Artykuł metodologiczny

In vitro analiza makromolekularnych kompleksów sygnałowych CFTR zależnych od domen PDZ

11K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/4091

⸱

13 sierpnia 2012

 ,  , 
1Department of Biochemistry & Molecular Biology, Wayne State University School of Medicine, 2Cardiovascular Research Institute, Wayne State University School of Medicine, 3Barbara Ann Karmanos Cancer Institute, Wayne State University School of Medicine

W tym artykule

Podsumowanie

Wykazano, że regulator przewodnictwa przezbłonowego w mukowiscydozie (CFTR), będący nabłonkowym kanałem chlorkowym, oddziałuje z różnymi białkami i reguluje istotne procesy komórkowe; wśród nich dobrze udokumentowano oddziaływania pośredniczone przez motyw PDZ białka CFTR. Niniejszy protokół opisuje opracowane przez nas metody składania kompleksu sygnalizacyjnego makromolekularnego CFTR zależnego od domeny PDZ in vitro.

Streszczenie

Regulator przewodnictwa przezbłonowego w mukowiscydozie (CFTR), kanał chlorkowy zlokalizowany głównie w błonach apikalnych komórek nabłonkowych, odgrywa kluczową rolę w transepitelialnej homeostazie płynów1-3. CFTR jest powiązany z dwiema głównymi chorobami: mukowiscydozą (CF)4 oraz biegunką wydzielniczą5. W mukowiscydozie synteza lub aktywność funkcjonalna kanału Cl- CFTR jest obniżona. Zaburzenie to dotyczy około 1 na 2 500 osób rasy białej w Stanach Zjednoczonych6. Nadmierna aktywność CFTR jest również powiązana z przypadkami toksycznie indukowanej biegunki wydzielniczej (np. wywołanej przez toksynę choleryczną i ciepłostabilną enterotoksynę E. coli), która stymuluje produkcję cAMP lub cGMP w jelitach7.

Narastające dowody sugerują istnienie interakcji fizycznych i funkcjonalnych między CFTR a coraz większą liczbą innych białek, w tym transporterami, kanałami jonowymi, receptorami, kinazami, fosfatazami, cząsteczkami sygnałowymi i elementami cytoszkieletu, a wykazano, że interakcje te między CFTR a białkami wiążącymi odgrywają kluczową rolę w regulacji zależnego od CFTR transepitelowego transportu jonów in vitro oraz in vivo8-19. W niniejszym protokole skupiamy się wyłącznie na metodach pomocnych w badaniu interakcji między karboksylowym końcem ogona CFTR, który posiada motyw wiążący białka [określany jako motyw PSD95/Dlg1/ZO-1 (PDZ)], a grupą białek rusztowaniowych zawierających specyficzny moduł wiążący określany jako domeny PDZ. Do tej pory opisano kilka różnych białek rusztowaniowych PDZ, które wiążą się z końcem karboksylowym CFTR z różnym powinowactwem, takich jak NHERF1, NHERF2, PDZK1, PDZK2, CAL (ligand związany z CFTR), Shank2 i GRASP20-27. Motyw PDZ w obrębie CFTR rozpoznawany przez białka rusztowaniowe PDZ to cztery ostatnie aminokwasy na końcu C (tj., 1477-DTRL-1480 w ludzkim CFTR)20. Co ciekawe, CFTR może wiązać więcej niż jedną domenę PDZ zarówno NHERF-ów, jak i PDZK1, choć z różnym powinowactwem22. Wykazano, że ta wielowartościowość w odniesieniu do wiązania CFTR ma znaczenie funkcjonalne, co sugeruje, że białka rusztowaniowe PDZ mogą ułatwiać tworzenie makromolekularnych kompleksów sygnałowych CFTR w celu zapewnienia specyficznego/selektywnego i wydajnego sygnalizowania w komórkach16-18.

