22 μm

Przygotuj porcje 1 ml

Trypsyna- Roztwór DNaseI (10 ml)

HBSS - 8,6 ml

DNaseI (20K jednostek/ml) - 0,15 ml

Trypsin-EDTA(0,5%) - 1 ml

40X roztwór - 0,25 ml

Roztwór do rozcierania (50 ml)

Pożywka neuropodstawowa - 47,5 ml

BSA (300 mg/ml) - 332,5 μl

40X roztwór - 1,25 ml

DNaseI (20 tys. jednostek/ml) - 0,66 ml

2. Znieczulenie dwu- do trzymiesięcznej dorosłej myszy wykazującej ekspresję białka fluorescencyjnego w neuroblastach za pomocą dootrzewnowego wstrzyknięcia 100 μl ketaminy/ksylazyny (10 mg/1 mg na 10 g masy ciała), a następnie odciąć głowę. Używamy myszy GAD67-GFP¹¹. Za pomocą skalpela przeciąć mózg koronalnie na poziomie komory bocznej i wyciąć SVZ w lodowatym podłożu preparacyjnym. Umieść SVZ w probówce mikrowirówkowej z 500 μl roztworu trypsyny-DNazy i trzymaj na lodzie przez 20 minut.
3. Przenieść SVZ do stożkowej probówki o pojemności 15 ml zawierającej 5 ml wstępnie podgrzanego (37 °C) roztworu trypsyny-DNazy i inkubować w temperaturze 37 °C w 5% CO₂ przez 30 minut.
4. Przenieść całą zawartość do stożkowej probówki o pojemności 50 ml zawierającej 15 ml roztworu do rozcierania i odwirować przy 1 000 x g przez 1 min. Odessać sklarowany sklarat nad osadem, dodać 10 ml roztworu do rozcierania, przenieść komórki do nowej probówki stożkowej o pojemności 15 ml i wirować przy 1000 x g przez 1 min.
5. Wypoleruj ogniowo pipetę Pasteura, aby zmniejszyć rozmiar końcówki i pokryć ją środkiem do rozcierania. Po odwirowaniu usunąć jak najwięcej supernatantu i dodać 2 ml świeżego roztworu do rozcierania do stożkowej probówki. Rozetrzeć komórki w roztworze do rozcierania (około 50 razy w górę iw dół za pomocą pipety Pasteura). Pobrać górną połowę supernatantu, który zawiera dobrze zdysocjowane komórki, i przenieść go do nowej stożkowej probówki o pojemności 15 ml zawierającej 10 ml roztworu do rozcierania.
6. Wypoleruj ogniowo pipetę Pasteura, aby jeszcze bardziej zmniejszyć rozmiar końcówki. Dodać kolejny 1 ml roztworu do rozcierania do probówki zawierającej pozostałe niezdysocjowane komórki, kontynuować rozcieranie (około 10 razy w górę i w dół) i przenieść całą zawartość do stożkowej probówki o pojemności 15 ml zawierającej uprzednio zdysocjowane komórki. Wirować przy 1 000 x g przez 7 min. Odrzucić supernatant, ponownie zawiesić granulowane komórki w 50 ml pożywki neurobazalnej, załadować do komory zliczającej i policzyć komórki.

Przeszczep żądaną liczbę komórek do SVZ, korzystając z procedury opisanej poniżej.

