Analiza transkrypcji genów w pojedynczych komórkach metodą fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ (FISH) RNA

Podsumowanie

Fluorescencyjna hybrydyzacja in situ (FISH) służąca do identyfikacji transkryptów mRNA w pojedynczych komórkach umożliwia analizę aktywności poligenowej, takiej jak jednoczesna transkrypcja więcej niż jednego członka wielogenowej rodziny var w erytrocytach zakażonych Plasmodium falciparum ¹. Technika ta jest adaptowalna i może być stosowana w odniesieniu do różnych typów genów, komórek i organizmów.

Streszczenie

Adhezja erytrocytów (IE) zainfekowanych Plasmodium falciparum do ludzkich receptorów śródbłonka podczas infekcji malarią jest pośredniczona przez ekspresję wariantów białka PfEMP1 kodowanych przez geny var.

Haploidalny genom P. falciparum zawiera około 60 różnych genów var, z których dotychczas uważano, że tylko jeden jest transkrybowany w jednej komórce w danym czasie podczas stadium krwistego infekcji. Nie jest jasne, w jaki sposób osiągana jest taka wzajemnie wykluczająca się regulacja transkrypcji genów var, podobnie jak identyfikacja poszczególnych genów var lub podgrup genów var związanych z różnymi receptorami oraz wpływ różnicowego wiązania na wynik kliniczny infekcji P. falciparum. Niedawno paradygmat wzajemnie wykluczającej się transkrypcji został zakwestionowany przez testy transkrypcyjne oparte na identyfikacji pojedynczych transkryptów P. falciparum w pojedynczych zakażonych komórkach erytrocytarnych przy użyciu analizy fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ RNA (FISH) transkrypcji genów var przez pasożyta w pojedynczych jądrach P. falciparum IE¹.

W niniejszym opracowaniu przedstawiamy szczegółowy protokół przeprowadzania metody RNA-FISH w celu analizy transkrypcji genów var w pojedynczych jądrach ludzkich erytrocytów zainfekowanych P. falciparum. Metoda ta opiera się na zastosowaniu sond RNA antysensownych znakowanych digoksigeniną i biotyną przy użyciu systemu TSA Plus Fluorescence Palette System² (Perkin Elmer), analizach mikroskopowych oraz świeżo wyselekcjonowanych IE P. falciparum. Metoda hybrydyzacji in situ może być wykorzystana do monitorowania transkrypcji i regulacji szeregu genów ekspresjonowanych w różnych stadiach cyklu życiowego P. falciparum i jest możliwa do zaadaptowania do innych gatunków pasożytów malarii oraz innych organizmów i typów komórek.

Protokół

1. Uzyskiwanie świeżo wyselekcjonowanych zainfekowanych erytrocytów

W przypadku tego testu najlepsze wyniki uzyskuje się, stosując świeżo wyselekcjonowane hodowle pod kątem ekspresji powierzchniowej białka PfEMP1. W tym konkretnym eksperymencie linia 3D7 P. falciparum została wyselekcjonowana przy użyciu specyficznych przeciwciał, zgodnie z wcześniejszym opisem¹.

Dzień 1

1. Odwirować 200 μl upakowanych komórek krwi z hodowli P. falciparum zawierającej 2-5 % IE w stadium późnym, wirując przy 800 x g przez 8 min w temperaturze pokojowej.
2. Resuspender osad krwi w 2 ml po....

Wyniki

Rysunek 1 przedstawia schemat blokowy głównych etapów oraz czas trwania procedury RNA FISH.

Seria reprezentatywnych obrazów dobrze i słabo zachowanych eksperymentów mRNA FISH z barwieniem pojedynczych IE P. falciparum została przedstawiona na Rysunku 2. Ten wewnątrzkomórkowy pierwotniak posiada małe jądro (o średnicy 1-1,5 μm), które jest barwione na niebiesko za pomocą DAPI. Dwadzieścia cztery godziny po inwazji erytrocytów przez P. falciparum

Dyskusja

Analiza RNA FISH, w przeciwieństwie do metod takich jak Northern blotting i RT-PCR, umożliwia rozróżnienie konkretnych transkryptów mRNA na poziomie pojedynczej komórki. Pozwala to na odróżnienie komórek transkrypcyjnie aktywnych od nieaktywnych – w tym przykładzie pierwotniaków P. falciparum znajdujących się wewnątrz ludzkich erytrocytów. Takie obserwacje całych komórek są często niezbędne i mogą ujawnić istotne oraz nowe wzorce transkrypcyjne¹.