Opracowano wiele analiz biochemicznych do badania oddziaływań białkowych z udziałem CFTR, takich jak ko-immunoprecypitacja, test pull-down, analiza wiązania par białek, kolorymetryczna analiza wiązania par białek oraz analiza montażu kompleksów makromolekularnych16-19,28,29. W niniejszym opracowaniu skupiamy się na szczegółowych procedurach składania in vitro kompleksu makromolekularnego zawierającego CFTR, zależnego od motywu PDZ, który jest szeroko wykorzystywany w naszym laboratorium do badania oddziaływań białko-białko lub domena-domena z udziałem CFTR16-19,28,29.

Protokół

1. Ekspresja i oczyszczanie rekombinowanych białek fuzyjnych z przyłączoną etykietą w bakteriach

  1. Wzmocnić określone regiony końcówek C (ostatnie 50-100 aminokwasów zawierające motywy PDZ na końcu C-terminalnym) dla CFTR, LPA2, MRP2, MRP4, β2AR oraz NHERF (pełnej długości lub domen PDZ1 lub PDZ2) za pomocą metody PCR.
  2. Sklonować produkty PCR do wektora pGEX4T-1 dla białek fuzji z GST (takich jak GST-NHERF, GST-MRP4 CT), wektora pMAL-C2 dla białek fuzji z MBP (takich jak MBP-β2AR CT, MBP-CFTR CT) oraz pET30 dla białek fuzji z His-S (takich jak His-S-CFTR CT, His-S-PDZK1).
  3. Przeprowadzić transformację w szczepie E. coli pozbawionym proteaz (BL21-DE3), aby zminimalizować możliwą degradację rekombinowanego białka.
  4. Hodować kulturę przez noc w temperaturze 37 °C w medium Luria-Bertani (pH 7.0) zawierającym odpowiednie antybiotyki (takie jak ampicylina lub kanamycyna). Rozcieńczyć kulturę nocną w stosunku 1:10 i hodować przez kolejne 2 hr w temperaturze 37 °C. Indukować 0,5-1 mM IPTG przez następne 4 hr w temperaturze 30 °C. Osadzić komórki poprzez wirowanie przy 8 000 × g przez 10 min w temperaturze 4 °C.
  5. Zlizować komórki w buforze sacharozowym (50 mM Tris-HCl, pH 8.0, 1 mM EDTA, 1 mM PMSF i 10% sacharozy) zawierającym lizozym (1 mg/ml), 0,2% Triton X-100 oraz inhibitory proteaz. Użyć 20 ml na osad komórkowy pochodzący z 1 L kultury.
  6. Mieszać na wstrząsarce rotacyjnej przez 30 min w temperaturze 4 °C.
  7. Wirować przy 20 000 × g przez 30 min w temperaturze 4 °C. Zebrać klarowny supernatant.
  8. Do klarownego supernatantu dodać 1 ml następujących kulek żywicznych/agarozowych (50% zawiesina w buforze sacharozowym):
    • kulki agarozowe z glutationem dla białek fuzji GST.
    • kulki Talon dla białek fuzji His-S.
    • żywicę amylozową dla białek fuzji MBP.
  9. Mieszać przez 4 hr w temperaturze 4 °C na wstrząsarce rotacyjnej.
  10. Przemyć kulki, resuspendując je w 1x PBS (15 ml), mieszając przez 2 min, wirowaniu przy 800 × g przez 2 min i odrzucając supernatant. Powtórzyć ten krok 6 razy.
  11. Eluować białko z kulek, używając odpowiedniego buforu do elucji (2 ml buforu do elucji na 1 ml kulek).
    • Bufor do elucji dla białek fuzji GST: 25 mM Tris-HCl (pH 8.0), 140 mM NaCl i 20 mM zredukowanego glutationu.
    • Bufor do elucji dla białek fuzji His: 20 mM Tris-HCl (pH 8.0), 500 mM NaCl i 200 mM imidazolu.
    • Bufor do elucji dla białek fuzji MBP: 20 mM Tris-HCl (pH 8.0), 200 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM DTT i 10 mM maltozy.
  12. Dializować eluoowane białka przeciwko 2 L 1x PBS w temperaturze 4 °C (aby uniknąć możliwej degradacji białek). Wymieniać PBS co 4 hr przez 4 razy. Skoncentrować białko za pomocą filtra Centricon (odcięcie 10 000 MW, Millipore) i przechowywać w małych alikwotach w temperaturze -80 °C.
  13. Wyznaczyć stężenie białka metodą Bradforda. Ocenić jakość białka za pomocą SDS-PAGE, używając BSA jako wzorca. Jeśli integralność białka jest niesatysfakcjonująca, można zastosować wtórne procedury oczyszczania, takie jak filtracja żelowa lub wymiana jonowa (np. użyliśmy kolumny G-75 Sepharose do dalszego oczyszczania białka fuzji GST).

