Ocena replikacji i funkcji komórek beta w izolowanych wysepkach gryzoni poddanych transdukcji adenowirusowej

Podsumowanie

Niniejszy protokół umożliwia identyfikację czynników modulujących funkcjonalną masę komórek beta w celu znalezienia potencjalnych celów terapeutycznych w leczeniu cukrzycy. Protokół składa się z usprawnionej metody oceny replikacji wysepek oraz funkcji komórek beta w izolowanych wysepkach szczura po manipulacji ekspresją genów za pomocą adenowirusów.

Streszczenie

Homeostaza glukozy jest kontrolowana przede wszystkim przez hormony endokrynne – insulinę i glukagon, wydzielane odpowiednio przez komórki beta i alfa trzustki. Funkcjonalna masa komórek beta jest określana przez anatomiczną masę komórek beta, a także zdolność komórek beta do odpowiedzi na obciążenie składnikami odżywczymi. Utrata funkcjonalnej masy komórek beta ma kluczowe znaczenie dla obu głównych postaci cukrzycy ^1-3. Podczas gdy spadek funkcjonalnej masy komórek beta jest wynikiem ataku autoimmunologicznego w cukrzycy typu 1, w cukrzycy typu 2 ubytek ten rozwija się zarówno w wyniku niezdolności komórek beta do prawidłowego wydzielania insuliny, jak i niszczenia komórek beta przez szereg mechanizmów. Zatem wysiłki zmierzające do przywrócenia funkcjonalnej masy komórek beta są najważniejsze dla lepszego leczenia i potencjalnego wyleczenia cukrzycy.

Podejmowane są wysiłki w celu zidentyfikowania szlaków molekularnych, które można wykorzystać do stymulacji replikacji i poprawy funkcji komórek beta. W idealnym przypadku cele terapeutyczne powinny poprawiać zarówno wzrost, jak i funkcję komórek beta. Być może ważniejsze jest jednak ustalenie, czy strategia stymulująca wzrost komórek beta odbywa się kosztem upośledzenia ich funkcji (jak ma to miejsce w przypadku niektórych onkogenów) i odwrotnie.

Poprzez systematyczne wyciszanie lub nadekspresję genów docelowych w izolowanych wysepkach szczura można zidentyfikować potencjalne cele terapeutyczne w celu zwiększenia funkcjonalnej masy komórek beta ^4-6. Wektory adenowirusowe mogą być wykorzystywane do wydajnej nadekspresji lub knockdownu białek w izolowanych wysepkach szczura ^4,7-15. W niniejszej pracy przedstawiamy metodę manipulacji ekspresją genów z wykorzystaniem transdukcji adenowirusowej oraz ocenę replikacji wysepek i funkcji komórek beta w izolowanych wysepkach szczura (Rycina 1). Metoda ta była wcześniej stosowana do identyfikacji nowych celów modulujących replikację lub funkcję komórek beta ^{5,6,8,9,16,17}.

Protokół

1. Transdukcja adenowirusowa i hodowla wysepek szczura

1. Przygotuj płytkę 6-dołkową bez powłoki do hodowli tkanek, dodając 2 ml pożywki (pożywka RPMI 1640 zawierająca 8 mM glukozy, 10% płodowej surowicy bydlęcej, 50 jednostek/ml penicyliny oraz 50 μg/ml streptomycyny) do odpowiedniej liczby dołków. Na przykład typowy eksperyment może wymagać trzech dołków – po jednym dla kontroli bez wirusa, kontroli z wirusem (np. adenowirusem wykazującym ekspresję GFP) oraz grupy eksperymentalnej.
2. Ogrzej płytkę do 37 °C, umieszczając ją w inkubatorze do hodowli tkanek na co najmniej 30 min.
3. Bezpośrednio po izolacji wysepek trzustkowych szczura ^18,19, umieść 100-200 wysepek w poszczególnych dołkach płytki 6-dołkowej bez powłoki do hodowli tkanek. Sześćdziesiąt wysepek jest wymaganych do analiz wydzielania insuliny i wbudowywania tymidyny. Pozostałe wysepki można wykorzystać do izolacji RNA na potrzeby badań ekspresji genów lub izolacji białek do immunoblottingu.

