Automatyczna kwantyfikacja fluorescencji synaptycznej u C. elegans

Podsumowanie

Obfitość receptorów neurotransmiterów zgromadzonych w synapsach silnie wpływa na siłę synaptyczną. Metoda ta pozwala na ilościowe określenie liczby znakowanych fluorescencyjnie receptorów neurotransmiterów w trzech wymiarach z rozdzielczością pojedynczej synapsy u C. elegans, co umożliwia szybką charakterystykę setek synaps w obrębie jednej próbki bez zniekształceń wynikających z projekcji płaszczyzny z.

Streszczenie

Siła synaptyczna odnosi się do amplitudy odpowiedzi postsynaptycznych na zdarzenia uwalniania neuroprzekaźnika z terminala presynaptycznego i ma istotny wpływ na ogólną funkcję obwodów neuronalnych. Siła synaptyczna zależy w sposób krytyczny od liczby receptorów neuroprzekaźników zgromadzonych w miejscach synaptycznych na błonie postsynaptycznej. Poziomy receptorów są ustalane w procesie rozwoju i mogą być zmieniane poprzez transport receptorów między pulami zlokalizowanymi na powierzchni, podsynaptycznymi a wewnątrzkomórkowymi, co stanowi istotny mechanizm plastyczności synaptycznej i neuromodulacji. Rygorystyczne metody ilościowego oznaczania liczby receptorów neuroprzekaźników zlokalizowanych w synapsach są niezbędne do badania rozwoju i plastyczności synaptycznej. Mikroskopia fluorescencyjna jest optymalnym podejściem, ponieważ zachowuje informacje przestrzenne, umożliwiając odróżnienie pul synaptycznych od niesynaptycznych oraz rozróżnienie populacji receptorów zlokalizowanych w różnych typach synaps. Genetyczny organizm modelowy Caenorhabditis elegans jest szczególnie odpowiedni do tych badań ze względu na niewielki rozmiar i względną prostotę jego układu nerwowego, jego przezroczystość oraz dostępność potężnych technik genetycznych, które pozwalają na badanie naturalnych synaps w nienaruszonych zwierzętach.

W niniejszej pracy przedstawiamy metodę ilościowego oznaczania fluorescencyjnie znakowanych synaptycznych receptorów neurotransmiterów u C. elegans. Jej kluczową cechą jest zautomatyzowana identyfikacja i analiza pojedynczych synaps w trzech wymiarach w plikach wynikowych z konfokalnego mikroskopu wielopłaszczyznowego, z tabulacją pozycji, objętości, intensywności fluorescencji oraz całkowitej fluorescencji dla każdej synapsy. Podejście to posiada dwie główne zalety w stosunku do ręcznej analizy projekcji płaszczyzn z niżu (z-plane) danych konfokalnych. Po pierwsze, ponieważ uwzględniona jest każda płaszczyzna zestawu danych konfokalnych, żadne dane nie giną w wyniku projekcji z-plane, która zazwyczaj opiera się na średnich lub maksymalnych wartościach intensywności pikseli. Po drugie, identyfikacja synaps jest zautomatyzowana, lecz może być nadzorowana przez eksperymentatora w trakcie analizy danych, co pozwala na szybką i dokładną ekstrakcję danych z dużej liczby synaps. Z jednej próbki można łatwo uzyskać od setek do tysięcy synaps, co pozwala na stworzenie dużych zestawów danych w celu maksymalizacji mocy statystycznej. Omówiono również kwestie przygotowania C. elegans do analizy oraz przeprowadzenia obrazowania konfokalnego w celu zminimalizowania zmienności między zwierzętami w grupach badawczych. Choć metoda ta została opracowana do analizy receptorów postsynaptycznych u C. elegans, jest ona ogólnie użyteczna dla każdego rodzaju białka zlokalizowanego w synapsach, a w rzeczywistości dla każdego sygnału fluorescencji zlokalizowanego w postaci dyskretnych klastrów, punktów lub organelli.