2. Hodowla komórek i przygotowanie lizatu komórkowego

  1. Hodować komórki nerki młodych chomików (BHK) stabilnie nadekspresujące CFTR-wt i CFTR-his10 lub komórki BHK przejściowo nadekspresujące Flag-LPA2-wt lub Flag-LPA2-ΔSTL, a także komórki nerki psa Madin-Darby (MDCK) stabilnie nadekspresujące MRP2 w minimalnym podłożu niezbędnym Eagle'a (MEM) zawierającym 10% płodowej surowicy cielęcej oraz penicylinę/streptomycynę w kolbach polistyrenowych w temperaturze 37 °C przy 5% CO2.
  2. Hodować ludzkie komórki embrionalne nerki 293 (HEK293) stabilnie nadekspresujące CFTR-wt i CFTR-his10 w modyfikowanym podłożu Eagle'a według Dulbecco (DMEM) uzupełnionym o 10% płodowej surowicy bydlęcej oraz penicylinę/streptomycynę w kolbach polistyrenowych w temperaturze 37 °C przy 5% CO2.
  3. Lizować komórki w buforze do lizy (PBS – 0,2% Triton-X-100 uzupełniony mieszaniną inhibitorów proteaz zawierającą 1 mM fluorek fenylometylosulfonylowy, 1 μg/ml aprotyniny, 1 μg/ml leupeptyny, 1 μg/ml pepstatyny); użyć 500 μl buforu do lizy na każdą płytkę Petriego o średnicy 60 mm oraz 1000 μl buforu do lizy na każdą płytkę Petriego o średnicy 100 mm.
  4. Wstrząsać lizatami komórkowymi przez 20 min w 4 °C, a następnie usunąć materiał nierozpuszczalny poprzez wirowanie przy 16 000 × g przez 15 min w 4 °C. Określić stężenie białka za pomocą metody Bradforda.

3. Montaż makromolekularnego kompleksu zawierającego CFTR (CFTR-PDZK1-MRP4) in vitro

  1. Do 200 μl buforu do lizy (PBS – 0,2% Triton-X 100 + inhibitory proteaz), dodać 20 μg oczyszczone białko fuzyjne GST-MRP4-końcówka C 50 a.a. (CT50).
  2. Dodaj różne ilości (0-40 μg) oczyszczonego białka fuzyjnego His-S-PDZK1.
  3. Wymieszaj oba białka na mieszalniku rotacyjnym przy 22 °C przez 1–2 h.
  4. Dodaj 20 μl kulki z glutationem (zawiesina 50%) do mieszaniny białek i kontynuuj mieszanie przez kolejną 1 godzinę. Krok ten nazywany jest również wiązaniem parowym.
  5. W tym czasie należy przygotować lizaty komórek HEK293 wykazujących nadekspresję Flag-CFTR (wt), zgodnie z opisem w kroku 2).
  6. Przemyj kompleks dwukrotnie buforem lizującym. Wirować przy 800 × g przez 1 min podczas każdego płukania, a po każdym płukaniu ostrożnie odessać nadsącz. Należy zachować ostrożność, aby nie odessać kulek znajdujących się na dnie.
  7. Dodaj przygotowane wcześniej lizaty komórek HEK293 do kulek i delikatnie wymieszaj w 4 °C przez 3 h (lub przez noc).
  8. Kuleczki należy dokładnie przemyć 3 razy buforem lizującym, zgodnie z opisem w kroku 3.6).
  9. Eluuj białka za pomocą 30 μl Bufor do próbek (5×): 0,6 M Tris-HCl (pH 6,8), 50% glicerolu, 2% SDS i 0,1% błękitu bromofenolowego; zawierający 5% β-merkaptoetanolu.
  10. Inkubować w 37 °C kąpiel wodna przez 10–15 min, a następnie wirowanie przy 5 000 × g przez 30 s, aby wytrącić kuleczki.
  11. Nałóż cały eluat na żel 4-15%.
  12. Przeprowadź elektroforezę SDS-PAGE przez około 30–40 min.
  13. Przenieś prążki białkowe na membranę PVDF przez 1,5 h.
  14. Zablokować membranę w buforze TBS-Tween zawierającym 5% odtłuszczonego mleka.
  15. Inkubować membranę z przeciwciałem pierwszorzędowym (np. anty-CFTR IgG, R1104) w 4 °Cprzez noc.
  16. Przemyj membranę roztworem TBS-Tween przez 5 min, powtarzając tę czynność 6 razy.
  17. Inkubować membranę z przeciwciałem wtórnym (takim jak przeciwciało kozie anty-mysie sprzężone z HRP 2nd przeciwciało) przez 45 min w 22 °C.
  18. Przemyj membranę roztworem TBS-Tween przez 5 min, powtórzone 6 razy.
  19. Wizualizuj prążki białkowe za pomocą ECL.
  20. Reprezentatywne dane przedstawiono na Rysunek 1.