Stereotaktyczne wstrzyknięcie wirusa i przeszczepienie zdysocjowanych komórek

7. Wysterylizuj wszystkie narzędzia za pomocą sterylizatora perełkowego przed rozpoczęciem operacji.
8. Do wstrzykiwań stereotaktycznych należy używać szklanych mikropipet z bardzo cienkimi końcówkami (1-2 μm), aby zminimalizować uszkodzenia mózgu. Aby zrobić pipetę, pociągnij szklaną kapilę za pomocą ściągacza do pipet. Napełnij pipetę olejem parafinowym do połowy i włóż tłok wtryskiwacza Nanolitr (World Precision Instruments) do nieobrobionej końcówki pipety.
9. Za pomocą sterownika wtryskiwacza Nanolitr wciśnij olej w dół za pomocą tłoka, aż niewielka kropla oleju parafinowego wypłynie z cienkiej końcówki. Opuścić pipetę do sterylnego pojemnika z 0,5-1 μl roztworu zawierającego cząstki wirusa (1x10 6-1x10 ⁸ TU/ml) lub zdysocjowane komórki SVZ. Użyj funkcji wycofania wtryskiwacza Nanolitr, aby napełnić pipetę żądanym roztworem. Upewnij się, że wewnątrz pipety nie ma pęcherzyków powietrza.
10. Znieczulenie dwu- do trzymiesięcznej dorosłej myszy C57Bl/6 za pomocą dootrzewnowego wstrzyknięcia ketaminy/ksylazyny. Użyj elektrycznej maszynki do golenia, aby ogolić pole operacyjne na głowie. Dobrze wyczyść mokrą gazą, aby usunąć przylegające włosy.
11. Umieść mysz na ramie stereotaktycznej i zamocuj głowę. Pozbawione włosów miejsce wstrzyknięcia umyć mydłem dezynfekującym (Hibitan), a następnie 70% alkoholem (gazą lub sprayem). Zdezynfekuj miejsce za pomocą Proviodine (gazy lub sprayu) i przykryj zwierzę polem operacyjnym.
12. Wykonaj małe nacięcie w wysterylizowanej skórze myszy i ostrożnie rozprowadź skórę, aby odsłonić leżącą pod spodem czaszkę. Osusz powierzchnię czaszki. Użyj bregmy i linii środkowej jako współrzędnych zerowych, aby ustawić odpowiednio współrzędne stereotaktyczne przednio-tylne (AP) i środkowo-boczne (ML).
13. Wywierć mały otwór w czaszce nad każdą półkulą w odpowiednich współrzędnych. Unikaj uszkodzenia leżącej poniżej tkanki mózgowej. Wiercić ostrożnie, aż naruszona zostanie tylko kość. Oczyść otwór i ustaw współrzędne zerowe dla współrzędnych stereotaktycznych grzbietowo-brzusznych (DV) na powierzchni mózgu. Do wstrzyknięć do SVZ lub RMS dorosłych (22-24 g) myszy C57Bl/6 używamy następujących współrzędnych (w mm): dla SVZ: AP 0,70, ML 1,20 i DV 1,90; dla RMS: AP 2.55, ML 0.82 i DV 3.15.
14. Powoli włóż szklaną końcówkę mikropipety do mózgu, używając odpowiednich współrzędnych DV jako wskazówek, i powoli wstrzyknij niewielką ilość (wstrzykujemy 100-500 nl przy 5 nl/s) zawiesiny komórkowej (zdysocjowanej od SVZ myszy reporterowych) lub roztworu zawierającego cząsteczki wirusa. Zwykle używamy cząstek lentiwirusowych lub retrowirusowych 1x10 6-1x10⁸ TU/ml.
15. Powoli wyjmij szklaną mikropipetę, zszyj skórę nad czaszką i umieść mysz na poduszce grzewczej, aby przyspieszyć powrót do zdrowia. Gdy mysz obudzi się po operacji, należy podać jej środek przeciwbólowy (ketaprofen 10 mg/kg, SC, 1 wstrzyknięcie dziennie przez 3 dni po operacji).

