Ocena replikacji i funkcji komórek beta w izolowanych wysepkach gryzoni transdukowanych przez adenowirusa

Summary

Ten protokół pozwala zidentyfikować czynniki, które modulują funkcjonalną masę komórek beta, aby znaleźć potencjalne cele terapeutyczne w leczeniu cukrzycy. Protokół składa się z uproszczonej metody oceny replikacji wysp trzustkowych i funkcji komórek beta w izolowanych wyspach trzustkowych szczurów po manipulacji ekspresją genów za pomocą adenowirusów.

Abstract

Homeostaza glukozy jest przede wszystkim kontrolowana przez hormony endokrynne insulinę i glukagon, wydzielane odpowiednio przez komórki beta i alfa trzustki. Funkcjonalna masa komórek beta zależy od anatomicznej masy komórek beta, a także zdolności komórek beta do reagowania na obciążenie składnikami odżywczymi. Utrata funkcjonalnej masy komórek beta ma kluczowe znaczenie dla obu głównych postaci cukrzycy ^1-3. Podczas gdy spadek funkcjonalnej masy komórek beta wynika z ataku autoimmunologicznego w cukrzycy typu 1, w cukrzycy typu 2 spadek ten rozwija się zarówno z powodu niezdolności komórek beta do odpowiedniego wydzielania insuliny, jak i zniszczenia komórek beta z szeregu mechanizmów. W związku z tym wysiłki na rzecz przywrócenia funkcjonalnej masy komórek beta mają zasadnicze znaczenie dla lepszego leczenia i potencjalnych leków na cukrzycę.

Trwają starania o zidentyfikowanie szlaków molekularnych, które można wykorzystać do stymulowania replikacji i wzmacniania funkcji komórek beta. Idealnie byłoby, gdyby cele terapeutyczne poprawiły zarówno wzrost, jak i funkcję komórek beta. Być może ważniejsze jest jednak określenie, czy strategia, która stymuluje wzrost komórek beta, odbywa się kosztem upośledzenia funkcji komórek beta (takich jak w przypadku niektórych onkogenów) i odwrotnie.

Poprzez systematyczne tłumienie lub nadekspresję docelowych genów w izolowanych wysepkach szczurów, można zidentyfikować potencjalne cele terapeutyczne dla zwiększenia funkcjonalnej masy komórek beta ^4-6. Wektory adenowirusowe mogą być stosowane do efektywnej nadekspresji lub knockdown białek w izolowanych wysepkach szczurów ^4,7-15. W tym miejscu przedstawiamy metodę manipulowania ekspresją genów z wykorzystaniem transdukcji adenowirusowej oraz oceny replikacji wysp trzustkowych i funkcji komórek beta w izolowanych wyspach trzustkowych szczurów (ryc. 1). Metoda ta była wcześniej stosowana do identyfikacji nowych celów, które modulują replikację komórek beta lub funkcję ^{5,6,8,9,16,17}.

Protocol

1. Transdukcja adenowirusowa i hodowla wysepek szczurów

1. Przygotować 6-dołkową płytkę pokrytą kulturą nietkankową, dodając 2 ml pożywki (pożywki RPMI 1640 zawierające 8 mM glukozy, 10% płodowej surowicy bydlęcej, 50 jednostek/ml penicyliny i 50 μg/ml streptomycyny) do wymaganej liczby studzienek. Na przykład typowy eksperyment może wymagać trzech studzienek – po jednej dla kontroli bez wirusa, kontroli wirusa (np. adenowirusa wykazującego ekspresję GFP) i grupy eksperymentalnej.
2. Podgrzać płytkę do temperatury 37 °C, umieszczając ją w inkubatorze do hodowli tkankowych na co najmniej 30 minut.
3. Bezpośrednio po wyizolowaniu wysepek ....

Discussion

Ustanowienie szlaków, które mogą być modulowane w celu stymulowania replikacji i poprawy funkcji komórek beta, jest istotne dla obu głównych postaci cukrzycy. Ponieważ funkcjonalna masa komórek beta zależy od istnienia i funkcji komórek wydzielających insulinę, jednoczesna ocena tych determinantów ma swoje zalety. Protokół ten opisuje uproszczony protokół określania, czy nadekspresja lub supresja białka prowadzi do zmian w funkcjonalnej masie komórek beta in vitro, które można następnie przetestować pod kątem sk.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
RPMI 1640 media	Gibco	11879
Penicylina/streptomycyna	Gibco	15140
6-dołkowa płytka	BD-Falcon	35-1146	Bez TC traktowana
metylo-3H]-tymidyna	Perkin Elmer	NET027Z001MC	1 mCi/ml
Probówki do mikrowirówek	Denville	C2170	1,7 ml
NaCl	Sigma	59888
KCl	Acros	42409
KH2PO4	Acros	20592
MgSO4	Acros	41348
CaCl2	Acros	34961
HEPES	Sigma	H0887	1 M solution
35% BSA		Sigma A7979
NaHCO3	Acros	42427
d-glucose	Sigma	G8769
TCA	Fisher Scientific	SA9410-1	10% w/v
NaOH	Acros	12426
Probówka do zliczania scyntylacji	Sarstedt	58.536	7 ml, PP
Nasadka probówki do liczenia scyntylacyjnego	Sarstedt	65.816
Econo-Safe koktajl liczący	RPI	111175
Insulina RIA	Zestaw testowy BCA Siemens	TKIN2
	Thermo Scientific	23250
Equipment
Wirówka	Eppendorf	5415R
Stojak na probówki do liczenia scyntylacji	Sarstedt	93.1431.001
Licznik scyntylacyjny cieczy	Perkin Elmer	Tri-Carb 2910TR