Choć opisano inne metody RN.......

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Kwas octowy	Sigma/Aldrich	338826-100ml
Pożywka Albumax: roztwór RPMI 1640 z glutaminą	Lonza	BE12-115F	500 ml RPMI 1640 5 ml roztworu glutaminy
Pożywka Albumax: Siarczan gentamycyny, roztwór Albumax	Lonza	BE02-012E	2,5 ml siarczanu gentamycyny 50 ml roztworu Albumax
roztwór Albumax: Hypoksantamina	Sigma-Aldrich	H9377	0,8 g hypoksantyny
roztwór Albumax: AlbuMAX II	Invitrogen	11021-037	200 g Albumaxu
roztwór Albumax: RPMI 1640	Lonza	BE12-115F	4 litry pożywki RPMI 1640 Rozpuścić przy użyciu magnesa w temp. maks. 50°C °C. Przefiltruj przez sterylny filtr i przechowuj w temperaturze -20°C °C w alikwotach.
Amberlite	Sigma	A5710-110G	Żywica do dejonizacji formamidu.
Koniugat peroksydazowy przeciwbiotynowych przeciwciał poliklonalnych kozich	Calbiochem	203206
Przeciwciało anty-digL	Novus Biologicals	NB100-41330
Odczyn antyblaknący z DAPI	Invitrogen	P36931	Medium montażowe musi utwardzać się przez 24 h przed całkowitym zamknięciem preparatu.
Mieszanina do znakowania RNA biotyną	Roche	11685597910
Aparat cyfrowy	Cyfrowa kamera Nikon Digital Sight DC-F11
Krywinki	Menzel-glaser	631-1570
kolba hodowlana 25 cm2 powierzchnia Nunclon	Nunc	156340
DEPC	Fluka/Sigma	32490-100ml	1 ml DEPC w 1000 ml wody dejonizowanej. Dodać mieszadło magnetyczne i mieszać przez 12 h. Autoklawować przez 30 min.
Aparat cyfrowy	Nikon digital sight DC-F11
Dynabeads Protein A	Invitrogen	10002D
Magnes DynaMaq-15	Invitrogen	123-01D
Formamid bioultra 99%	Fluka/Sigma	47671-1l-F	Dejonizowana formamida: 5 g żywicy jonowymiennej na 100 ml formamidy. Mieszać przez 30 min. Przefiltrować przez papier Whatmana.
Żelatyna 0.roztwór 75%: Żelatyna	Sigma-Aldrich	G2500	3,75 g żelatyny w 500 ml RPMI 1640. Podgrzać do 56 °C do rozpuszczenia. Sterylizować przez filtrowanie, gdy 56 °C. Przechowywać w temperaturze -20°C °C w alikwotach.
Żelatyna 0.roztwór 75%: RPMI 1640	Lonza	BE12-115F	3,75 g żelatyny w 500 ml RPMI 1640. Podgrzać do 56 °C do rozpuszczenia. Sterylizować przez filtr w przypadku 56 °C. Przechowywać w temperaturze -20°C °C w aliquotach.
Roztwór glutaminy: L-glutamina	Sigma-Aldrich	G3126	14,6 g L glutaminy w 500 ml 0,9% NaCl. Rozpuścić, wysterylizować przez filtrację i przechowywać w temperaturze -20°C °C w alikwotach.
Roztwór glutaminy: HCl	Sigma	H1758	14,6 g L glutaminy w 500 ml 0,9% NaCl. Rozpuścić, wysterylizować przez filtrację i przechowywać w temperaturze -20°C °C w alikwotach.
Roztwór do hybrydyzacji: Formamid Bio ultra, 99% SSC 20x	Fluka/Sigma	47671-1l-F	Łącznie 20 ml, przechowywać w zamrożeniu w temperaturze -20°C °C w alikwotach 10 ml zdejonizowanego formamidu
Roztwór do hybrydyzacji: 50-krotny koncentrat roztworu Denhardta	Sigma	D2532	5 ml 20xSSC
Roztwór do hybrydyzacji: tRNA drożdżowa odczyn blokujący Roche	Sigma	R-6750	2 ml 50x roztworu Denhardta 250 μ20 mg/ml tRNA drożdżowej
