Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Obrazowanie time-lapse migracji neuroblastów w ostrych skrawkach przedmózgowia dorosłej myszy

14.7K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/4061

⸱

12 września 2012

 , 
1The Cellular Neurobiology Unit, Centre de Recherche Université Laval Robert-Giffard

W tym artykule

Podsumowanie

Opisujemy protokół obrazowania wideo w czasie rzeczywistym migracji neuronów w przedmózgowiu myszy. Migrację prekursorów neuronalnych oznakowanych wirusowo lub przeszczepionych rejestrowano w ostrych żywych skrawkach, wykorzystując szerokopolowe obrazowanie fluorescencyjne z relatywnie krótkim odstępem między akwizycjami, aby zbadać różne fazy migracji komórek, w tym czas trwania fazy stacjonarnej i migracyjnej oraz prędkość migracji.

Streszczenie

Istnieje obszerny zestaw dowodów wskazujących na to, że nowe funkcjonalne neurony są stale generowane z endogennej puli komórek macierzystych neuronów w ograniczonych obszarach dorosłego mózgu ssaków. Nowo powstałe neuroblasty z strefy podkomorowej (SVZ) migrują wzdłuż rostralnego prądu migracyjnego (RMS) do miejsca docelowego w opłocie węchowym (OB)1. W RMS neuroblasty migrują stycznie w łańcuchach otoczonych wypustkami astrocytów2,3, wykorzystując naczynia krwionośne jako wsparcie strukturalne oraz źródło czynników molekularnych niezbędnych do migracji4,5. W OB neuroblasty oddzielają się od łańcuchów i migrują promieniście do różnych warstw opłotu, gdzie różnicują się w interneurony i integrują z istniejącą siecią1, 6.

W niniejszym manuskrypcie opisujemy procedurę monitorowania migracji komórek w ostrych skrawkach mózgu gryzoni. Zastosowanie ostrych skrawków umożliwia ocenę migracji komórek w mikrośrodowisku ściśle przypominającym warunki in vivo oraz w regionach mózgu, które są trudnodostępne dla obrazowania in vivo. Ponadto pozwala to uniknąć długotrwałej hodowli, jak ma to miejsce w przypadku hodowli organotypowych i komórkowych, co mogłoby ostatecznie zmienić właściwości migracyjne komórek. Prekursory neuronalne w ostrych skrawkach można wizualizować za pomocą optyki DIC lub białek fluorescencyjnych. Wirusowe znakowanie prekursorów neuronalnych w SVZ, przeszczepianie neuroblastów z myszy reporterowych do SVZ myszy typu dzikiego oraz wykorzystanie myszy transgenicznych wykazujących ekspresję białka fluorescencyjnego w neuroblastach to odpowiednie metody wizualizacji neuroblastów i śledzenia ich migracji. Ta ostatnia metoda nie pozwala jednak na śledzenie pojedynczych komórek przez długi czas ze względu na wysoką gęstość znakowanych komórek. Użyliśmy szerokopolowego fluorescencyjnego mikroskopu pionowego wyposażonego w kamerę CCD, aby uzyskać stosunkowo krótki interwał akwizycji (jeden obraz co 15 lub 30 sec), co pozwoliło na wiarygodną identyfikację faz stacjonarnych i migracyjnych. Precyzyjne określenie czasu trwania faz stacjonarnych i migracyjnych jest kluczowe dla jednoznacznej interpretacji wyników. Przeprowadziliśmy również wielokrotne akwizycje w krokach z, aby monitorować migrację neuroblastów w 3D. Szerokopolowe obrazowanie fluorescencyjne jest szeroko stosowane do wizualizacji migracji neuronalnej7-10. Opisujemy tutaj szczegółowy protokół znakowania neuroblastów, przeprowadzania wideo-obrazowania migracji neuroblastów w czasie rzeczywistym w ostrych skrawkach przedmózgowia dorosłej myszy oraz analizy migracji komórek. Choć opisany protokół ilustruje migrację neuroblastów w dorosłym RMS, może on być również wykorzystany do śledzenia migracji komórek w mózgach embrionalnych i we wczesnym okresie postnatalnym.

Protokół

1. Znakowanie prekursorów neuronalnych

Neuroblasty można wizualizować przy użyciu myszy transgenicznych selektywnie wykazujących ekspresję białek fluorescencyjnych w neuroblastach (t.j. Dcx-GFP, Gad67-GFP), poprzez stereotaksycyjne wstrzykiwanie cząsteczek wirusowych kodujących białka fluorescencyjne do SVZ lub RMS, lub poprzez przeszczepianie prekursorów neuronalnych z myszy reporterowych (t.j. Dcx-GFP, Gad67-GFP) do SVZ myszy typu dzikiego. Opisujemy procedurę przeszczepiania i znakowania wirusowego prekursorów neuronalnych.

