Oczyszczanie wakuol patogennych z fagocytów zainfekowanych Legionella

Podsumowanie

Niniejszy artykuł opisuje metodę izolacji i oczyszczania nienaruszonych wakuol zawierających Legionella (LCV) z ameb i makrofagów. Dwuetapowy protokół obejmuje wzbogacanie LCV poprzez separację immunomagnetyczną z wykorzystaniem przeciwciała przeciwko bakteryjnemu markerowi LCV oraz dalsze oczyszczanie za pomocą wirowania w gradiencie gęstości.

Streszczenie

Patogen oportunistyczny Legionella pneumophila jest bakterią oporną na ameby, która replikuje się również w makrofagach pęcherzykowych, wywołując w ten sposób ciężkie zapalenie płuc znane jako „choroba legionistów”¹. W fagocytach pierwotniaków i ssaków L. pneumophila wykorzystuje konserwatywny mechanizm do tworzenia specyficznej, umożliwiającej replikację przedziałowej struktury, tzw. „wakuoli zawierającej Legionella” (LCV). Formowanie LCV wymaga bakteryjnego systemu sekrecji typu IV Icm/Dot (T4SS), który translokuje do komórek gospodarza nawet 275 białek „efektorowych”. Efektory te manipulują białkami oraz lipidami gospodarza i komunikują się z organellami wydzielniczymi, endosomalnymi oraz mitochondrialnymi^2-4.

Tworzenie LCV stanowi złożony, wytrzymały i redundantny proces, który jest trudny do uchwycenia w sposób redukcjonistyczny. Aby kompleksowo zrozumieć powstawanie LCV, wymagane jest podejście integracyjne, obejmujące globalną analizę oddziaływań między czynnikami patogenu a gospodarza oraz ich dynamikę czasową i przestrzenną. Jako pierwszy krok w stronę tego celu, nienaruszone LCV są oczyszczane i analizowane za pomocą proteomiki oraz lipidomiki.

Skład i formowanie się wakuol zawierających patogeny badano za pomocą analiz proteomicznych z wykorzystaniem chromatografii cieczowej lub elektroforezy 2-D w żelu sprzężonej ze spektrometrią mas. Wakuole wyizolowane zarówno z społecznej ameby glebowej Dictyostelium discoideum, jak i z fagocytów ssaków, zawierały Leishmania⁵, Listeria⁶, Mycobacterium⁷, Rhodococcus⁸, Salmonella⁹ lub Legionella spp.¹⁰. Jednakże protokoły oczyszczania stosowane w tych badaniach są czasochłonne i uciążliwe, ponieważ wymagają one m.in. mikroskopii elektronowej do analizy morfologii, integralności i czystości LCV. Ponadto protokoły te nie wykorzystują specyficznych cech wakuoli patogennych w celu ich wzbogacenia.

Metoda przedstawiona w niniejszym opracowaniu pokonuje te ograniczenia poprzez zastosowanie D. discoideum produkującego fluorescencyjny marker LCV oraz poprzez celowanie w bakteryjne białko efektorowe SidC, które selektywnie zakotwicza się w błonie LCV poprzez wiązanie z fosfatydyloinozytolem 4-fosforanem (PtdIns(4)P)^3,11. W pierwszym kroku LCV są wzbogacane za pomocą immunomagnetycznej separacji z wykorzystaniem oczyszczonego powinowactwem przeciwciała pierwszorzędowego przeciwko SidC oraz przeciwciała wtórnego sprzężonego z kulkami magnetycznymi, a następnie w drugim kroku za pomocą klasycznego wirowania w gradiencie gęstości Histodenz^12,13 (Rys. 1).

Badanie proteomu wyizolowanych LCV z D. discoideum ujawniło ponad 560 białek komórki gospodarza, w tym białka związane z pęcherzykami fagocytarnymi, mitochondriami, ER i aparatem Golgiego, a także kilka GTPaz, których nie wiązano wcześniej z formowaniem LCV¹³. LCV wzbogacone i oczyszczone zgodnie z opisanym tutaj protokołem mogą być dalej analizowane za pomocą mikroskopii (immunofluorescencji, mikroskopii elektronowej), metod biochemicznych (Western blot) oraz podejść proteomicznych lub lipidomicznych.

