Automatyczna kwantyfikacja fluorescencji synaptycznej u C. elegans

Podsumowanie

Obfitość receptorów neurotransmiterów zgromadzonych w synapsach silnie wpływa na siłę synaptyczną. Metoda ta pozwala na ilościowe określenie liczby znakowanych fluorescencyjnie receptorów neurotransmiterów w trzech wymiarach z rozdzielczością pojedynczej synapsy u C. elegans, co umożliwia szybką charakterystykę setek synaps w obrębie jednej próbki bez zniekształceń wynikających z projekcji płaszczyzny z.

Streszczenie

Siła synaptyczna odnosi się do amplitudy odpowiedzi postsynaptycznych na zdarzenia uwalniania neuroprzekaźnika z terminala presynaptycznego i ma istotny wpływ na ogólną funkcję obwodów neuronalnych. Siła synaptyczna zależy w sposób krytyczny od liczby receptorów neuroprzekaźników zgromadzonych w miejscach synaptycznych na błonie postsynaptycznej. Poziomy receptorów są ustalane w procesie rozwoju i mogą być zmieniane poprzez transport receptorów między pulami zlokalizowanymi na powierzchni, podsynaptycznymi a wewnątrzkomórkowymi, co stanowi istotny mechanizm plastyczności synaptycznej i neuromodulacji. Rygorystyczne metody ilościowego oznaczania liczby receptorów neuroprzekaźników zlokalizowanych w synapsach są niezbędne do badania rozwoju i plastyczności synaptycznej. Mikroskopia fluorescencyjna jest optymalnym podejściem, ponieważ zachowuje informacje przestrzenne, umożliwiając odróżnienie pul synaptycznych od niesynaptycznych oraz rozróżnienie populacji receptorów zlokalizowanych w różnych typach synaps. Genetyczny organizm modelowy Caenorhabditis elegans jest szczególnie odpowiedni do tych badań ze względu na niewielki rozmiar i względną prostotę jego układu nerwowego, jego przezroczystość oraz dostępność potężnych technik genetycznych, które pozwalają na badanie naturalnych synaps w nienaruszonych zwierzętach.

W niniejszej pracy przedstawiamy metodę ilościowego oznaczania fluorescencyjnie znakowanych synaptycznych receptorów neurotransmiterów u C. elegans. Jej kluczową cechą jest zautomatyzowana identyfikacja i analiza pojedynczych synaps w trzech wymiarach w plikach wynikowych z konfokalnego mikroskopu wielopłaszczyznowego, z tabulacją pozycji, objętości, intensywności fluorescencji oraz całkowitej fluorescencji dla każdej synapsy. Podejście to posiada dwie główne zalety w stosunku do ręcznej analizy projekcji płaszczyzn z niżu (z-plane) danych konfokalnych. Po pierwsze, ponieważ uwzględniona jest każda płaszczyzna zestawu danych konfokalnych, żadne dane nie giną w wyniku projekcji z-plane, która zazwyczaj opiera się na średnich lub maksymalnych wartościach intensywności pikseli. Po drugie, identyfikacja synaps jest zautomatyzowana, lecz może być nadzorowana przez eksperymentatora w trakcie analizy danych, co pozwala na szybką i dokładną ekstrakcję danych z dużej liczby synaps. Z jednej próbki można łatwo uzyskać od setek do tysięcy synaps, co pozwala na stworzenie dużych zestawów danych w celu maksymalizacji mocy statystycznej. Omówiono również kwestie przygotowania C. elegans do analizy oraz przeprowadzenia obrazowania konfokalnego w celu zminimalizowania zmienności między zwierzętami w grupach badawczych. Choć metoda ta została opracowana do analizy receptorów postsynaptycznych u C. elegans, jest ona ogólnie użyteczna dla każdego rodzaju białka zlokalizowanego w synapsach, a w rzeczywistości dla każdego sygnału fluorescencji zlokalizowanego w postaci dyskretnych klastrów, punktów lub organelli.

