Artykuł metodologiczny

Izolacja limfocytów T CD4+ z węzłów chłonnych myszy z wykorzystaniem oczyszczania metodą Miltenyi MACS

DOI:

10.3791/409

⸱

1 listopada 2007

 , 
1Department of Physiology and Biophysics, University of California, Irvine (UCI)

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Izolacja limfocytów przy użyciu zestawu Miltenyi MACs jest niezawodną metodą oczyszczania komórek z homogenatów całych tkanek limfoidalnych. Komórki oczyszczone za pomocą systemu Miltenyi wykazują zazwyczaj czystość ≥ 96%. W niniejszej procedurze prezentujemy etapy izolacji limfocytów T CD4+, wykorzystując jeden z wielu zestawów oferowanych przez firmę Miltenyi.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Izolacja komórek z pierwotnego źródła jest niezbędnym krokiem w wielu bardziej złożonych protokołach. Firma Miltenyi oferuje zestawy do izolacji komórek z kilku organizmów, w tym ludzi, naczelnych innych niż ludzie, szczurów oraz, jak opisano w niniejszym opracowaniu, myszy. Separacja komórek oparta na kuleczkach magnetycznych umożliwia zarówno selekcję pozytywną (lub usuwanie komórek), jak i selekcję negatywną. Tutaj demonstrujemy selekcję negatywną nienaruszonych lub naiwnych komórek T pomocniczych CD4+. Stosując ten standardowy protokół, zazwyczaj oczyszczamy komórki o czystości ≥ 96% CD4+/CD3+. Protokół ten jest stosowany w połączeniu z protokołem Dissection and 2-Photon Imaging of Peripheral Lymph Nodes in Mice opublikowanym w 7. wydaniu JoVE, w celu oczyszczania limfocytów T oraz innych typów komórek do transferu adoptywnego na potrzeby obrazowania. Choć w tym filmie z protokołem nie zaprezentowano analizy FACS, zdecydowanie zaleca się sprawdzenie ogólnej czystości izolowanych komórek przy użyciu odpowiednich przeciwciał metodą FACS. Ponadto demonstrujemy niesterylną metodę izolacji limfocytów T. Jeśli do Państwa konkretnego zastosowania końcowego wymagane są komórki sterylne, należy przeprowadzić wszystkie zademonstrowane procedury w komorze do hodowli tkankowej w standardowych warunkach sterylnych. Dziękujemy za oglądanie i życzymy powodzenia we własnych eksperymentach!

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Prosimy o przeczytanie i stosowanie się do protokołu zawartego w zestawie Miltenyi lub dostępnego online pod adresem http://www.miltenyibiotec.com/.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Izolacja komórek z pierwotnego źródła jest niezbędnym etapem w wielu bardziej złożonych protokołach. Firma Miltenyi oferuje zestawy do izolacji komórek z wielu organizmów, w tym z ludzi, naczelnych niebędących ludźmi, szczurów oraz, jak opisujemy tutaj, myszy. Separacja komórek oparta na kuleczkach magnetycznych umożliwia zarówno selekcję pozytywną (lub usuwanie komórek), jak i selekcję negatywną. W niniejszym materiale demonstrujemy selekcję negatywną w celu uzyskania nienaruszonych lub naiwnych komórek T pomocniczych C...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Pragniemy podziękować Rebecce Paquett za przygotowanie buforu MACS.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Bufor MACSOdczynnikBrakBrakPrzygotować zgodnie z opisem firmy Miltenyi.
Zestaw do izolacji limfocytów T CD4+: Izolacja UntouchedOdczynnikMiltenyi Biotec130-090-860Do użytku z systemem Miltenyi.
Sterylny roztwór soli fizjologicznej w buforze fosforanowym (PBS)OdczynnikDo użytku przy przygotowywaniu buforu MACS.
Szalka hodowlana Corning 35 mm, niepoddawana obróbce TCInneCorning430588Stosowana przy przygotowywaniu zawiesiny pojedynczych komórek.
Sito komórkowe 70 µmNarzędzieBD Biosciences352350Stosowane przy przygotowywaniu zawiesiny pojedynczych komórek.
Strzykawka 6 mLNarzędzieTyco Healthcare, Covidien8881516051Stosowana przy przygotowywaniu zawiesiny pojedynczych komórek.
10x Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (DPBS)OdczynnikInvitrogen14200-075Do użytku przy lizie RBC.
Woda sterylnaOdczynnikSigma-AldrichW4502Do użytku przy lizie RBC.

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Miller, M. J., Hejazi, A. S., Wei, S. H., Cahalan, M. D., Parker, I. T cell repertoire scanning is promoted by dynamic dendritic cell behavior and random T cell motility in the lymph node. Proc Natl Acad Sci U S A. 101, 998-1003 (2004).
  2. Matheu, M. P., Deane, J. A., Parker, I., Fruman, D. A., Cahalan, M. D. Class IA phosphoinositide 3-kinase modulates basal lymphocyte motility in the lymph node. J Immunol. 179, 2261-2269 (2007).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

selekcja negatywnaizolacja kom rekseparacja za pomoc kulek magnetycznychlizy erytrocyt wzawiesina pojedynczych kom rekkolumna LScytometria przep ywowa

Powiązane artykuły