Dysocjacja neuroblastów z SVZ myszy reporterowych

  1. Do dysocjacji neuroblastów wymagane są następujące roztwory.

roztwór 40X

10 ml Pen/Strept (roztwór zapasowy Pen 10,000 u/ml/Strept 1,000 ug/ml)

10 ml glukozy (roztwór stokowy 200 mg/ml)

20 ml pirogronianu sodu (stok 100 mM)

10 ml H2O

Przygotuj aliquoty po 1 ml

Roztwór do sekcji (100 ml)

HBSS 1X - 97.4 ml

HEPES (1 M) - 0,1 ml

roztwór 40X - 2.5 ml

Roztwór DNazy (20K jednostek/ml)

DNaza I, typ IV z trzustki bydlęcej

150 000 jednostek rozpuścić w 7,5 ml H2O

Przefiltrowano przez membranę 0.22 μm

Przygotuj aliquoty po 1 ml

Roztwór trypsyny i DNazy I (10 ml)

HBSS - 8,6 ml

DNaseI (20K units/ml) - 0,15 ml

Trypsyna-EDTA(0.5%) - 1 ml

roztwór 40X - 0,25 ml

Roztwór do tryturacji (50 ml)

Pożywka Neurobasal – 47,5 ml

BSA (300 mg/ml) - 332,5 μl

roztwór 40X – 1.25 ml

DNaseI (20K units/ml) - 0,66 ml

  1. Zanestezować dorosłą mysz w wieku od dwóch do trzech miesięcy, wykazującą ekspresję białka fluorescencyjnego w neuroblastach, poprzez doszpikowe wstrzyknięcie 100 μl ketaminy/ksylazyny (10 mg/1 mg na 10 g masy ciała), a następnie przeprowadzić gilotynowanie. Stosujemy myszy GAD67-GFP11. Za pomocą skalpela wykonać cięcie koronalne mózgu na poziomie komory bocznej i wypreparować SVZ w lodowatym medium do dyssekcji. Umieścić SVZ w probówce do mikrocentryfugi z 500 μl roztworu trypsyny-DNazy i przechowywać w lodzie przez 20 min.
  2. Przenieść SVZ do probówki stożkowej o pojemności 15 ml zawierającej 5 ml uprzednio ogrzanego (37 °C) roztworu trypsyny-DNazy i inkubować w temperaturze 37 °C w 5% CO2 przez 30 min.
  3. Przenieść całą zawartość do probówki stożkowej o pojemności 50 ml zawierającej 15 ml roztworu do tryturacji i odwirować przy 1,000 x g przez 1 min. Odessać supernatant, dodać 10 ml roztworu do tryturacji, przenieść komórki do nowej probówki stożkowej 15 ml i odwirować przy 1000 x g przez 1 min.
  4. Wypalić końcówkę pipety Pasteura w celu zmniejszenia jej średnicy i pokryć ją medium do tryturacji. Po wirowaniu usunąć jak największą ilość supernatantu i dodać do probówki stożkowej 2 ml świeżego roztworu do tryturacji. Przeprowadzić tryturację komórek w roztworze do tryturacji (w górę i w dół pipetą Pasteura około 50 razy). Pobrać górną połowę supernatantu, która zawiera dobrze dysocjowane komórki, i przenieść ją do nowej probówki stożkowej 15 ml zawierającej 10 ml roztworu do tryturacji.
  5. Wypalić końcówkę pipety Pasteura, aby jeszcze bardziej zmniejszyć jej średnicę. Dodać kolejny 1 ml roztworu do tryturacji do probówki zawierającej pozostałe niedysocjowane komórki, kontynuować tryturację (około 10 razy w górę i w dół) i przenieść całą zawartość do probówki stożkowej 15 ml zawierającej wcześniej zdysocjowane komórki. Odwirować przy 1,000 x g przez 7 min. Odlać supernatant, resuspender osad komórkowy w 50 ml medium Neurobasal, nanieść na komorę licznikową i policzyć komórki.

Przeszczep pożądaną liczbę komórek do SVZ zgodnie z poniższą procedurą.