Procedurę wykonuje się w trzech etapach: 1) przygotowanie próbek, 2) obrazowanie konfokalne oraz 3) analiza obrazów. Etapy 1 i 2 są specyficzne dla C. elegans, natomiast etap 3 ma zastosowanie ogólne do każdego punktowego sygnału fluorescencji w mikrografiach konfokalnych.

Protokół

1. Przygotowanie nicieni do obrazowania

Ten fragment protokołu opiera się na opublikowanych technikach hodowli C. elegans^1,2 i został przedstawiony na Rysunku 1.

1. Hodować nicienie na płytkach z agarem NGM z wysoką zawartością peptonu (10 cm) zaszczepionych bakteriami E. coli NA22 do momentu niemal całkowitego wyczerpania pożywki. W przypadku immunobarwienia jedna płytka dostarczy wystarczającą liczbę nicieni do jednego barwienia, biorąc pod uwagę straty w trakcie procesu oraz rygorystyczne kryteria doboru osobników do obrazowania (patrz Część 2).
2. Zebrać nicienie, wlewając kilka ml ddH₂0 na płytkę, krótko mieszając okrężnie, a następnie przelewając ciecz do stożkowej probówki 15 ml (powtórzyć w razie potrzeby, aby przenieść większość nicieni do probówki). Wirować w wirówce klinicznej przez 3 min przy 1000x g. Przemyć osad 1–3 razy ddH₂O, aż nadsącz stanie się przejrzysty, aby usunąć pozostałości bakterii. Do usuwania nadsączów należy używać polipropylenowych pipet transferowych, ponieważ nicienie przylegają do szkła (od tego momentu kluczowe jest zminimalizowanie czasu między kolejnymi etapami, aby uniknąć utraty żywotności jaj).
3. Po ostatnim przemyciu zawiesić osad z nicieni w 5 ml alkalicznego roztworu podchlorynu w celu lizy nicieni i uwolnienia jaj. Delikatnie kołysać probówką i badać ją pod mikroskopem stereoskopowym około raz na minutę. Gdy około 50% nicieni zostanie poddanych lizie (będą wyglądać na wygięte i rozprute), przerwać proces lizy, wypełniając probówkę do pełna buforem do jaj (Egg Buffer), kilkukrotnie odwracając probówkę i wirować przez 3 min przy 1000x g. Czas lizy nie może przekroczyć 5 min.
4. Usunąć nadsącz pipetą transferową i przemyć osad 3x buforem do jaj.
5. Aby oddzielić jaja od zanieczyszczeń, należy je wypłynąć na poduszce z 30% sacharozy w ddH₂O: po końcowym przemyciu z etapu 1.4 ostrożnie usunąć nadsącz i zawiesić osad w 5 ml ddH₂0. Dodać 5 ml sterylnej 60% sacharozy w ddH₂O i dokładnie wymieszać. Wirować w wirówce klinicznej przez 6 min przy 1000x g. Jaja zbiorą się na menisku (będą miały mętny wygląd), natomiast zanieczyszczenia opadną na dno.
6. Za pomocą plastikowej pipety transferowej pobrać jaja w minimalnej objętości i przenieść je na niezaszczepione płytki z agarem NGM. Wszelkie jaja przylegające do ścianek probówki można delikatnie spłukać i również przenieść. Wystarczy jedna niezaszczepiona płytka 10 cm na analizowany szczep.
7. Inkubować niezaszczepione płytki z jajami przez noc (~16 h) w temperaturze 20 °C. Przez pierwsze kilka godzin wietrzyć płytkę, aby ją osuszyć, pozostawiając pokrywkę lekko uchyloną, ale należy pamiętać o jej pełnym zamknięciu na noc.
8. Po wykluciu przenieść larwy L1 do stożkowej probówki 15 ml z pożywką S Basal (dodać kilka ml S Basal na płytkę, wymieszać okrężnie i przelać do probówki). Wirować w wirówce klinicznej (3 min, 1000x g), zawiesić w minimalnej objętości S Basal i przenieść na płytki z agarem NGM (10 cm) zaszczepione bakteriami NA22. Na tym etapie należy użyć 2 płytek dla każdej oryginalnej płytki z etapu 1.1. Inkubować, aż nicienie osiągną pożądany wiek.
9. Monitorować hodowle raz lub dwa razy dziennie. Jeśli istnieje ryzyko zagłodzenia, przenieść je na świeże płytki z NA22. W przypadku nicieni typu dzikiego N2 zagłodzeniu towarzyszy formowanie się linii lub fali nicieni poruszającej się przez płytkę, gdy zwierzęta masowo migrują z obszarów wyczerpanych z pożywki. Po uformowaniu się tej struktury pożywka zostanie całkowicie wyczerpana w ciągu kilku godzin.
10. Nicienie są teraz gotowe do immunobarwienia lub obrazowania na żywo. Optymalne jest utrwalanie i barwienie nicieni w zawiesinie, ponieważ pozwala to na łatwe obrazowanie dużej liczby nienaruszonych osobników. Procedury barwienia oparte na protokole Finneya i Ruvkuna^3-6 są preferowane nad procedurami mrożenia i rozłupywania (freeze-crack), ponieważ do obrazowania wymagana jest duża liczba nicieni.