[Uwaga: Od tego momentu prosimy o stosowanie się do protokołów instytucjonalnych dotyczących obchodzenia się z materiałami biologicznymi stwarzającymi zagrożenie, ich użytkowania oraz utylizacji.]

4. Delikatnie zakręć płytką, aby skupić wyspy w centrum dołka.
5. Nanieś adenowirusa pipetą bezpośrednio na wyspy znajdujące się w centrum naczynia. Zastosuj 100-500 wielokrotności infekcji (MOI, stosunek komórek docelowych do wirusowych jednostek tworzących plaques).
6. Pozostaw wyspy na 5 min.
7. Umieść płytkę w inkubatorze do hodowli tkanek (37 °C, 5% CO₂).
8. Po 24 h delikatnie zakręć płytką, aby skupić wyspy w centrach dołków, a następnie przenieś wyspy za pomocą mikropipety P200 do nowego dołka zawierającego świeże medium. Jeśli wyspy przywrą do płytki, można je delikatnie odczepić końcówką pipety.

[Uwaga: Aby zweryfikować odpowiednią wydajność transdukcji, korzystne jest zastosowanie wirusa kontrolnego wykazującego ekspresję GFP, co pozwala na obrazowanie wysepek za pomocą mikroskopii konfokalnej w celu potwierdzenia penetracji adenowirusa do rdzenia wysepki.]

9. Kultywować wyspy przez dodatkowe 24-72 h, w zależności od pożądanego czasu trwania eksperymentu ustalonego w pilotażowych badaniach optymalizacyjnych. Na przykład indukowanie odpowiedzi proliferacyjnej może wymagać czasu od 24-72 h, a wyciszenie interesującego genu może wymagać 48 lub 72 godzin. Codziennie przenosić wyspy do świeżej pożywki.
10. W ciągu ostatnich 24 h eksperymentu kultywować wyspy w pożywce zawierającej 1 μCi [methyl-³H]-tymidyny/ml pożywki (zazwyczaj 1 μl tymidyny/ml pożywki).

[Uwaga: Od tego momentu prosimy o stosowanie protokołów instytucjonalnych dotyczących obchodzenia, użytkowania i utylizacji materiałów promieniotwórczych.]

2. Analiza wydzielania insuliny

1. Przygotować 10X roztwór stokowy buforu do analizy sekrecji (SAB) (1,14 M NaCl, 47 mM KCl, 12 mM KH₂PO₄, 11,6 mM MgSO₄) oraz 100X roztwór stokowy CaCl₂ (0,25 M CaCl₂). Roztwory stokowe te można przygotować wcześniej i przechowywać w temperaturze pokojowej.
2. Przygotować na świeżo 50 ml roboczego buforu SAB (5 mL 10X SAB, 1 ml 1 M HEPES, 0,5 ml 100X CaCl₂, 0,28 ml 35% BSA, 0,11 g NaHCO₃ oraz sterylna woda do objętości 50 ml) w probówce stożkowej 50-ml i ogrzać do 37 °C, umieszczając ją w kąpieli wodnej o temperaturze 37 °C.
3. Do probówki stożkowej 15-ml odpipetować 10 ml roboczego buforu SAB i dodać 66,8 μl 2,5 M D-glukozy, aby przygotować SAB z wysokim stężeniem glukozy (16,7 mM).
4. Do pozostałych 40 ml roboczego buforu SAB dodać 44,8 μl 2,5 M D-glukozy, aby przygotować SAB z niskim stężeniem glukozy (2,8 mM).
5. Oznakować trzy probówki do mikrowirówki 1,7-ml dla każdej studni płytki 6-dołkowej i dodać 1 ml soli fizjologicznej w buforze fosforanowym (PBS).

[Uwaga: Ponieważ wysepki są radioaktywne, należy przestrzegać instytucjonalnych protokołów dotyczących obchodzenia się z materiałami radioaktywnymi, ich wykorzystania oraz utylizacji.]