Stereotaksyczna iniekcja wirusa i przeszczepienie dysocjowanych komórek

  1. Przed rozpoczęciem zabiegu wysterylizuj wszystkie instrumenty za pomocą sterylizatora koralowego.
  2. W przypadku wstrzykiwań stereotaktycznych używaj szklanych mikropipet z bardzo cienkimi końcówkami (1-2 μm), aby zminimalizować uszkodzenia mózgu. Aby wykonać pipetę, wyciągnij kapilarę szklaną za pomocą wyciągarki do pipet. Wypełnij pipetę olejem parafinowym do połowy, a następnie wprowadź tłok wstrzykiwacza nanolitrowego (World Precision Instruments) do nieobrobionego końca pipety.
  3. Używając sterownika wstrzykiwacza nanolitrowego, dociśnij olej tłokiem w dół, aż z cienkiej końcówki zostanie wydzielona mała kropla oleju parafinowego. Zanurz końcówkę pipety w sterylnym naczyniu zawierającym 0,5-1 μl roztworu z cząstkami wirusowymi (1x106-1x108 TU/ml) lub zdysocjowanymi komórkami SVZ. Użyj funkcji wsysania wstrzykiwacza nanolitrowego, aby napełnić pipetę żądanym roztworem. Upewnij się, że wewnątrz pipety nie ma pęcherzyków powietrza.
  4. Zapodaj znieczulenie dorosłym myszom C57Bl/6 w wieku od dwóch do trzech miesięcy poprzez dostrytonalne wstrzyknięcie ketaminy/ksylazyny. Użyj maszynki elektrycznej, aby ogolić miejsce zabiegu na głowie. Dokładnie oczyść skórę wilgotną gazą, aby usunąć przylegające włosy.
  5. Umieść mysz w aparacie stereotaktycznym i unieruchom głowę. Umyj oczyszczone z włosów miejsce wstrzykiwania mydłem dezynfekcyjnym (Hibitane), a następnie 70% alkoholem (gazą lub sprayem). Zdezynfekuj miejsce preparatem Proviodine (gazą lub sprayem) i przykryj zwierzę polem operacyjnym.
  6. Wykonaj niewielkie nacięcie w wysterylizowanej skórze myszy i ostrożnie rozszerz skórę, aby odsłonić leżącą pod nią czaszkę. Osusz powierzchnię czaszki. Jako współrzędne zerowe do wyznaczenia odpowiednio przednio-tylnych (AP) i przyśrodkowo-bocznych (ML) współrzędnych stereotaktycznych wykorzystaj bregma oraz linię środkową.
  7. Wywierć mały otwór w czaszce nad każdą półkulą w odpowiednich współrzędnych. Unikaj uszkodzenia tkanki mózgowej. Wierć ostrożnie, aż do przebicia samej kości. Oczyść otwór i ustaw współrzędne zerowe dla współrzędnych grzbietowo-brzusznych (DV) na powierzchni mózgu. Do wstrzykiwań do SVZ lub RMS u dorosłych myszy C57Bl/6 (22-24 g) stosujemy następujące współrzędne (w mm): dla SVZ: AP 0,70, ML 1,20 i DV 1,90; dla RMS: AP 2,55, ML 0,82 i DV 3,15.
  8. Powoli wprowadź końcówkę szklanej mikropipety do mózgu, kierując się odpowiednimi współrzędnymi DV, a następnie powoli wstrzyknij niewielką ilość (wstrzykujemy 100-500 nl w tempie 5 nl/sec) zawiesiny komórkowej (zdysocjowanej z SVZ myszy reporterowych) lub roztworu zawierającego cząstki wirusowe. Zazwyczaj stosujemy cząstki lentiwirusowe lub retrowirusowe w stężeniu 1x106-1x108 TU/ml.
  9. Powoli wyjmij szklaną mikropipetę, zaszyj skórę nad czaszką i umieść mysz na podkładce grzewczej w celu przyspieszenia rekonwalescencji. Po przebudzeniu myszy po zabiegu podaj lek przeciwbólowy (ketoprofen 10 mg/kg, SC, 1 zastrzyk dziennie przez 3 dni po operacji).