2. Obrazowanie konfokalne

1. Przygotuj preparaty z nicieniami na szkiełkach do obrazowania konfokalnego. Dostosuj gęstość nicieni do poziomu kilku stu osobników na mikrolitr. Przygotuj podkład z 2% agarozy w pożywce S-basal, otoczony cienkim pierścieniem wazeliny, aby zapobiec odparowywaniu podczas obrazowania (nałożone za pomocą strzykawki 3 ml z odciętą igłą 25G). Pipetą nanieś kilka mikrolitrów zawiesiny nicieni na szkiełko nakrywkowe (w przypadku obrazowania żywych nicieni zastosuj środek znieczulający), a następnie opuść podkład agarowy na szkiełko, rozkładając nicienie równomiernie po jego powierzchni.
2. Wybierz nicienie do obrazowania. Wybierz osobniki, w których badane synapsy są skierowane w stronę obiektywu, z przesunięciem radialnym nie większym niż ±45° (gdzie 0° oznacza orientację bezpośrednio w stronę obiektywu). Przeprowadź tę ocenę szybko (w ciągu kilku sekund), aby uniknąć fotoblaknięcia. Skala kultur początkowych została zoptymalizowana tak, aby zapewnić wystarczającą liczbę nicieni spełniających te kryteria geometryczne.
3. Wykonaj obrazowanie konfokalne preparatu. Najlepsze wyniki dają próbki stosunkowo płaskie, które można objąć około 14 sekcjami o grubości 0.4 μm. Do szybkiego i dokładnego zbierania danych wystarczające są obrazy o wysokiej prędkości i niskiej rozdzielczości (512 x 512 pikseli). Unikaj nasycania detektora nadmierną siłą sygnału, ponieważ spowoduje to niedoszacowanie sygnałów fluorescencji.