2. Przygotowanie ostrych plastrów

1. Do przygotowania ostrych plastrów wymagane są następujące roztwory: a) roztwór na bazie sacharozy ze sztucznego płynu mózgowo-rdzeniowego (ACSF), zwany dalej roztworem do cięcia, w którym NaCl jest zastępowany sacharozą w celu stłumienia zwiększonej pobudliwości neuronalnej podczas procedury przygotowania plastrów, oraz b) ACSF zawierający NaCl, ogrzany do 32 °C w łaźni wodnej, do którego przenoszą się plastry i utrzymuje do momentu obrazowania.
2. Roztwory zawierają następujące składniki (w mM): roztwór tnący: 210,3 sacharoza, 3 KCI, 1,3 MgCI₂x6H₂O, 2 CaCI₂x2H₂O 26 NaHCO₃, 1,25 NaH₂PO₄, 20 glukoza; ACSF: 125 NaCI, 3 KCI, 1,3 MgCI₂x6H₂O, 2 CaCI₂x2H₂O, 26 NaHCO₃, 1,25 NaH₂PO₄, 20 glukozy. Utrzymuj roztwory na pH 7,3-7,4 i stale natleniaj, bulgocząc je 95% O₂/5% CO_{2 .}
3. Znieczulić mysz dootrzewnowym podaniem ketaminy/ksylazyny. Przygotuj lodowaty roztwór do cięcia o galaretowatym wyglądzie, używając ciekłego azotu. Przeprowadzić perfuzję śródsercową myszy tym roztworem za pomocą strzykawki o pojemności 20 cm3.
4. Zabieg ten należy wykonać szybko, zwykle 1-2 minuty na 20 ml roztworu. Jeśli naczynia krwionośne muszą zostać oznaczone, zamiast perfuzji z roztworem tnącym, wstrzyknij przezsercowo 200 μl Dextran Texas Red (10 mg / ml) do lewej komory serca i odczekaj 2-3 minuty przed odcięciem głowy myszy.
5. Odetnij głowę myszy i szybko zanurz głowę w lodowatym roztworze do cięcia. Użyj nożyczek, aby usunąć skórę głowy i przetnij czaszkę od tylnej do przedniej osi wzdłuż szwu środkowego strzałkowego od móżdżku do OB. Delikatnie usuń płaty czaszki za pomocą kleszczy.
6. Wytnij ogonową część mózgu za pomocą skalpela. Przetnij mózg wzdłuż szczeliny wewnątrzpółkulowej i wykonaj dwa strzałkowe nacięcia w najbardziej bocznej części każdej półkuli (ryc. 1A). Delikatnie wyjmij mózg za pomocą szpatułki i umieść go w roztworze do cięcia na zimno.
7. Umieść dwie półkule oddzielnie na 4% bloku agaru tak, aby strona grzbietowa dotykała agaru i przyklej blok z dwiema półkulami do platformy wibratomu. Przyklej bocznie przyciętą stronę półkuli do platformy, trzymając przyśrodkową stronę skierowaną do góry (Rysunek 1B). Umieść platformę w komorze wibratomu i napełnij ją roztworem tnącym. Utrzymuj roztwór natleniony przez cały czas przygotowania plastrów, bulgocząc nim 95% O₂/5% CO_{2 .}
8. Przygotuj skrawki o grubości 250 μm za pomocą wibratomu. Używamy wibratomu Microm HM 650 V (Thermo Scientific) i kroimy plastry z częstotliwością 100 Hz i prędkością 1 mm/sek. Aby uzyskać wysokiej jakości profile, należy stosować niską prędkość cięcia i wibracje ostrza o wysokiej częstotliwości. Jak tylko plasterek zostanie uwolniony z ostrza, delikatnie wyjmij go z roztworu tnącego i umieść w komorze inkubacyjnej wypełnionej natlenionym ACSF utrzymywanym w temperaturze 32 °C w łaźni wodnej (rysunek 1C).

Ta procedura powinna być wykonana tak szybko, jak to możliwe, aby zapewnić najlepszą jakość plastrów.

3. Obrazowanie poklatkowe migracji neuroblastów

Obrazowanie migrujących neuroblastów powinno być wykonane w ciągu 6-8 godzin od przygotowania plastrów i 3-10 dni po znakowaniu neuroblastów. Aby uniknąć zmian parametrów migracji spowodowanych wstrzyknięciem stereotaktycznym, które może wywołać uszkodzenie mózgu i aktywację glejową, należy użyć mikroelektrod szklanych z cienką końcówką (1-2 μm) w celu zminimalizowania uszkodzenia mózgu i wykonać obrazowanie w obszarach dystalnych od miejsca wstrzyknięcia (tj. obraz w RMS po wstrzyknięciu do SVZ lub w RMS opuszki węchowej po wstrzyknięciu do RMS). Chociaż obrazowanie można wykonać do 21 dni po wstrzyknięciu cząstek lentiwirusa do SVZ, zalecamy krótszy odstęp między wstrzyknięciami (3-10 dni), ponieważ umożliwia to wizualizację i śledzenie większej liczby komórek w polu widzenia.

