Elektroporacja in ovo embrionów kurzych w stadium 10 według HH

Podsumowanie

Elektroporacja in ovo zarodka kurczaka jest techniką pozwalającą na manipulacje genetyczne w embrionie ptaka. Typowe zastosowania tej metody obejmują analizę funkcjonalną genów oraz domniemanych elementów wzmacniających. Niniejszy film prezentuje elektroporację cewy nerwowej w embrionach kurczaka w stadium HH 10. Omówiono technikę iniekcji oraz prawidłową obsługę jaj.

Streszczenie

Duże rozmiary oraz rozwój zewnętrzny zarodka kurczaka sprawiły, że od dawna jest on cennym narzędziem w badaniach nad biologią rozwoju. Wraz z pojawieniem się technik biologii molekularnej, kurczak stał się użytecznym systemem do badania regulacji i funkcji genów. Poprzez elektroporację konstruktów DNA lub RNA do rozwijającego się zarodka kurczaka, możliwe jest wywołanie ekspresji genów lub ich wyciszenie w celu analizy funkcji genów in vivo. Podobnie, konstrukty reporterowe mogą być wykorzystywane do mapowania losów komórek lub badania domniemanych elementów regulacyjnych genów. W porównaniu do analogicznych eksperymentów u myszy, elektroporacja u kurcząt ma zalety takie jak szybkość, łatwość wykonania i niski koszt. Niniejszy film demonstruje najpierw, jak wykonać okno w skorupce jaja w celu manipulacji zarodkiem. Następnie zarodek jest wizualizowany za pomocą wstrzykniętego pod niego rozcieńczonego roztworu tuszu indyjskiego. Szklana igła i pipeta służą do wstrzyknięcia DNA oraz barwnika Fast Green do rozwijającej się cewy nerwowej, a następnie elektrody platynowe są umieszczane równolegle do zarodka i za pomocą generatora impulsów podawane są krótkie impulsy elektryczne. Na koniec jajo jest uszczelniane taśmą i umieszczane z powrotem w inkubatorze w celu dalszego rozwoju. Ponadto film przedstawia prawidłowe przechowywanie i obchodzenie się z jajami oraz omawia możliwe przyczyny utraty zarodków po elektroporacji.

Protokół

Obsługa jaj

1. Jaja można przechowywać w temperaturze 13°C do jednego tygodnia przed inkubacją bez znaczącej utraty żywotności (w tym celu idealna jest mała chłodziarka do wina).
2. Przed inkubacją należy pozwolić jajom ogrzać się do temperatury pokojowej, a następnie umieścić je w nawilżanym inkubatorze do jaj kurzych ustawionym na 37.8°C (100°F).
3. Elektroporację embrionów przeprowadzamy zazwyczaj około 48 godzin od rozpoczęcia inkubacji, gdy embrion osiągnie 10. stadium według skali Hamburgera i Hamiltona.
4. Czas inkubacji może się różnić w zależności od pożądanego stadium Hamburgera i Hamiltona. Temperatura ma krytyczne znaczenie, a odchylenie od optymalnej temperatury inkubacji zmieni czas inkubacji i zmniejszy żywotność embrionów.
5. Podczas inkubacji jaja powinny być ułożone na boku, aby embrion był odpowiednio ustawiony do elektroporacji. Embrion unosi się na powierzchni żółtka; przed wykonaniem okienka pomocne jest zaznaczenie górnej części jaja ołówkiem, aby wiedzieć, gdzie należy wykonać nacięcie.

Przygotowanie

1. Podgrzać pożywkę Leibovitz L-15 do 37°C. Wyciągnąć szklane kapilary w formie igieł. Ustawić elektrody oraz mikromanipulator i podłączyć elektrody do generatora impulsów.