3. Zautomatyzowana identyfikacja i analiza pojedynczych klastrów synaptycznych

1. Otwórz pliki wyjściowe w formacie multi-TIF z mikroskopu konfokalnego, korzystając z oprogramowania Volocity 4.0 (lub nowszego) (PerkinElmer).
2. Wytnij obszary obrazu, które nie zawierają analizowanej struktury (Obraz -> Extended Focus -> Wybierz obszar zainteresowania za pomocą narzędzia „Freehand ROI” -> Actions -> Crop to Selection; Rysunek 2A). Należy pamiętać, że funkcja Extended Focus tworzy projekcję płaszczyzny z na ekranie komputera, aby ułatwić analizę, ale nie wpływa na dane źródłowe; to samo dotyczy ewentualnych korekt jasności i kontrastu).
3. Zmierz długość analizowanego obszaru za pomocą narzędzia Line Tool. Długość linii zostanie obliczona i dodana do tabeli danych (Rysunek 2B).
4. Zidentyfikuj obiekty za pomocą filtra „Objects by Intensity” (tryb Measurements). Określ próg w taki sposób, aby klastry synaptyczne zostały podświetlone, a niesynaptyczne tło nie (Rysunek 2C). Włączenie niezależnego markera synaptycznego znakowanego innym kolorem może pomóc w jednoznacznym zidentyfikowaniu synaps. Typowe synapsy obejmują od kilku do kilkuset wokseli. Ustaw próg raz, korzystając z próbki kontrolnej, i stosuj go we wszystkich kolejnych próbkach. Ustalanie progu oddzielnie dla każdej próbki jest niedopuszczalne, ponieważ wprowadza ryzyko błędu wynikającego z subiektywnej oceny eksperymentatora. Obiekty są wybierane i tabulowane automatycznie (Rysunek 2D).
5. Uporządkuj i wyeksportuj dane. Usuń obiekty o rozmiarze 2 wokseli lub mniej, ponieważ są to zazwyczaj drobinki tła. Można je usunąć poprzez dodatkową filtrację lub podczas późniejszej analizy. Aby ułatwić ich usuwanie na dalszym etapie, ponownie posortuj plik danych według „object size”, tak aby zostały one zgrupowane razem. Wyeksportuj dane w formacie CSV, który można otworzyć w programie Microsoft Excel lub innych programach do arkuszy kalkulacyjnych. Każdy obraz generuje jeden plik wyjściowy.
6. W przypadku braku oprogramowania Volocity można zastosować alternatywne metody analizy projekcji płaszczyzny Z danych konfokalnych (np. ref. ⁷ lub analiza ręczna przy użyciu programu ImageJ), choć wiąże się to z utratą informacji trójwymiarowej (patrz sekcja Dyskusja).

4. Reprezentatywne wyniki

Przedstawiona metoda kwantyfikacji powinna umożliwiać rozróżnienie populacji klastrów o różnej jasności i różnych objętościach. Reprezentatywne obrazy i odpowiadające im dane ilościowe przedstawione na Rysunku 3 demonstrują przykłady różnicowania na podstawie tych parametrów. Co do zasady, wyniki powinny być zgodne z tym, co jest widoczne gołym okiem. W przypadku immunobarwienia receptorów GABA UNC-49 w brzusznych sznurach nerwowych C. elegans, wszystkie zwierzęta zazwyczaj wydawały się bardzo podobne pod względem wielkości i stopnia dojrzałości, a całkowite wartości fluorescencji synaptycznej dla grupy pięciu nicieni (znormalizowane do długości analizowanego sznura nerwowego) wykazały błąd standardowy na poziomie około 10% średniej ⁴. Mutacje genetyczne i inne zabiegi eksperymentalne (np. ekspozycja na leki) mogą zmieniać nie tylko wartości objętości i intensywności oraz rozkłady częstotliwości klastrów synaptycznych, ale być może także przebieg czasowy rozwoju i synchronizację nicieni, co prowadzi do większej zmienności. Niemniej jednak wyniki ilościowe powinny zawsze odzwierciedlać to, co można ocenić wizualnie, a jeśli tak nie jest, analiza obrazów i obiektów zidentyfikowanych przez program Volocity powinna wykazać, gdzie wystąpił błąd i zasugerować działania naprawcze, takie jak ponowne ustalenie progu (re-thresholding) lub usunięcie obiektów artefaktowych.

Rysunek 1. Przygotowanie zsynchronizowanych kultur C. elegans. Zsynchronizowane kultury uzyskuje się dzięki tej procedurze, ponieważ rozwój C. elegans zatrzymuje się na stadium larwalnym L1 w przypadku braku pożywienia i wznawia się po jego wprowadzeniu.

Rycina 2. Ilościowe oznaczanie punktów synaptycznych.