6. Do każdej probówki do mikrocentryfugi przenieś 20 wysepek. Należy dołożyć wszelkich starań, aby do każdej probówki trafiły wysepki o porównywalnych rozmiarach. Przykładowo, każda probówka może zawierać 5 małych, 10 średnich i 5 dużych wysepek (patrz: Rysunek 1).

[Uwaga: Wyspy można wizualizować, używając stereomikroskopu sekcyjnego lub standardowego mikroskopu.]

7. Po opadnięciu wysepek na dno probówki pod wpływem grawitacji (~2 min), odessać PBS za pomocą mikropipety i usunąć.

[Uwaga: Alternatywnie do sedymentacji grawitacyjnej, probówki można wirować przy 300 x g przez 1 min.]

8. W celu preinkubacji dodać 400 μl SAB z niską zawartością glukozy, umieścić probówki (z otwartymi nakrętkami) w inkubatorze do hodowli tkankowych (37 °C, 5% CO₂) i preinkubować przez 60 min. Odessać SAB z niską zawartością glukozy z preinkubacji i usunąć.
9. W celu oznaczenia podstawowego wydzielania insuliny dodać 400 μl SAB z niską zawartością glukozy, umieścić probówki (z otwartymi nakrętkami) w inkubatorze do hodowli tkankowych (37 °C, 5% CO₂) i inkubować przez 60 min. Zebrać SAB z niską zawartością glukozy i zachować do radiometrycznego testu immunologicznego insuliny.
10. W celu oznaczenia stymulowanego wydzielania insuliny dodać 400 μl SAB z wysoką zawartością glukozy, umieścić probówki (z otwartymi nakrętkami) w inkubatorze do hodowli tkankowych (37 °C, 5% CO₂) i inkubować przez 60 min. Zebrać SAB z wysoką zawartością glukozy i zachować do radiometrycznego testu immunologicznego insuliny.

3. Test wbudowywania tymidyny

1. Dodać 1 ml PBS; po opadnięciu wysp na dno probówki pod wpływem grawitacji, odessać PBS za pomocą mikropipety, usunąć i powtórzyć ten krok raz.
2. Dodać 500 μl schłodzonego do temperatury lodu kwasu trójchlorooctowego (TCA, 10% w/v) i inkubować na lodzie przez 30 min.
3. Wirzyć probówki przy 16 000 x g przez 3 min w temperaturze 4 °C.
4. Odessać TCA, dodać 80 μl 0,3 N NaOH i inkubować przez 30 min w temperaturze pokojowej. W tym czasie co 10 min intensywnie mieszać próbki na vortexie przez 5-10 s.
5. Dodać 4 ml koktajlu do zliczania Econo-safe do probówek do c ciekłego scyntylograficznego o pojemności 7 ml.
6. Przenieść 50 μl próbki do probówki scyntylacyjnej, zakręcić probówkę, krótko wstrząsnąć i zmierzyć w ciekłym liczniku scyntylacyjnym.
7. Zmierzyć stężenie białka za pomocą testu kwasu bicinchoninowego (BCA), wykorzystując 10 μl próbki zgodnie z protokołem producenta.

4. Analiza danych

1. Przeprowadź radiometryczny test immunoologiczny (RIA) insuliny zgodnie z protokołem producenta.
2. Znormalizuj dane dotyczące wydzielania insuliny oraz wbudowywania tymidyny względem stężenia białka.