2. Przygotowanie skrawków ostrych

  1. Do przygotowania świeżych skrawków wymagane są następujące roztwory: a) roztwór sztucznego płynu mózgowo-rdzeniowego (ACSF) na bazie sacharozy, zwany dalej roztworem do cięcia, w którym NaCl zastąpiono sacharozą w celu stłumienia zwiększonej pobudliwości neuronalnej podczas procedury przygotowywania skrawków, oraz b) ACSF zawierający NaCl, podgrzany do 32 °C w kąpieli wodnej, do którego przenosi się skrawki i w którym są one utrzymywane do czasu obrazowania.
  2. Roztwory zawierają następujące składniki (w mM): roztwór do cięcia: 210,3 sacharozy, 3 KCl, 1,3 MgCl2x6H2O, 2 CaCl2x2H2O, 26 NaHCO3, 1,25 NaH2PO4, 20 glukozy; ACSF: 125 NaCl, 3 KCl, 1,3 MgCl2x6H2O, 2 CaCl2x2H2O, 26 NaHCO3, 1,25 NaH2PO4, 20 glukozy. Należy utrzymywać pH roztworów na poziomie 7,3-7,4 i stale je natleniać poprzez przesycanie mieszaniną 95% O2/5% CO2.
  3. Mysz należy znieczulić poprzez dostarczenie ketaminy/ksylazyny drogą dosytnieniową. Przygotować lodowaty roztwór do cięcia o konsystencji żelu przy użyciu ciekłego azotu. Mysz należy perfundować wewnątrzsercowo tym roztworem za pomocą strzykawki 20-cc.
  4. Procedura ta powinna być wykonana szybko, zazwyczaj w ciągu 1-2 min dla 20 ml roztworu. Jeśli naczynia krwionośne wymagają oznakowania, zamiast perfuzji roztworem do cięcia należy wstrzyknąć przezsercowo 200 μl Dextranu Texas Red (10 mg/ml) do lewej komory serca i odczekać 2-3 min przed ścięciem głowy myszy.
  5. Po ścięciu głowy myszy należy ją szybko zanurzyć w lodowatym roztworze do cięcia. Za pomocą nożyczek usunąć skórę i przeciąć czaszkę wzdłuż osi od tyłu do przodu, wzdłuż szwu pośrodkowego sagi, od móżdżku do OB. Delikatnie usunąć klapy czaszkowe za pomocą pęsety.
  6. Wyciąć tylną część mózgu za pomocą skalpela. Przeciąć mózg wzdłuż szczeliny wewnątrzhemisferycznej i wykonać dwa cięcia strzałkowe w najbardziej bocznej części każdej półkuli (Rysunek 1A). Delikatnie usunąć mózg za pomocą szpatułki i umieścić go w lodowatym roztworze do cięcia.
  7. Umieścić obie półkule oddzielnie na bloku z 4% agaru, stroną grzbietową przylegającą do agaru, a następnie przykleić blok z obiema półkulami do platformy wibratomu. Przykleić bocznie przeciętą stronę półkuli do platformy, tak aby strona przyśrodkowa była skierowana do góry (Rysunek 1B). Umieścić platformę w komorze wibratomu i wypełnić ją roztworem do cięcia. Przez cały proces przygotowywania skrawków należy utrzymywać natlenienie roztworu poprzez przesycanie go mieszaniną 95% O2/5% CO2.
  8. Przygotować skrawki o grubości 250 μm za pomocą wibratomu. Używamy wibratomu Microm HM 650 V (Thermo Scientific) i wycinamy skrawki z częstotliwością 100 Hz i prędkością 1 mm/sec. Aby uzyskać wysokiej jakości skrawki, należy stosować niską prędkość cięcia i wysoką częstotliwość drgań ostrza. Gdy tylko skrawek zostanie uwolniony z ostrza, należy go delikatnie wyjąć z roztworu do cięcia i umieścić w komorze inkubacyjnej wypełnionej natlenionym ACSF utrzymywanym w temperaturze 32 °C w kąpieli wodnej (Rysunek 1C).

Tę procedurę należy przeprowadzić tak szybko, jak to możliwe, aby zapewnić najwyższą jakość przekrojów.

3. Obrazowanie poklatkowe migracji neuroblastów

Obrazowanie migrujących neuroblastów należy przeprowadzić w ciągu 6-8 h od przygotowania skrawków i od 3-10 dni po znakowaniu neuroblastów. Aby uniknąć zmian w parametrach migracji wynikających z iniekcji stereotaktycznej, która mogłaby wywołać uszkodzenie mózgu i aktywację gleju, należy używać szklanych mikroelektrod z cienką końcówką (1-2 μm) w celu zminimalizowania uszkodzeń mózgu oraz przeprowadzać obrazowanie w obszarach oddalonych od miejsca wstrzyknięcia (tj. obrazowanie w RMS po iniekcji do SVZ lub w RMS opuszki węchowej po iniekcji do RMS). Chociaż obrazowanie można przeprowadzić do 21 dni po wstrzyknięciu cząstek lentiwirusowych do SVZ, zalecamy krótszy odstęp po iniekcji (3-10 dni), ponieważ pozwala to na wizualizację i śledzenie większej liczby komórek w jednym polu widzenia.

Użyliśmy szerokopolowego zmotoryzowanego mikroskopu fluorescencyjnego BX61WI (Olympus) wyposażonego w kamerę CCD (CoolSnapHQ2, Photometrics) oraz obiektyw imersyjny z wodą 40X o aperturze numerycznej 0,8 (Olympus). Obiektywy o wyższej NA zapewniają obrazy o lepszej rozdzielczości. Znakowane neuroblasty (przeszczepione od myszy donora z reporterem lub znakowane wirusowo) wzbudzano urządzeniem Lambda DG-4 wyposażonym w lampę ksenonową 175 W (Sutter Instruments) przez 30-100 msec na każdą akwizycję warstwy z. Obrazowanie wielodługościowe można również przeprowadzić przy użyciu odpowiednich zestawów filtrów (Chroma), aby śledzić migrację neuronów wzdłuż innych elementów komórkowych RMS, takich jak fluorescencyjnie znakowane astrocyty lub naczynia krwionośne. Mikroskop, kamera CCD i DG-4 były sterowane za pomocą oprogramowania MetaMorph (Molecular Device), które pozwalało na ustawienie różnych parametrów programu akwizycji time-lapse (patrz poniżej). Skrawki przeniesiono do ultra-cichej komory obrazującej PH1 Series 20 (Harvard Apparatus) zamontowanej na mikroskopie. Komora była podłączona do automatycznego systemu grzewczego (TC-344B, Harvard Apparatus) i była stale perfundowana natlenionym ACSF (Rysunek 1D). Temperaturę w komorze utrzymywano na poziomie 31-33 °C, a szybkość przepływu ACSF wynosiła 1-2 ml na min.

