$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. Mikrotomia dla niebarwionych skrawków
- Założyć łaźnię wodną i mikrotom, jak w przypadku standardowej mikrotomii parafinowej. Użyj dodatnio naładowanych szkiełek i wstępnie oznacz je numerem przypadku, regionem trzustki (próbka) i numerem szkiełka. Umieść blok parafiny w uchwycie mikrotomowym z etykietą kasety po lewej stronie.
- Postępuj zgodnie z normalnymi procedurami mikrotomii, przekrój w blok, aż tkanka zostanie jednolicie napotkana. Sporządzić wstęgę z odcinków seryjnych (o grubości 4 μm, 3-6 w zależności od liczby początkowych wymaganych barwień (patrz Formularz zgłoszenia sprawy, Załącznik 1)). Oddziel sekcje na wstążce, podnieś każdą w kolejności i umieść na slajdach z kolejnością ponumerowaną ołówkiem. Oznacz, czy sekcja jest nieużywana, numerując je w dokładnej kolejności. Zachowaj tę samą orientację na slajdzie, jaka znajduje się w kasecie, z etykietą slajdu skierowaną w lewo. Suszyć przez noc w temperaturze pokojowej, a następnie przystąpić do barwienia lub dystrybucji do badaczy.
- Ponownie uszczelnić powierzchnię bloku parafiny cienką warstwą parafiny w celu zachowania tkanki i archiwum w temperaturze pokojowej lub -20 °C.
- W przypadku kolejnej mikrotomii należy zachować numerację sekcji seryjnych na każdym poziomie, jak powyżej. Uzyskaj 1 dodatkowy szkiełko i bejcę za pomocą szkiełka H&E na każdy poziom ~100 μM w każdym bloku.
2. Barwienie H&E
- Umieść pierwszą seryjną prowadnicę sekcyjną z każdego bloku w stojaku na prowadnice, a następnie w pierwszej tacy na autostainerze.
- Wybierz standardowy program barwienia H&E i postępuj jak zwykle.
- Po zakończeniu barwienia wyjmij szkiełka z automatycznego stainera i umieść je w kapturze do nakrycia.
- Szkiełko nakrywkowe przy użyciu standardowej techniki. Dokładnie wysuszyć i oznaczyć wydrukowaną etykietą (patrz rozdział 12).
3. Konfiguracja IHC
- Wybierz program Dako do podwójnych barwień i wprowadzania numerów szkiełek. Przygotować TBST i cytrynianowe, przeciwciała i inne odczynniki zgodnie z określonymi objętościami (Tabela 1). Załaduj tackę na odczynnik i szkiełka. Rotacja przewodów czystych i kanalizacyjnych jest zaprogramowana zgodnie z zaleceniami producenta.
- Jeśli wykonujesz te testy ręcznie, przygotuj szacunkowe objętości. Inkubuj szkiełka w wilgotnej komorze, aby uniknąć wysychania szkiełek na każdym kroku. Postępuj zgodnie z tą samą procedurą dla każdego odczynnika, co w przypadku użycia w przypadku automatycznego barwienia.
4. Deparafinizacja IHC i pobieranie antygenu
- Włóż szkiełka do ksylenu na 5 minut. Powtórz raz. Nie pozwól, aby szkiełka wyschły w żadnym kolejnym momencie, dopóki nie zostanie to wskazane, ponieważ spowoduje to nadmierne tło i słabe plamienie.
- Przenieś szkiełka do 100% etanolu na 2 minuty. Powtórz raz.
- Włóż szkiełka do świeżo przygotowanego 3% H2O2 w metanolu na 10 minut.
- Zanurz szkiełka w 90% etanolu, a następnie umieść w 90% etanolu na 3 minuty.
- Przenieś szkiełka do 70% etanolu na 1 minutę.
- Opłucz szkiełka w wodzie dejonizowanej.
- Rozgrzej parowar i bufor cytrynianowy w naczyniu do gotowania na parze przez 5 minut.
- Dodaj szkiełka do buforu cytrynianowego w naczyniu do gotowania na parze i gotuj na parze przez 30 minut.
- Natychmiast przenieś szkiełka do wody i przytrzymaj, aż szkiełka ostygną do temperatury pokojowej (~20 minut).
- Przenieś szkiełka do stojaków automatycznego stainera Dako zgodnie z kolejnością barwienia (Rysunek 1) i uruchom program podwójnego barwienia. Główne kroki programu autostainera są wymienione, aby można było powielać przebiegi ręczne.
5. Pierwsze pierwszorzędowe przeciwciała (Ki-67, CD3, polipeptyd trzustkowy)
- Blokuj slajdy roztworem snajperskim przez 15 minut. Umyć dwukrotnie za pomocą TBST.
- Inkubować szkiełka w przeciwciałie pierwszorzędowym przez 30 minut. Umyć dwukrotnie za pomocą TBST.