4. Reprezentatywne wyniki

Przykład makromolekularnego kompleksu sygnalizacyjnego zawierającego CFTR, który został zmontowany in vitro, przedstawiono na Rysunku 1. Kompleks makromolekularny utworzył się pomiędzy 50 aminokwasami końca C-końcowego MRP4 (MRP4-CT50), PDZK1 a pełnowymiarowym białkiem CFTR (Rysunek 1, dół). Formowanie kompleksu wzrastało w sposób zależny od dawki wraz ze zwiększaniem ilości białka pośredniczącego, PDZK1 (Rysunek 1, dół)18.

Interakcja Flag-CFTR; analiza diagramu i blotu; kompleks makromolekularny; gradient His-PDZK1.
Rysunek 1. Schematyczny przedstawienie testu kompleksu makromolekularnego (góra). Kompleks makromolekularny wykryto in vitro z udziałem trzech białek (GST-MRP4-CT50, His-S-PDZK1 oraz Flag-CFTRwt) w sposób zależny od dawki (dół)18.

 CFTR-NHERF1-β2AR (ref.14)CFTR-NHERF2-LPA2 (ref. 15)Białka CFTR-PDZ-MRP2 (ref. 17)CFTR-PDZK1-MRP4 (ref. 16)
Kuleczki powinowactwaŻywica amylozowaagaroza z białkiem SŻywica amylozowaAgaroza z glutationem
Oczyszczone białko-1MBP-β2CT ARHis-S-CFTR CTCT MBP-CFTRGST-MRP4 CT
Oczyszczone białko-2GST-NHERF1GST-NHERF2białka GST-PDZHis-S-PDZK1
Oczyszczone białko-3 (lub lizaty komórkowe)CFTR-wt lub CFTR-his10 (lizaty komórek BHK lub HEK)Flag-LPA2-wt lub Flag-LPA2-ΔSTL (lizaty komórek BHK)MRP2 (lizaty komórek MDCK)Oczyszczone białko Flag-CFTR-wt lub CFTR-his10 (lub lizatów komórkowych)
Przeciwciałoanty-CFTR IgGanty-Flag HRPPrzeciwciała IgG przeciwko MRP2anty-Flag HRP

Tabela 1. Podsumowanie różnych kompleksów makromolekularnych zawierających CFTR, zmontowanych in vitro.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

W niniejszym protokole zaprezentowano metodę składania in vitro oraz detekcji makromolekularnego kompleksu sygnalizacyjnego zawierającego białko CFTR, z wykorzystaniem oczyszczonych białek (lub fragmentów białek) i/lub lizatów komórkowych, zgodnie z wcześniejszymi doniesieniami16-19,29,30. Aby uzyskać najlepsze wyniki, podczas procesu przygotowania szczególną uwagę należy zwrócić na następujące krytyczne punkty:

  • Podczas oczyszczania białka fuzyjnego GST zgodnie z opisem w kroku 1), ważne...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Nie zadeklarowano żadnych konfliktów interesów.