Okienkowanie

1. Za pomocą strzykawki z igłą o dużym przekroju przebij skorupkę na wąskim końcu jaja.
2. Kierując igłę ostrożnie w dół, aby nie uszkodzić żółtka, odessać około 5ml albuminy.
3. Zamknąć otwór małym kawałkiem taśmy.
4. Przykryć górną część jaja innym kawałkiem taśmy (około 4x4 cm).
5. Za pomocą zakrzywionych nożyczek, dbając o to, by nie uszkodzić zarodka, wyciąć otwór wystarczająco duży, aby stworzyć okno robocze.

Opcjonalnie: Aby zwizualizować rurkę neuralną, należy wstrzyknąć roztwór atramentu za pomocą igły 26G pod embrion (wprowadzić igłę pod embrion z zewnątrz pierścienia krwi). Atrament indyjski powinien być rozcieńczony w stosunku 1:5 w roztworze Hanksa lub porównywalnym sterylnym roztworze buforowym.

Iniekcja i elektroporacja

1. Za pomocą pęsety odłam końcówkę kapilary do pożądanej średnicy.
2. Używając pipety ustnej, napełnij kapilarę plazmidem z barwnikiem Fast Green.
3. Ustaw embrion głową w swoją stronę i wprowadź igłę do rurki neuralnej pod niewielkim kątem.
4. Wstrzyknij roztwór plazmidu do światła rurki neuralnej, aż barwnik wypełni całą przestrzeń.

Uwaga: Należy uważać, aby końcówka nie była szersza niż średnica rurki neuralnej. Zazwyczaj o osiągnięciu optymalnej wielkości końcówki można sądzić po tym, jak łatwo lub trudno jest zassać ciecz do kapilary. W przypadku wystąpienia dużego oporu otwór jest prawdopodobnie zbyt mały i końcówka powinna zostać ponownie odłamana wyżej. Jeśli opór jest niewielki lub nie występuje, otwór jest zbyt duży i należy użyć nowej igły.

1. Nanieś jedną do dwóch kropli sterylnego medium L-15 na embrion.
2. Natychmiast umieść elektrody po obu stronach embrionu, równolegle do cewy nerwowej, i podaj 5 impulsów o napięciu 10-24 V przez 50 ms w odstępach 1 s. Jeśli procedura przebiegła prawidłowo, w pobliżu elektrod pojawią się pęcherzyki powietrza.
3. Ostrożnie usuń elektrody, nanieś 5 kropli medium L-15 na embriony i zabezpiecz jajo taśmą. Upewnij się, że jajo jest szczelnie zamknięte, ponieważ wysychanie jest główną przyczyną utraty embrionów po elektroporacji.
4. Umieść jaja z powrotem w inkubatorze, stroną z okienkiem do góry, i inkubuj do momentu osiągnięcia pożądanego stadium H&H.

Dyskusja

Niniejszy protokół stanowi szczegółowy przewodnik krok po kroku po elektroporacji cewy nerwowej zarodków kurzych w stadium HH10. Oprócz prezentacji techniki, przedstawiono również wytyczne dotyczące przechowywania i obchodzenia się z jajami. Technika ta znajduje szerokie zastosowanie w analizach genetycznych, a łatwość i niski koszt przeprowadzania eksperymentów czynią ją dostępną dla wielu laboratoriów.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Inkubator do jaj kurzych			nawilżany, ustawiony na 37.80°C (100F).
Generator impulsów	Genetronics	BTX T820	Generator fali prostokątnej lub porównywalny
Elektrody			użyte elektrody wykonano z drutu platynowego o średnicy 0.25 mm; miały one długość 5 mm i były rozmieszczone w odstępach 1 mm
Kable połączeniowe
Mikromanipulator
Stereomikroskop sekcyjny			z dużą odległością roboczą
Kapilary szklane			oraz wyciągacz kapilar lub komercyjne igły szklane
Pożywka Leibovitz’s L-15
Jaja kurze			zapłodnione
Nożyczki zakrzywione
Strzykawka 10 ml
Igła o dużym przekroju			16-18G
Pipeta ustna
Tusz indyjski
Strzykawka insulinowa/strzykawka
Plazmidowe DNA			≥ 1μg/μl w sterylnym buforze TE lub 1X PBS zawierającym 0.05% barwnika Fast Green