1. Zbędne obszary obrazu są wycinane w celu zmniejszenia rozmiarów plików i zwiększenia specyficzności. Panel lewy przedstawia obraz początkowy, panel środkowy wybrany obszar, a panel prawy obraz po wycięciu. Sygnał czerwony to immunofluorescencja receptora GABA UNC-49, sygnał zielony to synaptobrevin-GFP (marker presynaptyczny) ekspresowany w presynaptycznych neuronach GABA ⁴. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą rycina.
2. Wzdłuż analizowanego segmentu sznura nerwowego rysowana jest linia, a jej długość jest automatycznie rejestrowana w tabeli wyników. Informacja ta jest niezbędna do normalizacji danych synaptycznych ze względu na długość analizowanego sznura nerwowego, która może różnić się kilkukrotnie, jeśli nicienie ulegną fragmentacji podczas barwienia. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą rycina.
3. Stosowany jest próg (threshold), aby zidentyfikować poszczególne klastry synaptyczne. Panel lewy przedstawia obraz przed progowaniem; przykłady różnych poziomów progowania pokazane są w osobnych panelach (sygnał zielony pominięty). Każdy zidentyfikowany obiekt jest przedstawiony na obrazie jako kolorowy obszar. Należy zwrócić uwagę na zgodność między wizualnie widocznymi klastrami synaptycznymi w panelu najbardziej lewym a kolorowymi obszarami w panelu najbardziej prawym. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą rycina.
4. Każdy zidentyfikowany obiekt jest wymieniony oddzielnie w tabeli wyników. Poszczególne obiekty można zaznaczyć, a w razie potrzeby zostaną one podświetlone na obrazie do inspekcji. Należy pamiętać, że tabela zawiera informacje dla kanałów czerwonego ('rhodamine') i zielonego ('EGFP'); informacje z kanału zielonego mogą być mylące, ponieważ obiekty identyfikowano ściśle na podstawie fluorescencji czerwonej. Analizę tę można przeprowadzić również na obrazach jednobarwnych. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą rycina.

Rysunek 3. Reprezentatywne wyniki. Reprezentatywne mikrofotografie osobników dzikiego typu C. elegans barwionych pod kątem receptorów GABA UNC-49 przed (A) i po (B) zastosowaniu muscimolu, agonisty receptora GABA, który powoduje downregulation receptorów po długotrwałej ekspozycji. Panele przedstawiają przycięte obrazy przed (lewo) i po (prawo) progowaniu oraz usunięciu małych plamek tła. (C) Wykresy ilościowych parametrów synaptycznych dla okazów pokazanych w (A) i (B): całkowita fluorescencja znormalizowana do długości sznura nerwowego (lewo) oraz histogramy skumulowanego prawdopodobieństwa zawartości fluorescencji poszczególnych synaps (środek) i objętości synaps (prawo), wykazujące statystycznie istotny spadek zawartości i objętości synaptycznej wywołany ekspozycją na agonistę (n = 60 synaps dla nieleczonych, n = 115 synaps dla leczonych muscimolem; p < 0.001, test Kołmogorowa-Smirnowa http://www.physics.csbsju.edu/stats/KS-test.html).

Dyskusja

Metoda zaprezentowana w niniejszej pracy została opracowana w celu uzyskania ilościowych danych wieloparametrycznych dla dużych populacji synaps u C. elegans, przy jednoczesnym maksymalizowaniu spójności w obrębie grup badawczych. Do realizacji tych celów przyczyniają się trzy cechy. Po pierwsze, barwienie immunocytochemiczne przeprowadza się na synchronizowanych populacjach nicieni, aby upewnić się, że wszystkie zwierzęta są w tym samym wieku. Krok ten jest kluczowy, ponieważ rozwojowa regulacja poziomów ekspre...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Volocity v4.0 lub nowszy	PerkinElmer/Improvision		Sprawdź dostęp do tego oprogramowania w lokalnym ośrodku obrazowania. Oprogramowanie demonstracyjne jest dostępne na stronie internetowej PerkinElmer. Ta metoda wymaga tylko modułu Quantitation of Volocity.
Tabela 2. Specyficzne odczynniki i sprzęt.
Bufor jaj NaCl KCl CaCl2 MgCl2 HEPES (Dostosuj pH do 7,3) 118 mM 48 mM 2 mM 2 mM 24 mM Podchloryn alkaliczny (na 5 ml) Świeże gospodarstwo domowe wybielacz (butelkę wyrzucić 30 dni po otwarciu) 10 N NaOH ddH2O 1,0 ml 0,25 ml 3,75 ml
< class ="jove_content">Stół 1. Solutions.