Protokół

1. Przygotowania do izolacji LCV

1. Na cztery dni przed izolacją LCV wysiać Legionella pneumophila produkującą DsRed-Express^13,14 z zapasów glicerynowych na płytki z agarem CYE z dodatkiem 5 μg/mL chloramfenikolu (Cam). Inkubować bakterie w temperaturze 37 °C.
2. Na jeden dzień przed infekcją zasiać 1 x 10⁷ D. discoideum produkujących GFP-kalneksynę lub mysie makrofagi RAW264.7 w kolbach do hodowli tkankowych o powierzchni 75 cm². W przypadku D. discoideum użyć 10 ml pożywki HL5 z dodatkiem 20 μg/mL G418 i inkubować ameby w temperaturze 23 °C. Dla makrofagów RAW264.7 użyć 10 ml pożywki RPMI 1640 uzupełnionej o 10% FCS (inaktywowanej ciepłem) i 1% glutaminy; hodować komórki w temperaturze 37 °C i 5% CO₂. Użyć co najmniej trzech kolb 75 cm² na jedną infekcję i próbkę (minimum 6 x 10⁷ komórek).
3. Przygotować nocną kulturę, szczepiąc L. pneumophila z płytki CYE. Do probówki 15 mL wlać 3 mL pożywki AYE z dodatkiem 5 μg/mL Cam. Zaszczepić 100 μl zawiesiny bakteryjnej, aby uzyskać OD_600nm na poziomie 0,1. Inkubować nocną kulturę na rotatorze w temperaturze 37 °C przez 21-22 h.

2. Izolacja LCV

1. Wymień medium hodowlane komórek D. discoideum, aby usunąć antybiotyk, który mógłby zakłócić przebieg następującej infekcji.
2. Zmierz OD hodowli nocnej. Bakterie powinny osiągnąć szczytową zakaźność przy OD_600nm ≥3, co odpowiada 2 x 10⁹ bakterii/mL.
3. Zainfekuj komórki, dodając około 500 μl nocnej hodowli L. pneumophila do komórek rosnących w 10 ml medium HL5 (D. discoideum) lub w 10 ml RPMI 1640 (makrofagi). Odpowiada to wielokrotności infekcji (MOI) wynoszącej 50. Następnie synchronizuje się infekcję poprzez wirowanie bakterii na komórki przy 500 × g przez 10 min. Po wirowaniu następuje inkubacja komórek D. discoideum w 25 °C, a makrofagów RAW264.7 w 37 °C i 5% CO₂. Czas infekcji wynoszący 1 h obejmuje etap wirowania.
4. Po infekcji usuń medium i raz wypłucz komórki, aby usunąć bakterie zewnątrzkomórkowe. Użyj lodowatego buforu SorC dla D. discoideum oraz lodowatego PBS dla makrofagów RAW264.7. Dodaj 3 mL buforu HS, uzupełnionego inhibitorami proteaz (Roche), do każdej kolby i zbierz komórki za pomocą skrobaka do komórek. Połącz odpowiadające sobie próbki w probówce 15 mL.
5. Do homogenizacji próbki użyj plastikowych strzykawek Luer-Lock 3 mL oraz stalowego homogenizatora kulowego. Upewnij się, że pracujesz na lodzie. Przed rozpoczęciem przemyj homogenizator kulowy wodą destylowaną, aby uniknąć zanieczyszczenia detergentem, a następnie przepłucz go lodowatym buforem HS, aby usunąć pęcherzyki powietrza. Użyj kuli o prześwicie 8 μm.
6. Napełnij strzykawkę pierwszymi 3 mL i zamocuj ją na homogenizatorze. Przepchnij próbkę przez homogenizator dziewięć razy w obie strony. Następnie wymień strzykawki, aby uniknąć zanieczyszczenia materiałem niehomogenizowanym. Zbierz i połącz zhomogenizowaną próbkę w probówce 15 mL i pobierz próbkę 150 μl do analizy mikroskopowej. Przed przejściem do kolejnej próbki rozmontuj i przemyj homogenizator kulowy.
7. Zablokuj homogenat za pomocą 2% CS lub FCS przez 30 min na wytrząsarku na lodzie lub na wirującym kole (10-20 rpm) w 4 °C.
8. Po blokowaniu użyj powinowatościowo oczyszczonego przeciwciała pierwszorzędowego przeciwko SidC (rozcieńczenie 1:3000) lub przeciwko innemu markerowi bakteryjnemu wiążącemu się wyłącznie z błoną LCV. Przed dodaniem do homogenatu wymieszaj roztwór przeciwciał w wirówce typu vortex. Inkubuj próbkę przez 1 h na wytrząsarku na lodzie lub na wirującym kole (10-20 rpm) w 4 °C.
9. W międzyczasie przygotuj gradient Histodenz. Użyj jednej probówki 15 mL na gradient i trzech kolb o powierzchni 75 cm² dla jednej próbki. Najpierw dodaj do probówki 5,75 mL 35% Histodenz, a następnie ostrożnie dodaj na wierzch 5,75 mL 10% roztworu Histodenz. Następnie pozostaw probówki w pozycji poziomej na 1 h.
10. Po inkubacji homogenatu z reagentem blokującym i przeciwciałem pierwszorzędowym, wiruj przy 600 × g przez 15 min w 4°C, aby osadzić próbkę. Odlej supernatant i resuspenderuj osad w 1,5 mL buforu HS. Przenieś próbki do nowej probówki 15 mL i pobierz próbkę 40 μl do późniejszej analizy mikroskopowej.
11. Inkubuj osad z przeciwciałem wtórnym – mikrokuleczkami MACS goat anti-rabbit IgG (rozcieńczenie 1:25) – przez 30 min na wytrząsarce w 4°C. W międzyczasie umieść kolumny na magnetycznym uchwycie MACS i zrównoważ je 0,5 mL buforu HS.
12. Następnie nałóż próbki na kolumnę. Zbierz 150 μl przesączu do późniejszej analizy mikroskopowej. Przemyj kolumnę trzy razy 0,5 mL buforu HS.
13. Zdejmij kolumny z magnesu i eluj LCV za pomocą 0,5 mL buforu HS poprzez szybkie wtryśnięcie. Pobierz próbkę 20 μl do analizy mikroskopowej. Oczekuje się, że etap oczyszczania poprzez separację immunomagnetyczną pozwoli uzyskać z 1 × 10⁷ zainfekowanych komórek D. discoideum około 1 × 10⁶ nienaruszonych LCV, które są około siedmiokrotnie wzbogacone w eluacie w porównaniu z przesączem ¹³.
14. Ustaw probówki z gradientem Histodenz w pozycji pionowej i ostrożnie nałóż eluat na górę. Wiruj probówki przy 3350 × g przez 1 h w 4 °C.
15. Po wirowaniu pobierz frakcje po 1,5 mL, zaczynając od dna probówki, używając długiej szklanej pipety Pasteura. W sumie zbierz osiem frakcji, każdą z dna probówki. W ciągłym gradiencie Histodenz nie obserwuje się widocznych warstw. Najwyższej wydajności LCV zazwyczaj oczekuje się w frakcji 4, przy stosunku ~2 × 10⁵ nienaruszonych LCV na 1 × 10⁷ zainfekowanych ameb ¹³. Niewielkie ilości LCV obecne są również odpowiednio w frakcjach 3 i 5. Zatem całkowita wydajność oczyszczonych LCV wynosi ~1 × 10⁶ nienaruszonych LCV na 6 × 10⁷ zainfekowanych komórek D. discoideum ¹³. Odzysk LCV może być przeprowadzany w temperaturze pokojowej (RT), a LCV wydają się stabilne przez kilka godzin.