Procedurę wykonuje się w trzech etapach: 1) przygotowanie próbek, 2) obrazowanie konfokalne oraz 3) analiza obrazów. Etapy 1 i 2 są specyficzne dla C. elegans, natomiast etap 3 ma zastosowanie ogólne do każdego punktowego sygnału fluorescencji w mikrografiach konfokalnych.

Protokół

1. Przygotowanie nicieni do obrazowania

Ten fragment protokołu opiera się na opublikowanych technikach hodowli C. elegans^1,2 i jest przedstawiony na Rysunku 1.

1. Hodować nicienie na płytkach agarowych NGM z wysoką zawartością peptonu (10 cm) zasiających bakterie E. coli szczepu NA22, aż będą bliskie zagłodzenia. W przypadku immunobarwienia jedna płytka pozwoli na uzyskanie wystarczającej liczby nicieni dla jednej indywidualnej barwienia, biorąc pod uwagę straty w procesie oraz rygorystyczne kryteria wyboru osobników do obrazowania (patrz Część 2).
2. Zebrać nicienie, wlewając na płytkę kilka ml ddH₂O, krótko mieszając okrężnie, a następnie przelewając ciecz do stożkowej probówki 15 ml (powtórzyć w razie potrzeby, aby przenieść większość nicieni do probówki). Odwirować w wirówce klinicznej przez 3 min przy 1000x g. Przemyć osad 1–3 razy ddH₂O, aż nadsącz stanie się klarowny, aby usunąć pozostałe bakterie. Do usuwania nadsączu używać polipropylenowych pipet transferowych, ponieważ nicienie przyklejają się do szkła (od tego etapu kluczowe jest minimalizowanie czasu między krokami, aby uniknąć spadku żywotności jaj).
3. Po ostatnim przemyciu resuspender osad z nicieniami w 5 ml alkalicznego roztworu podchlorynu w celu lizy nicieni i uwolnienia jaj. Delikatnie kołysać i badać probówki pod mikroskopem stereoskopowym mniej więcej raz na minutę. Gdy około 50% nicieni zostanie poddanych lizie (będą wyglądać na wygięte i rozbite), przerwać proces lizy, wypełniając probówkę do pełna buforem do jaj (Egg Buffer), kilkukrotnie odwracając i odwirowując przez 3 min przy 1000x g. Czas lizy nie może przekroczyć 5 min.
4. Usunąć nadsącz pipetą transferową i przemyć osad 3 razy buforem do jaj (Egg Buffer).
5. Aby oddzielić jaja od zanieczyszczeń, przeprowadzić ich flotację na poduszce 30% sacharozy w ddH₂O: po ostatnim przemyciu z etapu 1.4 ostrożnie usunąć nadsącz i resuspender osad w 5 ml ddH₂0. Dodać 5 ml sterylnej 60% sacharozy w ddH₂O i dobrze wymieszać. Wirować w wirówce klinicznej przez 6 min przy 1000x g. Jaja zbiorą się na menisku (będą miały mętny wygląd), natomiast zanieczyszczenia opadną na dno.
6. Za pomocą plastikowej pipety transferowej odessać jaja w minimalnej objętości i przenieść na niezasiane płytki agarowe NGM. Wszelkie jaja przywierające do ścianek probówki można delikatnie spłukać i również przenieść. Jedna niezasiana płytka 10 cm na analizowany szczep jest wystarczająca.
7. Inkubować niezasiane płytki z jajami przez noc (~16 h) w temperaturze 20 °C. Przez pierwsze kilka godzin pozostawić pokrywkę lekko uchyloną, aby płytka wyschła, a następnie szczelnie przykryć na noc.
8. Po wykluciu przenieść larwy L1 do stożkowej probówki 15 ml z medium S Basal (dodać kilka ml S Basal na płytkę, wymieszać okrężnie i przelać do probówki). Odwirować w wirówce klinicznej (3 min, 1000x g), resuspender w minimalnej objętości S Basal i przenieść na płytki agarowe NGM 10 cm zasiaiane bakteriami NA22. Na tym etapie używać 2 płytek dla każdej pierwotnej płytki z etapu 1.1. Inkubować, aż nicienie osiągną pożądany wiek.
9. Monitorować hodowle raz lub dwa razy dziennie. Jeśli pojawi się ryzyko zagłodzenia, przenieść je na świeże płytki NA22. W przypadku nicieni typu dzikiego N2 zagłodzeniu poprzedza utworzenie się linii lub fali nicieni przemieszczającej się przez płytkę, gdy zwierzęta masowo migrują z obszarów wyczerpanych z pożywienia. Po uformowaniu się takiej struktury pożywienie zostanie całkowicie zużyte w ciągu kilku godzin.
10. Nicienie są teraz gotowe do immunobarwienia lub obrazowania na żywo. Optymalne jest utrwalanie i barwienie nicieni w zawiesinie, ponieważ pozwala to na łatwe obrazowanie dużych liczb nienaruszonych osobników. Procedury barwienia oparte na protokole Finneya i Ruvkuna^3-6 są preferowane nad procedurami mrożenia i pękania (freeze-crack), ponieważ do obrazowania wymagana jest duża liczba nicieni.