  1. Ostrożnie umieść skrawek w komorze obrazowej mikroskopu. Aby zapobiec przesuwaniu się skrawka podczas obrazowania, ustabilizuj go, kładąc na jego górnej powierzchni siatkę nylonową (Warner Instruments). Siatka ma grubość 0.12 mm, a otwory w niej mają rozmiary od 0.3 do 1.13 mm. Ustaw siatkę tak, aby nie zasłaniała pola obrazowania (Rysunek 1D). Użyj obiektywu 10X, aby zlokalizować interesujący obszar, a następnie przełącz na obiektyw 40X i ustaw ostrość.
  2. Upewnij się, że skrawek jest stale perfundowany roztworem ACSF i że pomiędzy obiektywem a skrawkiem znajduje się wystarczająca ilość roztworu. Zmiany w szybkości perfuzji ACSF, nieregularna perfuzja lub gwałtowne wahania temperatury powodują przesuwanie się preparatu i zmiany płaszczyzny ogniskowania podczas obrazowania.
  3. Ustaw parametry akwizycji time-lapse (np. czas wzbudzenia, liczbę płaszczyzn z, odległość między poszczególnymi przekrojami z, odstępy czasowe oraz czas trwania rejestracji) za pomocą oprogramowania MetaMorph, które steruje systemem akwizycji, a następnie rozpocznij rejestrację time-lapse. Dane są automatycznie zapisywane przez MetaMorph w plikach tiff, gdzie każdy plik odpowiada jednemu punktowi czasowemu zarejestrowanego wideo time-lapse.
  4. Wykonuj obrazowanie przez co najmniej 1-2 hr, biorąc pod uwagę fazy migracji przerywane dwiema fazami stacjonarnymi. Obrazowanie można prowadzić do 4 hr (nie przeprowadzaliśmy sesji obrazowania trwających powyżej 4 hr) bez żadnych zmian w właściwościach migracyjnych neuroblastów. Nie obrazuj komórek znajdujących się na powierzchni skrawka. Zazwyczaj obrazujemy na głębokości od 20 do 100 μm. Zalecamy stosowanie krótkich odstępów akwizycji (15 - 30 sec), aby wiarygodnie określić początek i koniec faz stacjonarnych oraz migracji.
  5. Aby ocenić udział konkretnych czynników molekularnych w migracji prekursorów neuronalnych, standardowy ACSF można zastąpić roztworem ACSF zawierającym wybrany środek farmakologiczny (np. różne agonisty, antagonisty, blokery, czynniki wzrostu itp.). Wykonaj obrazowanie przez co najmniej 1 hr w warunkach kontrolnych, a następnie przez 1 hr w obecności środka farmakologicznego.

4. Analiza migracji neuroblastów

Do analizy danych wykorzystujemy oprogramowanie Imaris (Bitplane). Pozwala nam to na automatyczne śledzenie migracji nowo powstałych komórek w 3D. Pakiet Imaris 7.0F1 obejmuje moduły MeasurementsPro, Imaris Tracking, ImarisColoc, ImarisXT, Filament Tracer oraz InPress.

  1. Aby otworzyć film w programie Imaris, załaduj pozyskane obrazy (pliki tiff), po prostu przeciągając i upuszczając obraz z pierwszego punktu czasowego filmu na ikonę programu.
  2. Po załadowaniu filmu dostosuj jasność i kontrast sygnału w oknie Display adjustment oraz ustaw parametry pozyskanego filmu (wielkość woksela i odstęp czasowy) w oknie Image properties oraz Set equidistant time points (Ryc. 4A). Po określeniu wielkości woksela możliwe jest wyświetlenie klatki w 3D, a także czasu i skali filmu.
  3. Aby automatycznie śledzić zarejestrowane komórki, utwórz punkt (spot) dla każdej komórki w polu widzenia w oknie Surpass, wybierając funkcję Spots. Postępuj zgodnie z instrukcjami i ustaw parametry w oparciu o obrazowane obiekty (Rycyna 4B). Jednym z parametrów jest średnica komórki, którą można zmierzyć w oknie Slice.
  4. Sprawdź wiarygodność wykrytych obiektów w czasie. Jeśli nie wszystkie migrujące komórki zostały wykryte automatycznie, zmień próg detekcji (Rycyna 4B) i upewnij się, że wszystkie komórki zostały zaznaczone punktami we wszystkich punktach czasowych.
  5. Podczas automatycznego śledzenia, jeśli dwa obiekty z sąsiednich punktów czasowych wykazują jakiekolwiek nakładanie się ich krawędzi, dla każdego takiego nakładania utworzone zostanie połączenie ścieżki (track connection). Należy określić maksymalną odległość (maximum distance) oraz maksymalną wielkość przerwy (maximum gap size) (Rycyna 4C) między dwoma punktami reprezentującymi sąsiednie punkty czasowe tej samej ścieżki, aby program mógł połączyć punkty czasowe. Maksymalna odległość jest określana przez dystans między tym samym obiektem w kolejnych punktach czasowych.
  6. Po utworzeniu ścieżek możliwe jest ich filtrowanie i usuwanie nieistotnych ścieżek poprzez ich proste skasowanie (Rycyna 4C). Ścieżki można korygować, łącząc i rozłączając różne ścieżki oraz różne punkty czasowe tej samej ścieżki (Rycyna 4C).
  7. Po wprowadzeniu wszystkich korekt dokonaj ostatecznego przeglądu ścieżek i wyeksportuj dane (przemieszczenie komórki na punkt czasowy, długość ścieżki, długość przemieszczenia, czas trwania ścieżki itp.) do pliku Excel (Rycyna 4D).