Roztwór do hybrydyzacji: DNA z plemników łososia	Fluka/Sigma	31149-106GF	0,4 g odczynnika blokującego Roche 1 ml 10 mg/ml DNA z plemni łososia (Kluczowe: zdenaturować DNA z plemni łososia w temperaturze 96°C) °C przez 5 min przed dodaniem do roztworu hybrydyzacyjnego)
Hybrydyzator ThermoStar 100 HC4	Quantifoil Instruments GmbH	1004-0011	Można zastąpić piecem do hybrydyzacji oraz wolnymi od RNazy komorami do hybrydyzacji zwilżonymi wodą z DEPC.
Olej immersyjny transparentny w UV, wolny od fluorescencji	Sigma	10976-1EA
Mikroskop fluorescencyjny lub konfokalny	Nikon D-Eclipse TE2000C
Lakier do paznokci	Dostępne w każdej aptece
PBS 20x: NaCl KCl Na2HPO4 x 2h2O KH2PO4 odjonizowana woda z DEPC2O			Dostosować pH do 7,4 160 g 4 g 23 g 4 g 1 l
Paraformaldehyd 4%	Fluka/chemika	76240	4 g PFA w 80 ml PBS/DEPC. Podgrzać do 65 °C aż do rozpuszczenia PFA. Dodać 20 ml PBS, pozwolić roztworowi ostygnąć. Dostosować pH do wartości 7,4. Przefiltrować. Przechowywać w alikwotach w temperaturze -20°C. °C.
Paraformaldehyd 4 %/ Kwas octowy 5 %			950 μl paraformaldehydu + 50 μkwas octowy
Pepsyna	Sigma/Aldrich	P7000
Przeciwciało przeciwko biotynie sprzężone z peroksydazą	Calbiochem	203206
pożywka do przemywania erytrocytów: roztwór glutaminy RPMI 1640	Lonza	BE12-115F	500 ml RPMI 1640 5 ml roztworu glutaminy
Medium do płukania erytrocytów: Siarczan gentamycyny	Lonza	BE02-012E	2,5 ml siarczanu gentamycyny
RNaza	Sigma/Aldrich		Przygotować roztwór zapasowy o stężeniu 10 mg/ml.
probówka 1,5 ml wolna od RNaz	Ambion	AM12450
RNaza Zap	Ambion	AM9780
Przeszkła z 4 dołkami 11 mm	Thermo Scientific	MENZXER306W
SSC 20x: NaCl	Sigma/Aldrich	S9625	3 M NaCl (175 g/l) 0,3 M Na3 cytrynian x H2O (88 g/l) Doprowadzić do pH 7,0 za pomocą 1M HCl
SSC 20x: Cytrynian sodu uwodniony	Sigma/Aldrich	W302600	3 M NaCl (175 g/l) 0,3 M Na3 cytrynian x H2O (88 g/l) Doprowadzić do pH 7,0 przy użyciu 1M HCl
SSPE 20x: NaCl	Sigma/Aldrich	S9625	175,3 g NaCl
SSPE 20x: NaH2PO4	Sigma/Aldrich	S0751	27,6 g NaH2PO4.
SSPE 20x:4 proszek EDTA			9,4 g proszku EDTA Dodać wodę z DEPC, dostosować pH do 7,4. Autoklawować przez 20 min.
Bufor TNB: bufor TNT			10 ml buforu TNT
Bufor TNB: Odczynnik blokujący			0,05 g odczynnika blokującego Aby rozpuścić odczyn blokujący, należy podgrzać roztwór do 60 °C przez jedną godzinę przy mieszaniu. Przechowywać w temperaturze -20°C °C. (Opracowano na podstawie protokołu TSA firmy Perkin Elmer.)
bufor TNT: Tris/HCl	Sigma	T1503	1M Tris/HCl, pH 8,0
Bufor TNT: NaCl	Sigma Aldrich	S9625	100 ml
bufor TNT: Tween20	Sigma	93773	30 ml 5 M NaCl 1 ml dH2O z DEPC2O 869 Ml Dostosować pH do wartości 7,5 w temperaturze pokojowej. (Opracowano na podstawie protokołu TSA firmy Perkin Elmer).
System TSA plus Cyanine3/ Fluorescein	Perkin Elmer	NEL753000IKT	Przed rozpoczęciem eksperymentu należy dokładnie zapoznać się z protokołem dołączonym do systemu TSA Plus Fluorescence Palette System.
Probówki sterylne 14 ml	Almeco - CM LAB Aps	91016