2. Obrazowanie konfokalne

1. Zamocuj nicienie na szkiełkach do obrazowania konfokalnego. Dostosuj gęstość nicieni do poziomu kilku stu osobników na mikrolitr. Przygotuj podkład z 2% agarose w S-basal, otaczając go cienkim pierścieniem wazeliny, aby zapobiec parowaniu podczas obrazowania (nałożyć za pomocą strzykawki 3 ml z odciętą igłą 25 G). Pipetuj kilka mikrolitrów zawiesiny nicieni na szkiełko nakrywkę (w przypadku obrazowania żywych nicieni użyj środka znieczulającego), a następnie opuść podkład z agarose na szkiełko nakrywkę, rozkładając nicienie równomiernie na jego powierzchni.
2. Wybierz nicienie do obrazowania. Wybierz osobniki, w których badane synapsy są skierowane w stronę obiektywu, z przesunięciem radialnym nie większym niż ±45° (gdzie 0° oznacza orientację bezpośrednio w stronę obiektywu). Przeprowadź tę ocenę szybko (w ciągu kilku sekund), aby uniknąć fotobielenia. Skala początkowych hodowli została zoptymalizowana tak, aby zapewnić wystarczającą liczbę nicieni spełniających te kryteria geometryczne.
3. Wykonaj obrazowanie konfokalne preparatu. Najlepsze wyniki dają próbki względnie płaskie, które można objąć około 14 sekcjami o grubości 0.4 μm. Do szybkiego i dokładnego zbierania danych wystarczające są obrazy o wysokiej prędkości i niskiej rozdzielczości (512 x 512 pikseli). Unikaj nasycenia detektora zbyt silnym sygnałem, ponieważ spowoduje to niedoszacowanie sygnałów fluorescencyjnych.