5. Reprezentatywne wyniki

Przetestowaliśmy i zoptymalizowaliśmy szerokopolowe obrazowanie time-lapse migracji neuroblastów. Markowanie wirusowe lub przeszczepienie neuroblastów znakowanych fluorescencyjnie do SVZ pozwoliło na silną ekspresję GFP w migrujących komórkach (Rycina 2). Obrazowanie wielodługościowe można zastosować do wizualizacji migracji neuroblastów wzdłuż innych elementów komórkowych RMS, takich jak naczynia krwionośne wypełnione dekstranem TexasRed4 (Rycina 3 i Film 1), astrocyty znakowane fluorescencyjnie poprzez stereotaktyczną iniekcję wirusów z promotorem specyficznym dla komórek glejowych (Rycina 2B)12 lub specyficznie znakowane astrocyty u zwierząt transgenicznych.

Obrazowanie wideopolowe wideo migracji neuroblastów w świeżych skrawkach wyjawiło skokowy charakter przemieszczania się prekursorów neuronalnych, składający się z dwóch wyraźnych faz: przemieszczenia ciała komórki neuronalnej w kierunku procesu prowadzącego, przedzielonych fazą stacjonarną (Rysunek 3, Filmy 1 i 2). Aby niezawodnie określić czas trwania faz stacjonarnej i migracyjnej oraz wyznaczyć inne parametry migracji komórek, takie jak prędkość przemieszczania się (obliczana wyłącznie podczas faz migracji), obrazowanie przeprowadzono w 3D z zastosowaniem krótkiego interwału akwizycji (raz na 15 lub 30 s). Precyzyjna identyfikacja czasu trwania faz stacjonarnej i migracyjnej jest kluczowa dla jednoznacznej interpretacji danych. Na przykład różnice w dystansie migracji w określonym przedziale czasowym mogą wynikać albo ze zmian prędkości migracji, albo z modyfikacji czasu trwania lub periodyczności faz migracji i stacjonarnych. Możliwości te nie można rozróżnić przy zastosowaniu długich interwałów akwizycji.

Do analizy migracji neuroblastów w 3D oraz wyznaczenia dodatkowych parametrów migracji komórek, takich jak czas trwania i długość toru, a także długość przesunięcia toru, będąca wektorem przesunięcia, wykorzystano oprogramowanie Imaris. Można również obliczyć prostoliniowość toru, dzieląc długość toru przez długość przesunięcia toru, co wskazuje na stopień prostoliniowości trasy migracji poszczególnych neuroblastów.

Schemat przygotowania skrawka mózgu; etapy: cięcia wewnątrzhemisferyczne, krojenie wibratomem, ustawienie inkubacji.
Rysunek 1. Schematyczne przedstawienie przygotowania ostrych skrawków żywych tkanek. A) Schematyczne przedstawienie jednego cięcia ogonowego, jednego wewnątrzhemisferycznego i dwóch cięć strzałkowych. B) Schematyczne przedstawienie umieszczenia mózgu myszy na bloku agarowym i platformie wibratomu. C) Schematyczne przedstawienie komory inkubacyjnej dla ostrych skrawków. D) Schematyczne przedstawienie komory obrazowania zamontowanej na mikroskopie pionowym.