Użyliśmy fluorescencyjnego mikroskopu BX61WI o szerokim polu widzenia (Olympus) wyposażonego w kamerę CCD (CoolSnapHQ2, Photometrics) oraz obiektyw do zanurzenia w wodzie 40X z aperturą numeryczną 0,8 (Olympus). Obiektywy o wyższym NA zapewnią obrazy o lepszej rozdzielczości. Znakowane neuroblasty (przeszczepione od myszy dawcy reporterowego lub znakowane wirusowo) były wzbudzane za pomocą Lambda DG-4 wyposażonej w lampę ksenonową o mocy 175 W (Sutter Instruments) przez 30-100 ms na akwizycję. Obrazowanie na wielu długościach fali można również wykonać przy użyciu odpowiednich zestawów filtrów (Chroma) do śledzenia migracji neuronów wzdłuż innych elementów komórkowych RMS, takich jak znakowane fluorescencyjnie astrocyty lub naczynia krwionośne. Mikroskop, kamera CCD i DG-4 były sterowane przez oprogramowanie MetaMorph (Molecular Device), które pozwalało na ustawienie różnych parametrów programu akwizycji poklatkowej (patrz poniżej). Plastry przeniesiono do ultracichej komory obrazowania PH1 Series 20 (Harvard Apparatus) zbudowanej na mikroskopie. Komora była podłączona do automatycznego systemu grzewczego (TC-344B, Harvard Apparatus) i była stale perfundowana natlenionym ACSF (rysunek 1D). Temperatura w komorze była utrzymywana na poziomie 31-33 °C, a natężenie przepływu ACSF wynosiło 1-2 ml na minutę.

1. Ostrożnie umieść plasterek w komorze obrazowania mikroskopu. Aby uniknąć dryfowania plastra podczas obrazowania, ustabilizuj go, ostrożnie umieszczając nylonową siatkę (Warner Instruments) na wierzchu plasterka. Siatka ma grubość 0,12 mm, a otwory wahają się od 0,3 do 1,13 mm. Ustawić siatkę tak, aby nie zasłaniała pola obrazowania (Rysunek 1D). Użyj obiektywu 10X, aby znaleźć pole zainteresowania, a następnie włącz obiektyw 40X i dostosuj ostrość.
2. Upewnij się, że plasterek jest stale perfundowany za pomocą ACSF i że między obiektywem a plasterkiem jest wystarczająca ilość roztworu. Zmiany szybkości perfuzji ACSF, nieregularna perfuzja lub drastyczne zmiany temperatury powodują dryfowanie i zmiany w płaszczyźnie ogniskowej podczas obrazowania.
3. Ustaw parametry akwizycji poklatkowej (tj. czas trwania wzbudzenia, liczbę płaszczyzn z, odległość między każdym odcinkiem z, interwał czasowy i czas trwania nagrania) za pomocą oprogramowania MetaMorph, które steruje systemem akwizycji i rozpocznij akwizycję poklatkową. Dane są automatycznie zapisywane przez MetaMorph jako pliki tiff, przy czym każdy plik odpowiada jednemu punktowi czasowemu pozyskanego filmu poklatkowego.
4. Wykonuj obrazowanie przez co najmniej 1-2 godziny i weź pod uwagę fazy migracji, które są przerywane przez dwie fazy stacjonarne. Obrazowanie może być wykonywane do 4 godzin (nie wykonywaliśmy sesji obrazowania trwających dłużej niż 4 godziny) bez zmian we właściwościach migracyjnych neuroblastów. Nie należy obrazować komórek na powierzchni plasterka. Zazwyczaj obrazujemy na głębokości od 20 do 100 μm. Zalecamy stosowanie krótkich interwałów akwizycji (15 - 30 sekund), aby wiarygodnie określić początek i koniec fazy stacjonarnej i migracji.
5. Aby ocenić udział określonych czynników molekularnych w migracji prekursorów neuronalnych, normalny ACSF można zastąpić ACSF zawierającym dowolny pożądany środek farmakologiczny (tj. różnych agonistów, antagonistów, blokerów, czynniki wzrostu itp.). Obrazowanie należy wykonywać przez co najmniej 1 godzinę w warunkach kontrolnych, a następnie przez 1 godzinę w obecności środka farmakologicznego.