3. Zautomatyzowana identyfikacja i analiza poszczególnych klastrów synaptycznych

1. Otwórz pliki wyjściowe w formacie multi-TIF z mikroskopu konfokalnego, korzystając z oprogramowania Volocity 4.0 (lub nowszego) (PerkinElmer).
2. Wytnij obszary obrazu, które nie zawierają interesującej struktury (Image -> Extended Focus -> Select area of interest using 'Freehand ROI' tool -> Actions -> Crop to Selection; Rycina 2A). Uwaga: funkcja Extended Focus generuje na ekranie komputera projekcję płaszczyzny z, aby ułatwić analizę, ale nie wpływa na podstawowe dane; to samo dotyczy ewentualnych korekt jasności i kontrastu).
3. Zmierz długość analizowanego obszaru za pomocą narzędzia Line Tool. Długość linii zostanie obliczona i dodana do tabeli danych (Rycina 2B).
4. Zidentyfikuj obiekty, korzystając z filtra „Objects by Intensity” (tryb Measurements). Określ próg w taki sposób, aby podświetlone zostały klastry synaptyczne, a nie synaptyczne tło (Rycina 2C). Zastosowanie niezależnego markera synaptycznego znakowanego innym kolorem może pomóc jednoznacznie zidentyfikować synapsy. Typowe synapsy obejmują od kilku do kilkuset wokseli. Ustaw próg raz, korzystając z próbki kontrolnej, a następnie stosuj go do wszystkich kolejnych próbek. Oddzielne wyznaczanie progu dla każdej próbki jest niedopuszczalne, ponieważ wprowadza ryzyko błędu eksperymentatora. Obiekty są wybierane i tabulowane automatycznie (Rycina 2D).
5. Uporządkuj i wyeksportuj dane. Usuń obiekty o rozmiarze 2 wokseli lub mniejszych, ponieważ są to zazwyczaj drobinki tła. Można je wyeliminować poprzez dalsze filtrowanie lub podczas późniejszej analizy. Aby ułatwić ich usunięcie na dalszych etapach, ponownie posortuj plik danych według „object size”, tak aby zostały zgrupowane. Eksportuj dane w formacie CSV, który można otworzyć w programie Microsoft Excel lub innych programach arkuszy kalkulacyjnych. Każdy obraz generuje jeden plik wyjściowy.
6. Jeśli oprogramowanie Volocity jest niedostępne, można zastosować alternatywne metody analizy projekcji płaszczyzn Z danych konfokalnych (np. ref. ⁷ lub analiza ręczna w programie ImageJ), choć wiąże się to z utratą informacji trójwymiarowych (patrz Discussion).

4. Reprezentatywne wyniki

Przedstawiona metoda ilościowa powinna pozwalać na rozróżnianie populacji klastrów o różnej jasności i różnych objętościach. Reprezentatywne obrazy oraz odpowiadające im dane ilościowe przedstawione na Rysunku 3 demonstrują przykłady różnicowania na podstawie tych parametrów. Co do zasady wyniki powinny być zgodne z tym, co jest widoczne gołym okiem. W przypadku immunobarwienia receptorów GABA UNC-49 w brzusznych sznurach nerwowych C. elegans, wszystkie zwierzęta zazwyczaj wydawały się bardzo podobne pod względem wielkości i stopnia dojrzałości, a całkowite wartości fluorescencji synaptycznej dla grupy pięciu osobników (znormalizowane do długości analizowanego sznura nerwowego) wykazały błąd standardowy wynoszący około 10% średniej ⁴. Mutacje genetyczne oraz inne zabiegi eksperymentalne (np. ekspozycja na leki) mogą zmieniać nie tylko wartości objętości i intensywności oraz rozkłady częstotliwości klastrów synaptycznych, ale potencjalnie także przebieg czasowy rozwoju i synchronizację osobników, co prowadzi do większej zmienności. Niemniej jednak wyniki ilościowe powinny zawsze odzwierciedlać to, co można ocenić wizualnie; w przeciwnym razie analiza obrazów i obiektów zidentyfikowanych przez program Volocity powinna ujawnić, gdzie wystąpił błąd i zasugerować działania naprawcze, takie jak ponowne ustalenie progu (re-thresholding) lub usunięcie obiektów artefaktowych.

Rysunek 1. Przygotowanie synchronicznych kultur C. elegans. Synchroniczne kultury uzyskuje się za pomocą tej procedury, ponieważ rozwój C. elegans zatrzymuje się na stadium larwalnym L1 w przypadku braku pożywienia i zostaje wznowiony po jego podaniu.

Rycina 2. Ilościowe oznaczenie punktów synaptycznych.