5. Reprezentatywne wyniki

Przykład eksperymentu służącego do oceny replikacji wysepek oraz funkcji komórek beta w wysepkach szczura przedstawiono na Rysunku 2. Ten przykład pokazuje, że adenowiralna nadekspresja hipotetycznego „Genu #6” silnie stymuluje replikację wysepek, nie zmieniając przy tym funkcji komórek beta. W górnym panelu wyniki testu wbudowywania tymydyny wykazują, że zwiększenie ekspresji „Genu #6” prowadzi do wzrostu syntezy DNA, mierzonego poprzez wbudowywanie tymydyny. Ponieważ większość komórek w wysepce szczura to komórki beta, prawdopodobne jest, że ten wzrost wbudowywania tymydyny wskazuje na zwiększoną replikację komórek beta. Należy jednak przeprowadzić eksperymenty potwierdzające, aby jednoznacznie to ustalić. W dolnym panelu wyniki testu wydzielania insuliny wykazują, że nadekspresja „Genu #6” nie zmieniła jednej z głównych funkcji komórek beta, tzn. wydzielania insuliny przy niskim i wysokim stężeniu glukozy. Jakość izolacji oraz stan zdrowia wysepek po traktowaniu adenowirusami są wskazane przez krotność wzrostu wydzielania insuliny przy niskich i wysokich stężeniach glukozy. Gdyby zwiększenie ekspresji „Genu #6” upośledzało funkcję komórek beta, prawdopodobnie objawiłoby się to spadkiem ilości wydzielanej insuliny przy wysokich, stymulujących stężeniach glukozy (16,7 mM). Można również wyznaczyć krzywą odpowiedź-dawka dla różnych stężeń glukozy.

Rysunek 1. Przegląd protokołu oceny replikacji wysepek i funkcji komórek beta w izolowanych wysepkach szczura po zmianach w ekspresji genów indukowanych przez adenowirusy. Świeżo izolowane wysepki szczura są poddawane działaniu adenowirusów przez 24 h, a następnie hodowane do 96 h. Wbudowywanie tymidyny jest oceniane w ciągu ostatnich 24 h, po czym następuje pomiar sekrecji insuliny przy niskim i wysokim stężeniu glukozy.

Rysunek 2. Wyniki eksperymentu z użyciem kontrolnego adenowirusa oraz adenowirusa nadekspresującego hipotetyczny gen oznaczony jako „Gene #6”. Górny panel przedstawia wbudowywanie tymidyny, a dolny panel wydzielanie insuliny.

Dyskusja

Ustalenie szlaków, które można modulować w celu stymulacji replikacji i poprawy funkcji komórek beta, ma istotne znaczenie dla obu głównych postaci cukrzycy. Ponieważ funkcjonalna masa komórek beta zależy od obecności i funkcji komórek wydzielających insulinę, jednoczesna ocena tych czynników determnujących niesie ze sobą pewne korzyści. Niniejszy protokół opisuje uproszczoną procedurę identyfikacji tego, czy nadekspresja lub supresja białka prowadzi do zmian w funkcjonalnej masie komórek beta in vitro, co nastę...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Pożywka RPMI 1640	Gibco	11879
Penicylina/streptomycyna	Gibco	15140
Płytka 6-dołkowa	BD-Falcon	35-1146	Nietraktowana TC
[metyl-3H]-tymidyna	Perkin Elmer	NET027Z001MC	1 mCi/ml
Probówki do mikrocentryfugi	Denville	C2170	1.7 ml
NaCl	Sigma	59888
KCl	Acros	42409
KH2PO4	Acros	20592
MgSO4	Acros	41348
CaCl2	Acros	34961
HEPES	Sigma	H0887	roztwór 1 M
35% BSA	Sigma	A7979
NaHCO3	Acros	42427
d-glukoza	Sigma	G8769
TCA	Fisher Scientific	SA9410-1	10% w/v
NaOH	Acros	12426
Probówka do liczenia scyntylacyjnego	Sarstedt	58.536	7 ml, PP
Nakrętka do probówki do liczenia scyntylacyjnego	Sarstedt	65.816
Koktajl do liczenia Econo-Safe	RPI	111175
RIA insuliny	Siemens	TKIN2
Zestaw do analizy BCA	Thermo Scientific	23250
Sprzęt
Wirówka	Eppendorf	5415R
Statyw na probówki do liczenia scyntylacyjnego	Sarstedt	93.1431.001
Licznik scyntylacyjny do cieczy	Perkin Elmer	Tri-Carb 2910TR