4. Analiza migracji neuroblastów

Używamy oprogramowania Imaris (Bitplane) do analizy danych. Dzięki temu możemy automatycznie śledzić migrację komórek noworodka w 3D. Pakiet Imaris 7.0F1 zawiera moduły MeasurementsPro, Imaris Tracking, ImarisColoc, ImarisXT, Filament Tracer i InPress.

1. Aby otworzyć film w Imaris, załaduj pozyskane obrazy (pliki tiff), po prostu przeciągając i upuszczając obraz pierwszego punktu czasowego wideo na ikonę programu.
2. Po załadowaniu filmu wyreguluj jasność i kontrast sygnału w oknie Regulacja wyświetlacza, a parametry pozyskanego wideo (rozmiar woksela i interwał czasowy) ustaw w oknach Właściwości obrazu i Ustaw równoodległe punkty czasowe (rys. 4A). Po określeniu rozmiaru woksela możliwe jest zobaczenie klatki w 3D, a także czasu i skali wideo.
3. Aby automatycznie śledzić zarejestrowane komórki, utwórz punkt dla każdej komórki w polu w oknie Przekrocz, wybierając funkcję Plamy. Postępuj zgodnie z instrukcjami i ustaw parametry na podstawie obrazowanych obiektów (Rysunek 4B). Jednym z parametrów jest średnica komórki, którą można zmierzyć w oknie Slice.
4. Sprawdź niezawodność wykrytych obiektów w czasie. Jeśli wszystkie migrujące komórki nie zostaną wykryte automatycznie, zmień próg wykrywania (Rysunek 4B) i upewnij się, że wszystkie komórki zostały wybrane z plamkami we wszystkich punktach czasu.
5. Podczas automatycznego śledzenia, jeśli dwa obiekty z sąsiednich punktów czasowych nakładają się na siebie między swoimi granicami/krawędziami, dla każdego nakładania się zostanie wykonane połączenie ścieżek. Maksymalna odległość i maksymalny rozmiar odstępu (Rysunek 4C) między dwoma punktami reprezentującymi sąsiednie punkty czasowe tej samej ścieżki muszą być określone, aby program mógł połączyć punkty czasowe. Maksymalna odległość jest określana na podstawie odległości między tym samym obiektem w kolejnych punktach czasowych.
6. Po utworzeniu ścieżek można je filtrować i usuwać nieistotne ścieżki, po prostu je usuwając (Rysunek 4C). Tory można korygować, łącząc i rozłączając różne ścieżki i różne punkty czasowe tej samej ścieżki (Rysunek 4C).
7. Po wprowadzeniu wszystkich poprawek przyjrzyj się ścieżkom i wyeksportuj dane (przemieszczenie komórek na punkt czasowy, długość ścieżki, długość przemieszczenia, czas trwania ścieżki itp.) do pliku Excel (Rysunek 4D).

5. Reprezentatywne wyniki

Przetestowaliśmy i zoptymalizowaliśmy szerokokątne obrazowanie poklatkowe migracji neuroblastów. Znakowanie wirusowe lub szczepienie znakowanych fluorescencyjnie neuroblastów do SVZ pozwoliło na silną ekspresję GFP w migrujących komórkach (Figura 2). Obrazowanie o wielu długościach fali można zastosować do wizualizacji migracji neuroblastów wzdłuż innych elementów komórkowych RMS, takich jak naczynia krwionośne wypełnione dekstranem TexasRed⁴ (Figura 3 i Film 1), astrocyty znakowane fluorescencyjnie przez stereotaktyczne wstrzyknięcie wirusów z promotorem specyficznym dla komórek glejowych (Figura 2B)¹² lub specyficznie znakowane astrocyty u zwierząt transgenicznych.

Szerokokątne obrazowanie wideo migracji neuroblastów w ostrych wycinkach ujawniło solne zachowanie migrujących prekursorów neuronalnych, składające się z dwóch odrębnych faz: przemieszczenie ciała komórki neuronalnej w kierunku procesu wiodącego, oddzielonego fazą stacjonarną (Rysunek 3, Filmy 1 i 2). Aby wiarygodnie określić czas trwania fazy stacjonarnej i migracyjnej oraz wyprowadzić inne parametry migracji komórek, takie jak szybkość przemieszczania (obliczana tylko podczas faz migracji), obrazowanie przeprowadzono w 3D z wykorzystaniem krótkiego interwału akwizycji (raz na 15 lub 30 sekund). Dokładne określenie czasu trwania fazy stacjonarnej i migracyjnej ma kluczowe znaczenie dla jednoznacznej interpretacji danych. Na przykład różnice w odległości migracji w danym okresie mogą być wywołane albo zmianami tempa migracji, albo zmianami czasu trwania lub okresowości migracji i faz stacjonarnych. Tych różnych możliwości nie da się rozróżnić za pomocą długich interwałów akwizycji.

