Izolacja limfocytów przy użyciu zestawu Miltenyi MACs jest niezawodną metodą oczyszczania komórek z homogenatów całych tkanek limfatycznych. Komórki oczyszczone za pomocą systemu Miltenyi charakteryzują się zazwyczaj czystością ≥ 96%. W niniejszym materiale przedstawiamy kroki niezbędne do izolacji komórek T CD4+, wykorzystując jeden z wielu zestawów oferowanych przez firmę Miltenyi.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Izolacja limfocytów T CD4+ z węzłów chłonnych myszy z wykorzystaniem oczyszczania metodą Miltenyi MACS
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Izolacja komórek z pierwotnego źródła jest niezbędnym krokiem w wielu bardziej złożonych protokołach. Firma Miltenyi oferuje zestawy do izolacji komórek z kilku organizmów, w tym ludzi, naczelnych niebędących ludźmi, szczurów oraz, jak opisujemy tutaj, myszy. Separacja komórek oparta na kuleczkach magnetycznych pozwala na selekcję pozytywną (lub usunięcie konkretnych komórek), a także na selekcję negatywną. W niniejszym materiale demonstrujemy selekcję negatywną nienaruszonych lub naiwnych limfocytów T pomocniczych CD4+. Stosując ten standardowy protokół, zazwyczaj oczyszczamy komórki o czystości ≥ 96% dla frakcji CD4+/CD3+. Protokół ten jest stosowany w połączeniu z protokołem Dissection and 2-Photon Imaging of Peripheral Lymph Nodes in Mice opublikowanym w 7. wydaniu JoVE, w celu oczyszczania limfocytów T oraz innych typów komórek do transferu adopcyjnego na potrzeby obrazowania. Choć w tym filmie nie zaprezentowano analizy FACS, zdecydowanie zaleca się sprawdzenie ogólnej czystości wyizolowanych komórek przy użyciu odpowiednich przeciwciał za pomocą FACS. Ponadto demonstrujemy niejałową metodę izolacji limfocytów T. Jeśli do konkretnej aplikacji końcowej wymagane są komórki sterylne, należy przeprowadzić wszystkie zaprezentowane procedury w komorze do hodowli tkanek w standardowych warunkach sterylnych. Dziękujemy za oglądanie i życzymy powodzenia w Państwa własnych eksperymentach!
Protokół
Prosimy o zapoznanie się z protokołem dołączonym do zestawu Miltenyi lub dostępnym online pod adresem http://www.miltenyibiotec.com/ i stosowanie się do niego.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Izolacja komórek ze źródła pierwotnego jest niezbędnym etapem w wielu bardziej złożonych protokołach. Firma Miltenyi oferuje zestawy do izolacji komórek z kilku organizmów, w tym z ludzi, naczelnych niebędących ludźmi, szczurów oraz, jak opisano tutaj, myszy. Separacja komórek oparta na kuleczkach magnetycznych umożliwia zarówno selekcję pozytywną (lub usuwanie komórek), jak i selekcję negatywną. W niniejszym opracowaniu prezentujemy selekcję negatywną nienaruszonych lub naiwnych limfocytów T pomocniczych CD4+. Stosując ...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy nie zgłaszają żadnych konfliktów interesów.
Podziękowania
Pragniemy podziękować Rebeccie Paquett za przygotowanie buforu MACS.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze | |
|---|---|---|---|---|
| Bufor MACS | Odczynnik | None | None | Przygotować zgodnie z instrukcją firmy Miltenyi. |
| Zestaw do izolacji limfocytów T CD4+: Untouched Isolation | Odczynnik | Miltenyi Biotec | 130-090-860 | Do użycia z systemem Miltenyi. |
| Sterylna sól fizjologiczna z buforem fosforanowym (PBS) | Odczynnik | Do przygotowania buforu MACS. | ||
| Corning 35 mm nienatłuszczana szalka hodowlana (Not TC-Treated) | Inne | Corning | 430588 | Używana do przygotowania zawiesiny pojedynczych komórek. |
| Sito komórkowe 70 µm | Narzędzie | BD Biosciences | 352350 | Używane do przygotowania zawiesiny pojedynczych komórek. |
| Strzykawka 6 mL | Narzędzie | Tyco Healthcare, Covidien | 8881516051 | Używana do przygotowania zawiesiny pojedynczych komórek. |
| 10x Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (DPBS) | Odczynnik | Invitrogen | 14200-075 | Do lizy RBC. |
| Woda sterylna | Odczynnik | Sigma-Aldrich | W4502 | Do lizy RBC. |
Bibliografia
- Miller, M. J., Hejazi, A. S., Wei, S. H., Cahalan, M. D., Parker, I. T cell repertoire scanning is promoted by dynamic dendritic cell behavior and random T cell motility in the lymph node. Proc Natl Acad Sci U S A. 101, 998-1003 (2004).
- Matheu, M. P., Deane, J. A., Parker, I., Fruman, D. A., Cahalan, M. D. Class IA phosphoinositide 3-kinase modulates basal lymphocyte motility in the lymph node. J Immunol. 179, 2261-2269 (2007).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