Schemat transplantacji neuralnych komórek macierzystych; opisane obrazy mikroskopowe z GFP, mCherry, dekstranem.
Rycina 2. znakowanie neuroblastów w RMS. A) Obraz przy niskim powiększeniu pokazujący intensywne znakowanie neuroblastów i naczyń krwionośnych w dorosłym RMS. Retrowirus kodujący GFP został wstrzyknięty do SVZ, a komórki wykazujące ekspresję GFP (zielone) wykryto w RMS po 3 dniach (panel lewy). Naczynia krwionośne zostały znakowane poprzez wstrzyknięcie dekstranu TexasRed do serca myszy (czerwone, panel prawy). Wstawka przedstawia obraz przy dużym powiększeniu naczyń krwionośnych i wirusowo znakowanych neuroblastów powiązanych z naczyniami krwionośnymi. B) Znakowanie różnych elementów komórkowych w dorosłym RMS. Neuroblasty zostały znakowane poprzez wstrzyknięcie lentiwirusa kodującego mCherry do SVZ (czerwone), astrocyty zostały znakowane poprzez wstrzyknięcie lentiwirusa kodującego GFP pod kontrolą promotora GFAP do RMS (zielone), a naczynia krwionośne zostały znakowane poprzez wstrzyknięcie dekstranu CascadeBlue (niebieskie) do serca. C) Schematyczne przedstawienie wstrzyknięcia rozdzielonych komórek GAD67-GFP z SVZ myszy GAD67-GFP do SVZ dorosłej myszy typu dzikiego. D) Przeszczepione komórki GAD67-GFP (zielone) wykryte w RMS 7 dni po przeszczepieniu do SVZ. RMS został poddany immunostynowaniu przeciwciałem przeciwko GFAP (niebieskie). E) Przeszczepione komórki GAD67-GFP (zielone) były immunoposytywne dla Dcx (czerwone), ale immunonegatywne dla GFAP (niebieskie). Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą rycinię.

Mikroskopia time-lapse; fluorescencja komórkowa, lokalizacja białek; sekwencja: 0-30 min; skala 20 μm.
Rycina 3. Obrazowanie time-lapse neuroblastów. Obrazowanie time-lapse migracji neuroblastów (zielone) wzdłuż naczyń krwionośnych (czerwone). Strzałki wskazują fazy migracji neuroblastów, a groty strzałek wskazują fazy stacjonarne.

Przebieg analizy obrazu; rozmiar woksela, detekcja progu, eksport danych; interfejs oprogramowania analitycznego.
Rycina 4. Analiza migracji neuroblastów. (A-D) Różne etapy analizy migracji neuroblastów. Czerwone okręgi wskazują różne funkcje opisane w tekście. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną rycinę.

Wideo 1. Obrazowanie time-lapse wirusowo znakowanych neuroblastów (zielone) migrujących wzdłuż naczyń krwionośnych znakowanych dekstraną TexasRed (czerwone). Kliknij tutaj, aby obejrzeć wideo.

Film 2. Śledzenie migracji neuroblastów za pomocą oprogramowania Imaris. Zielone kropki oznaczają ciała komórkowe, a linie śledzenia wskazują dystans migracji. Kliknij tutaj, aby wyświetlić film.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Prawidłowe kierowanie prekursorami neuronów do odpowiednich obszarów mózgu jest fundamentalnym procesem leżącym u podstaw właściwego montażu i funkcjonowania obwodów neuronalnych. Przeważająca większość komórek migruje podczas rozwoju embrionalnego, a w mózgu pozajęczym przemieszczanie neuronów wciąż zachodzi tylko w kilku obszarach, takich jak OB, zakręt zębaty i móżdżek. Mechanizmy koordynujące migrację komórek w mózgu pozajęczym pozostają jednak słabo poznane. Wiedza na temat mechanizmów i szlaków molekularnych zaanga...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Nie zadeklarowano żadnych konfliktów interesów.

Podziękowania

Niniejsza praca była wspierana przez grant Canadian Institutes of Health Research (CIHR) przyznany A.S. J.K otrzymał częściowe wsparcie w ramach stypendium Université Laval. A.S. jest laureatem Canada Research Chair w dziedzinie postnatalnej neurogenezy.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
SacharozaSigmaS9378
Glukoza (ACSF)EMDDX0145-3
NaCISigmaS9625
KCISigmaP9541
MgCI2x6H2OSigma-AldrichM2670
NaHCO3SigmaS5761
NaH2PO4xH2OEMDSX0710-1
CaCI2x2H2OSigma-AldrichC3881
Dekstran TexasRedInvitrogenD1864
Dekstran CascadeBlueInvitrogenD1976
Glukoza (roztwór 40X)SigmaG8769
Pirowinian soduGibco11360-070
HEPESSigmaH3375
HBSSGibco14170-112
DNaza ISigmaD-5025
Trypsyna-EDTAGibco25300-054
Pożywka NeurobasalGibco21103-049
BSAEMD2930
Pen/StrepLife Technologies15140-122
Ketamina/KsylazynaCDMV5230
Pipeta PasteuraVWR14672-380
Probówka stożkowa 15 mlSarstedt62.553.205
Probówka stożkowa 50 mlSarstedt62.547.205
Kapilary szklane (do wtryskiwania stereotaktycznego)WPI4878
Olejna parafinaEMDPX0045-3
ProviodineRougier65655-1370
SzewStoelting50487
AnafenCDMV11508
Strzykawka 20 ccVWRSS-20L2
Szalka PetriegoVWR25384-094
AgarLaboratoire MatAP-0108
KlejPermabond910
95% O2/5% CO2Linde24068835
SkalpelWPI501901
Siatka nylonowaWarner Instruments64-0198
WirówkaEppendorf5702 000.019
Wytwornica pipetSutter InstrumentP-97
Iniektor nanolitrowyWPIB203MC4
Aparat do wtryskiwania stereotaktycznegoWPI502900
System mikrowiertarkiWPI501819
WibrotomThermo Scientific920110
Fluorescencyjny mikroskop szerokopolowyOlympusBX61WIF
Kamera CCDPhotometricsCS-HQ2-D
Ultra-cicha komora obrazowaniaHarvard Apparatus64-1487
Platforma grzewcza PH-1 serii 20Harvard Apparatus64-0284
System grzewczyWarner InstrumentsTC-344B
Obiektyw imersyjny wodny 40XOlympus1-UM587
Obiektyw imersyjny wodny 10XOlympus1-UM583
Lambda DG-4Sutter InstrumentsDG-4/OF
Oprogramowanie MetaMorphMolecular Devices40000
Oprogramowanie ImarisBitplaneBPI-IM70-F1