- Inkubować z polimerem Mach2 anty-mysiej (Ki-67) lub anty-króliczej (CD3, polipeptyd trzustkowy) peroksydazy chrzanu (HRP) przez 30 minut. Umyć dwukrotnie za pomocą TBST.
- Nakładać czterochlorowodorek 3,3 -diaminobenzydyny (DAB) na szkiełka podstawowe przez 4 minuty. Umyć dwukrotnie wodą.
- Szkiełka inkubowane z polipeptydem trzustkowym są trzymane na Dako podczas jednoczesnego oznaczania i TBST stosuje się do wszystkich kolejnych etapów, podczas gdy pozostałe szkiełka są inkubowane z drugim zestawem przeciwciał pierwszorzędowych. Alternatywnie, w przypadku testów ręcznych, przejdź do sekcji 6.
6. Drugie pierwszorzędowe przeciwciała (insulina, glukagon)
- Inkubuj szkiełka w DEEB przez 20 minut. Umyć dwukrotnie za pomocą TBST.
- Blokuj 10% normalną surowicą kozią w 20% blokerze awidyny w TBST (insulina) lub Sniper (glukagon) w TBST przez 20 minut. Umyć dwukrotnie za pomocą TBST.
- Inkubować z insuliną lub pierwotnym przeciwciałem glukagonu przez 15 minut. Umyć dwukrotnie za pomocą TBST.
- Insulina: Inkubować szkiełka w biotynylowanej kozie śwince morskiej w rozcieńczeniu 1:300 przez 30 minut. Umyć dwukrotnie za pomocą TBST. Inkubować ze standardowym odczynnikiem wektorowym ABC-AP przez 30 minut. Umyć dwukrotnie za pomocą TBST.
- Glukagon: Inkubować szkiełka w buforze przez 30 minut, a następnie kozi polimer fosfatazy alkalicznej (AP) przeciwko myszom przez 30 minut. Umyć dwukrotnie za pomocą TBST.
- Podczas gdy szkiełka są inkubowane w koniugatach, ogrzej bufor LPR do temperatury pokojowej. Dodać 1 kroplę płynu trwałej czerwieni (LPR) na 3 ml buforu bezpośrednio przed użyciem i umieścić w stojaku na odczynniki Dako. Inkubować szkiełka w LPC przez 4 minuty. Umyć dwukrotnie wodą.
- Inkubować szkiełka w hematoksylinie przez 1 minutę. Spłucz dwukrotnie wodą.
- Inkubować szkiełka w TBS pH 7,6 przez 1 minutę. Spłucz dwukrotnie wodą.
- Rozładuj szkiełka z autostainera DAKO.
- Natychmiast odwodnić szkiełka barwione na obecność polipeptydu trzustkowego. W przypadku wszystkich podwójnie zabarwionych szkiełek należy suszyć przez co najmniej 1 godzinę, a następnie odwodnić.
7. Odwodnienie
- Umieść szkiełka w 80% etanolu na 1 minutę.
- Zanurz zjeżdżalnie w 95% etanolu.
- Przytrzymaj szkiełka w 95% etanolu przez 30 sekund.
- Przenieś szkiełka do 100% etanolu i przytrzymaj 1 minutę. Powtórzyć.
- Zanurz szkiełka w ksylenie.
- Przytrzymaj szkiełka w ksylenie przez 1 minutę. Powtórzyć.
- Szkiełka nakrywkowe należy natychmiast zamontować na szkiełkach za pomocą cytoseal.
8. Etykietowanie slajdów
- Wprowadź informacje identyfikujące sprawę, w tym numer narządu i bloku, plamę oraz datę i druk. Numer seryjny sekcji jest opcjonalny dla pierwszych plam na szkiełku każdego bloku. Kolejne poziomy oznaczone są numeracją.
- Umieszczanie etykiet na slajdach.
9. Skanowanie slajdów
- Umieść poplamione szkiełka w zasobniku skanera i zeskanuj zgodnie z oprzyrządowaniem.
- Uporządkuj slajdy według dawcy i rodzaju tkanki (trzustka, głowa, tułów, ogon, śledziona).
- Archiwalne zabarwione szkiełka należy przechowywać w temperaturze pokojowej, a wszelkie pozostałe niezabarwione szkiełka w temperaturze -20 °C do momentu użycia.