Oprogramowanie Imaris zostało użyte do analizy migracji neuroblastów w 3D i do uzyskania dodatkowych parametrów migracji komórek, takich jak czas trwania ścieżki i długość ścieżki, a także długość przemieszczenia ścieżki, która jest wektorem przemieszczenia. Prostoliniowość toru można również obliczyć, dzieląc długość toru przez długość przemieszczenia toru i wskazuje to prostoliniowość trasy migracji poszczególnych neuroblastów.

Rysunek 1. Schematyczne przedstawienie przygotowania ostrych żywych plastrów. A) Schematyczne przedstawienie jednego cięcia ogonowego, jednego śródpółkulowego i dwóch strzałkowych. B) Schematyczne przedstawienie umieszczenia mózgu myszy na bloku agaru i platformie wibratomu. C) Schematyczne przedstawienie komory inkubacyjnej z ostrymi plastrami. D) Schematyczne przedstawienie komory obrazowania zbudowanej na mikroskopie pionowym.

Rysunek 2. Znakowanie neuroblastów w RMS. A) Obraz o małym powiększeniu pokazujący solidne znakowanie neuroblastów i naczyń krwionośnych w dorosłym RMS. Retrowirus kodujący GFP został wstrzyknięty do SVZ, a komórki eksprymujące GFP (kolor zielony) zostały wykryte w RMS po 3 dniach (lewy panel). Naczynia krwionośne znakowano przez wstrzyknięcie dekstranu TexasRed do serca myszy (czerwony, prawy panel). Wstawka pokazuje obraz naczyń krwionośnych i znakowanych wirusowo neuroblastów związanych z naczyniami krwionośnymi. B) Znakowanie różnych elementów komórkowych w dorosłym RMS. Neuroblasty znakowano przez wstrzyknięcie lentiwirusa kodującego mCherry do SVZ (czerwony), astrocyty znakowano przez wstrzyknięcie lentiwirusa kodującego GFP pod kontrolą promotora GFAP w RMS (zielony), a naczynia krwionośne znakowano przez wstrzyknięcie Dextran CascadeBlue (niebieski) do serca. C) Schematyczne przedstawienie wstrzyknięcia komórek GAD67-GFP oddzielonych od SVZ myszy GAD67-GFP do SVZ dorosłej myszy typu dzikiego. D) Przeszczepione komórki GAD67-GFP (zielone) wykryte w RMS 7 dni po przeszczepieniu w SVZ. RMS jest barwiony immunologicznie za pomocą GFAP (niebieski). E) Przeszczepione komórki GAD67-GFP (zielone) były immunododatnie dla Dcx (czerwone), ale były immunoujemne dla GFAP (niebieskie). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą postać.

Rysunek 3. Obrazowanie poklatkowe neuroblastów. Obrazowanie poklatkowe migracji neuroblastów (zielone) wzdłuż naczyń krwionośnych (czerwone). Strzałki wskazują fazy migracji neuroblastów, a groty strzałek wskazują fazy stacjonarne.

Rysunek 4. Analiza migracji neuroblastów. (A-D) Różne etapy analizy migracji neuroblastów. Czerwone kółka wskazują różne funkcje wymienione w tekście. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą postać.

Wideo 1. Obrazowanie poklatkowe neuroblastów znakowanych wirusem (zielony) migrujących wzdłuż dekstranu Naczynia krwionośne znakowane Texas Red (czerwone). Kliknij tutaj, aby obejrzeć film.

Wideo 2. Śledzenie migracji neuroblastów przez oprogramowanie Imaris. Zielone kropki wskazują ciała komórek, a ścieżki wskazują odległość migracji. Kliknij tutaj, aby obejrzeć film.

Nie stwierdzono konfliktu interesów.