Bibliografia

  1. Kriegstein, A., Alvarez-Buylla, A. The glial nature of embryonic and adult neural stem cells. Annu. Rev. Neurosci. 32, 149-184 (2009).
  2. Kaneko, N. New neurons clear the path of astrocytic processes for their rapid migration in the adult brain. Neuron. 67, 213-223 (2010).
  3. Lois, C., Alvarez-Buylla, A. Long-distance neuronal migration in the adult mammalian brain. Science. 264, 1145-1148 (1994).
  4. Snapyan, M. Vasculature guides migrating neuronal precursors in the adult mammalian forebrain via brain-derived neurotrophic factor signaling. J. Neurosci. 29, 4172-4188 (2009).
  5. Whitman, M. C., Fan, W., Rela, L., Rodriguez-Gil, D. J., Greer, C. A. Blood vessels form a migratory scaffold in the rostral migratory stream. J. Comp. Neurol. 516, 94-104 (2009).
  6. Lledo, P. M., Saghatelyan, A. Integrating new neurons into the adult olfactory bulb: joining the network, life-death decisions, and the effects of sensory experience. Trends Neurosci. 28, 248-254 (2005).
  7. Bolteus, A. J., Bordey, A. GABA release and uptake regulate neuronal precursor migration in the postnatal subventricular zone. J. Neurosci. 24, 7623-7631 (2004).
  8. Martini, F. J., Valdeolmillos, M. Actomyosin contraction at the cell rear drives nuclear translocation in migrating cortical interneurons. J. Neurosci. 30, 8660-8670 (2010).
  9. Murase, S., Horwitz, A. F. Deleted in colorectal carcinoma and differentially expressed integrins mediate the directional migration of neural precursors in the rostral migratory stream. J. Neurosci. 22, 3568-3579 (2002).
  10. Wilcock, A. C., Swedlow, J. R., Storey, K. G. Mitotic spindle orientation distinguishes stem cell and terminal modes of neuron production in the early spinal cord. Development. 134, 1943-1954 (2007).
  11. Ono, M., Yanagawa, Y., Koyano, K. GABAergic neurons in inferior colliculus of the GAD67-GFP knock-in mouse: electrophysiological and morphological properties. Neurosci. Res. 51, 475-492 (2005).
  12. Bozoyan, L., Khlghatyan, J., Saghatelyan, A. Astrocytes Control the Development of the Migration-Promoting Vasculature Scaffold in the Postnatal Brain via VEGF Signaling. J. Neurosci. 32, 1687-1704 (2012).
  13. Bovetti, S. Blood vessels form a scaffold for neuroblast migration in the adult olfactory bulb. J. Neurosci. 27, 5976-5980 (2007).
  14. Platel, J. C., Heintz, T., Young, S., Gordon, V., Bordey, A. Tonic activation of GLUK5 kainate receptors decreases neuroblast migration in whole-mounts of the subventricular zone. J. Physiol. 586, 3783-3793 (2008).
  15. Nam, S. C. Dynamic features of postnatal subventricular zone cell motility: a two-photon time-lapse study. J. Comp. Neurol. 505, 190-208 (2007).
  16. Kim, Y., Comte, I., Szabo, G., Hockberger, P., Szele, F. G. Adult mouse subventricular zone stem and progenitor cells are sessile and epidermal growth factor receptor negatively regulates neuroblast migration. PLoS One. 4, e8122(2009).
  17. Bortone, D., Polleux, F. KCC2 expression promotes the termination of cortical interneuron migration in a voltage-sensitive calcium-dependent manner. Neuron. 62, 53-71 (2009).
  18. Comte, I. Galectin-3 maintains cell motility from the subventricular zone to the olfactory bulb. J. Cell Sci. 124, 2438-2447 (2011).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

strefa podkomorowarostralny strumień migracyjnymikroskopia szerokopolowaznakowanie fluorescencyjneśledzenie komóreknatleniony płyn mózgowo-rdzeniowy
Obrazowanie time-lapse migracji neuroblastów w ostrych skrawkach przedmózgowia dorosłej myszy
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.