1. Zbędne obszary obrazu są przycinane w celu zmniejszenia rozmiaru plików i zwiększenia specyficzności. Lewy panel pokazuje obraz początkowy, środkowy panel wybrany obszar, a prawy panel obraz po przycięciu. Sygnał czerwony to immunofluorescencja receptora GABA UNC-49, sygnał zielony to synaptobrevina-GFP (marker presynaptyczny) ekspresowana w presynaptycznych neuronach GABA ⁴. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną rycinę.
2. Rysowana jest linia o długości analizowanego segmentu sznura nerwowego, a jego długość jest automatycznie zapisywana w tabeli wyników. Informacja ta jest niezbędna do normalizacji danych synaptycznych ze względu na długość analizowanego sznura nerwowego, która może różnić się kilkukrotnie, jeśli nicienie ulegną fragmentacji podczas barwienia. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną rycinę.
3. Stosowany jest próg (threshold), aby zidentyfikować poszczególne skupiska synaptyczne. Lewy panel pokazuje obraz przed progowaniem; przykłady różnych poziomów progowania przedstawiono na oddzielnych panelach (pominięto sygnał zielony). Każdy zidentyfikowany obiekt jest przedstawiony na obrazie jako kolorowy obszar. Zwróć uwagę na zgodność między wizualnie widocznymi skupiskami synaptycznymi w najbardziej lewym panelu a kolorowymi obszarami w panelu najbardziej prawym. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną rycinę.
4. Każdy zidentyfikowany obiekt jest wymieniony oddzielnie w tabeli wyników. Można wybierać poszczególne obiekty, które w razie potrzeby są podświetlane na obrazie w celu inspekcji. Należy zauważyć, że tabela zawiera informacje dla kanałów czerwonego („rhodamine”) i zielonego („EGFP”); informacje z kanału zielonego mogą być mylące, ponieważ obiekty zostały zidentyfikowane ściśle na podstawie fluorescencji czerwonej. Analizę tę można przeprowadzić również na obrazach jednobarwnych. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną rycinę.

Rycina 3. Reprezentatywne wyniki. Reprezentatywne mikrofotografie osobników dzikiego typu C. elegans barwionych pod kątem receptorów GABA UNC-49 przed (A) i po (B) traktowaniu muscimolem, agonistą receptora GABA, który powoduje downregulation receptorów po długotrwałej ekspozycji. Panele przedstawiają przycięte obrazy przed (lewo) i po (prawo) progowaniu oraz usunięciu małych plamek tła. (C) Wykresy ilościowych parametrów synaptycznych dla okazów przedstawionych na (A) i (B): całkowita fluorescencja znormalizowana do długości sznura nerwowego (lewo) oraz histogramy skumulowanego prawdopodobieństwa zawartości fluorescencji pojedynczych synaps (środek) i objętości synaps (prawo), wykazujące statystycznie istotną redukcję zawartości i objętości synaptycznej wywołaną ekspozycją na agonistę (n = 60 synaps dla grupy nietraktowanej, n = 115 synaps dla grupy traktowanej muscimolem; p < 0.001, test Kołmogorowa-Smirnowa http://www.physics.csbsju.edu/stats/KS-test.html).

Dyskusja

Metoda zaprezentowana w niniejszej pracy została opracowana w celu uzyskania ilościowych danych wieloparametrycznych dla dużych populacji synaps u C. elegans, przy jednoczesnym maksymalizowaniu spójności w obrębie grup badawczych. Do realizacji tych celów przyczyniają się trzy cechy. Po pierwsze, barwienie immunocytochemiczne przeprowadza się na synchronizowanych populacjach nicieni, aby upewnić się, że wszystkie zwierzęta są w tym samym wieku. Krok ten jest kluczowy, ponieważ rozwojowa regulacja poziomów ekspre...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Volocity v4.0 lub nowsza	PerkinElmer/Improvision		W celu uzyskania dostępu do tego oprogramowania należy skontaktować się z lokalną jednostką obrazowania (imaging core facility). Oprogramowanie demonstracyjne jest dostępne na stronie internetowej firmy PerkinElmer. Metoda ta wymaga jedynie modułu Quantitation oprogramowania Volocity.
Tabela 2. Specyficzne odczynniki i sprzęt.
Bufor do jaj	NaCl KCl CaCl22 MgCl₂2 HEPES (Dostosować pH do 7,3)	118 mM 48 mM 2 mM 2 mM 24 mM
Podchloryn alkaliczny (na 5 ml)	Świeży wybielacz domowy (butelkę należy wyrzucić 30 dni po otwarciu) 10 N NaOH ddH2O2O	1,0 ml 0,25 ml 3,75 ml

Tabela 1. Roztwory.