Podziękowania

Nasza praca była wspierana przez granty z American Heart Association (Greater Southeast Affiliate) Beginning-grant-in-aid 0765185B, grant badawczy Elsa U. Pardee Foundation, wewnętrzne fundusze startowe Wayne State University oraz nagrodę Isis Initiative z Cardiovascular Research Institute. Ta metoda składania makromolekularnego kompleksu CFTR in vitro została pierwotnie opracowana przez dr. A.P. Narena (University of Tennessee Health Science Center).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
wektor pGEX4T-1GE Healthcare28-9545-49dawniej Amersham Biosciences
wektor pMAL-C2New England BioLabs
wektor pET30EMD Chemicals69077-3dawniej Novagen
Kuleczki agarozowe z glutationemBD Biosciences554780
Żywica amylozowaNew England BioLabsE8021S
Kuleczki TalonClontech635501
zredukowany glutationBD Biosciences554782
imidazolFisherBP305-50
maltozaFisherBP684-500
agaroza z białkiem SEMD Chemicals69704-3dawniej Novagen
anty-Flag HRPSigmaA8592
Przeciwciała anty-CFTR IgGWykonany na zamówienieR1104przeciwciało monoklonalne (mAb) rozpoznające epitop CFTR w obrębie aminokwasów 722-734
Przeciwciała IgG przeciwko MRP2Chemicon InternationalMAB4148Obecnie część firmy Millipore

Tabela 2. Specyficzne odczynniki i sprzęt.