10. Reprezentatywne wyniki
Te procedury barwienia zostały opracowane dla sieci JDRF dla dawców narządów trzustkowych z cukrzycą (nPOD), aby zapewnić podstawową charakterystykę parafiny i świeżo mrożonych bloków. Każdy dawca ma wykonaną charakterystykę wyjściową składającą się z barwienia 2 bloków z każdego obszaru trzustki (głowa, tułów i ogon) oraz śledziony (ryc. 1, patrz również formularz zgłoszenia przypadku, załącznik 1). Barwienie H&E odbywa się za pomocą automatycznego stainera zaprogramowanego jak w placówce klinicznej z roztworami klasy klinicznej stosowanymi w całym tekście. Gdy dodatkowe bloki dawców są dzielone, każdy z nich ma slajd pobierany dla H&E, aby pokazać morfologię tkanki. Kiedy bloki są ponownie dzielone na sekcje, tak jak w przypadku dystrybucji do badaczy, na głębszych poziomach zostaną również wykonane slajdy jako reprezentatywne slajdy H&E w celu udokumentowania morfologii tkanek całego bloku, a także numerowania sekcji seryjnych na każdym poziomie. Barwione preparaty są oznaczane identyfikacją przypadku, regionem trzustki, numerem bloku, plamą i datą (ryc. 2) i skanowane do internetowego systemu zarządzania informacjami patologicznymi. Reprezentatywne obrazy od dawcy kontrolnego są pokazane na rycinie 3 zarówno przy małym, jak i dużym powiększeniu, aby pokazać oczekiwane wyniki po tej procedurze. Szkiełko barwione polipeptydem trzustkowym (D,H) zostało oznaczone w innym dniu testem wykonanym ręcznie i wykazuje zmniejszoną intensywność barwienia przeciwbarwienia hematoksyliny. Należy unikać różnic w intensywności barwienia przeciwciał pierwszorzędowych lub barwienia przeciwbarwiącego między testami, szczególnie w przypadku korzystania z analizy obrazu, w przeciwnym razie szkiełka wymagają indywidualnej korekcji koloru w celu uzyskania tych samych obszarów komórek lub liczby.
Każde laboratorium powinno oczekiwać optymalizacji stężeń przeciwciał, ponieważ zmienność między partiami oraz inne odczynniki i warunki mogą wpływać na intensywność i swoistość barwienia. Wraz z nabyciem nowych odczynników, procedury barwienia są walidowane na znanych dodatnich i ujemnych próbkach kontrolnych w celu osiągnięcia takiego samego stopnia intensywności barwienia, jak w przypadku poprzednich odczynników. Dodatkowe przeciwciała zoptymalizowane w rdzeniu patologii nPOD przedstawiono w tabeli 2 jako źródło odniesienia i wykorzystano je do wieloznakowych testów immunofluorescencyjnych w mikroskopii konfokalnej.
Rysunek 1. Siatka do barwienia Dako. Ten schemat przedstawia rutynową analizę trzustki dawcy nPOD wykonaną na autostainerze Dako. Dawcy nPOD są zakodowani 4-cyfrowym numerem identyfikacyjnym. Pokazane są dwie tace na slajdy ze slajdami uporządkowanymi według plamy. Oczekiwane są alternatywne konfiguracje slajdów w zależności od liczby slajdów dawcy. Kontrole pozytywne obejmują włączenie znanego dodatniego dawcy dla dwóch podwójnych barwników i śledziony dawcy dla Ki-67 i CD3. Kontrole ujemne są dwojakie i obejmują dwa preparaty z jednego bloku trzustki dawcy inkubowanego z immunoglobuliną (Ig) z gatunku gospodarza przeciwciał pierwotnych oraz dwa preparaty ze śledziony dawcy dla insuliny i glukagonu.
Rysunek 2. Reprezentatywna podwójnie barwiona szkiełko. Typowy gotowy preparat jest pokazywany z parametrami etykietowania szkiełka i umieszczeniem tkanki przed wykonaniem skanowania cyfrowego.
Rysunek 3. Reprezentatywne barwienia H&E i IHC w odcinkach trzustki. Wycinki trzustki dorosłej dawczyni narządów (6096-04 PanHead) wybarwiono i wykonano skany cyfrowe zgodnie z opisem w protokole. Obrazy uzyskano za pomocą programu do przeglądania ImageScope całego przekroju (A-D) oraz z jednej wysepki (E-H). Oczekiwana intensywność barwienia wysp trzustkowych dla insuliny, glukagonu i polipeptydu trzustkowego jest obserwowana dla sekcji B-D, ponieważ sekcja D określa, że ten blok głowy trzustki zawiera niewielką część obszaru nienaruszonego lub brzusznego płata trzustki, ponieważ wszystkie wyspy zawierają głównie komórki polipeptydowe trzustki. Należy pamiętać, że barwnik przeciwbarwiący hematoksyliną w panelu D jest zbyt jasny, podczas gdy intensywność barwienia hematoksyliną w B i C jest optymalna. Panele E-H pokazują wysepkę z płata grzbietowego z oczekiwanym rozmieszczeniem komórek β i komórek α. Kilka komórek polipeptydowych trzustki znajduje się w lewej dolnej części wyspy trzustkowej (H). A, E- H&E; B, F- Ki67 + Insulina; C, G- CD3 + Glukagon; D, H- Polipeptyd trzustki. A-D, 0,2x, E-H- 12,8x.