Bibliografia

  1. Anderson, M. P. Demonstration that CFTR is a chloride channel by alteration of its anion selectivity. Science. 253, 202-205 (1991).
  2. Bear, C. E. Purification and functional reconstitution of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR. Cell. 68, 809-818 (1992).
  3. Quinton, P. M. Chloride impermeability in cystic fibrosis. Nature. 301, 421-422 (1983).
  4. Cheng, S. H. Defective intracellular transport and processing of CFTR is the molecular basis of most cystic fibrosis. Cell. 63, 827-834 (1990).
  5. Gabriel, S. E., Brigman, K. N., Koller, B. H., Boucher, R. C., Stutts, M. J. Cystic fibrosis heterozygote resistance to cholera toxin in the cystic fibrosis mouse model. Science. 266, 107-109 (1994).
  6. Li, C., Naren, A. P. CFTR chloride channel in the apical compartments: spatiotemporal coupling to its interacting partners. Integr. Biol (Camb). 2, 161-177 (2010).
  7. Chao, A. C. Activation of intestinal CFTR Cl- channel by heat-stable enterotoxin and guanylin via cAMP-dependent protein kinase. Embo. J. 13, 1065-1072 (1994).
  8. Gabriel, S. E., Clarke, L. L., Boucher, R. C., Stutts, M. J. CFTR and outward rectifying chloride channels are distinct proteins with a regulatory relationship. Nature. 363, 263-268 (1993).
  9. McNicholas, C. M. Sensitivity of a renal K+ channel (ROMK2) to the inhibitory sulfonylurea compound glibenclamide is enhanced by coexpression with the ATP-binding cassette transporter cystic fibrosis transmembrane regulator. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 93, 8083-8088 (1996).
  10. Schreiber, R., Nitschke, R., Greger, R., Kunzelmann, K. The cystic fibrosis transmembrane conductance regulator activates aquaporin 3 in airway epithelial cells. J. Biol. Chem. 274, 11811-11816 (1999).
  11. Shumaker, H., Amlal, H., Frizzell, R., Ulrich, C. D. 2nd, Soleimani, M. CFTR drives Na+-nHCO-3 cotransport in pancreatic duct cells: a basis for defective HCO-3 secretion in CF. Am. J. Physiol. 276, 16-25 (1999).
  12. Ahn, W. Regulatory interaction between the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator and HCO3- salvage mechanisms in model systems and the mouse pancreatic duct. J. Biol. Chem. 276, 17236-17243 (2001).
  13. Sugita, M., Yue, Y., Foskett, J. K. CFTR Cl- channel and CFTR-associated ATP channel: distinct pores regulated by common gates. Embo. J. 17, 898-908 (1998).
  14. Naren, A. P. Regulation of CFTR chloride channels by syntaxin and Munc18 isoforms. Nature. 390, 302-305 (1997).
  15. Naren, A. P. Syntaxin 1A is expressed in airway epithelial cells, where it modulates CFTR Cl(-) currents. J. Clin. Invest. 105, 377-386 (2000).
  16. Naren, A. P. A macromolecular complex of beta 2 adrenergic receptor, CFTR, and ezrin/radixin/moesin-binding phosphoprotein 50 is regulated by PKA. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 100, 342-346 (1073).
  17. Li, C. Lysophosphatidic acid inhibits cholera toxin-induced secretory diarrhea through CFTR-dependent protein interactions. J. Exp. Med. 202, 975-986 (2005).
  18. Li, C. Spatiotemporal coupling of cAMP transporter to CFTR chloride channel function in the gut epithelia. Cell. 131, 940-951 (2007).
  19. Li, C., Schuetz, J. D., Naren, A. P. Tobacco carcinogen NNK transporter MRP2 regulates CFTR function in lung epithelia: implications for lung cancer. Cancer Lett. 292, 246-253 (2010).
  20. Hall, R. A. A C-terminal motif found in the beta2-adrenergic receptor, P2Y1 receptor and cystic fibrosis transmembrane conductance regulator determines binding to the Na+/H+ exchanger regulatory factor family of PDZ proteins. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 95, 8496-8501 (1998).
  21. Short, D. B. An apical PDZ protein anchors the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator to the cytoskeleton. J. Biol. Chem. 273, 19797-19801 (1998).
  22. Wang, S., Yue, H., Derin, R. B., Guggino, W. B., Li, M. Accessory protein facilitated CFTR-CFTR interaction, a molecular mechanism to potentiate the chloride channel activity. Cell. 103, 169-179 (2000).
  23. Sun, F. E3KARP mediates the association of ezrin and protein kinase A with the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator in airway cells. J. Biol. Chem. 275, 29539-29546 (2000).
  24. Cheng, J. A Golgi-associated PDZ domain protein modulates cystic fibrosis transmembrane regulator plasma membrane expression. J. Biol. Chem. 277, 3520-3529 (1074).
  25. Scott, R. O., Thelin, W. R., Milgram, S. L. A novel PDZ protein regulates the activity of guanylyl cyclase C, the heat-stable enterotoxin receptor. The Journal of biological chemistry. 277, 22934-22941 (1074).
  26. Lee, J. H. Dynamic regulation of cystic fibrosis transmembrane conductance regulator by competitive interactions of molecular adaptors. The Journal of biological chemistry. 282, 10414-10422 (2007).
  27. Gee, H. Y., Noh, S. H., Tang, B. L., Kim, K. H., Lee, M. G. Rescue of DeltaF508-CFTR trafficking via a GRASP-dependent unconventional secretion pathway. Cell. 146, 746-760 (2011).
  28. Naren, A. P. Methods for the study of intermolecular and intramolecular interactions regulating CFTR function. Met. Molecul. Med. 70, 175-186 (2002).
  29. Li, C., Roy, K., Dandridge, K., Naren, A. P. Molecular assembly of cystic fibrosis transmembrane conductance regulator in plasma membrane. The Journal of biological chemistry. 279, 24673-24684 (2004).
  30. Li, C., Naren, A. P. Analysis of CFTR Interactome in the Macromolecular Complexes. Met. Molecul. Med. 741, 255-270 (2011).
  31. Wu, Y. A chemokine receptor CXCR2 macromolecular complex regulates neutrophil functions in inflammatory diseases. J. Biol. Chem. , (2011).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Makromolekularny kompleks CFTRwi zanie zale ne od domen PDZkoimmunoprecypitacjatest pull downWestern blottingbia ka fuzyjne GSTbia ka fuzyjne z etykiet Hislizat kom rek HEK 293bia ka rusztowania PDZoznaczenie st enia bia ka

Powiązane artykuły