3. Analiza mikroskopowa zebranych próbek

1. Przygotować 24-dołkową płytkę do hodowli tkanek z płaskim dnem z zakrywek pokrytymi poli-L-lizyną.
2. Do płytki 24-dołkowej pipetować każdą próbkę pobraną podczas oczyszczania LCV oraz 150 μl każdej frakcji gradientu gęstości. Do każdego dołka dodać 0,5 mL buforu HS, aby rozcieńczyć wysokie stężenie Histodenz. Następnie odwirować płytkę przy 600 × g przez 10 min w temperaturze 4 °C. Ostrożnie usunąć nadsącz i utrwalić próbki w 4% paraformaldehydzie (PFA) przez 20 min w temperaturze pokojowej (RT). Po utrwaleniu przemyć próbki dwukrotnie. W przypadku D. discoideum użyć SorC, a dla makrofagów RAW264.7 PBS.
3. 1. Próbki z D. discoideum wykazujących ekspresję GFP-kalneksyny, pobrane na różnych etapach izolacji LCV, zamontować bezpośrednio na szkiełkach przedmiotowych, używając np. Vectashield.
   2. Próbki z makrofagów RAW264.7, pobrane na różnych etapach izolacji LCV, inkubować z roztworem blokującym (1% BSA w PBS) przez 10 min w temperaturze pokojowej (RT). Aby zabarwić LCV, zastosować przeciwciało pierwszorzędowe anty-SidC i inkubować przez 1 h w wilgotnej komorze w temperaturze pokojowej (oczyszczone powinowactwem przeciwciało królicze anty-SidC; 1:1000 w buforze blokującym). Następnie przemyć próbki trzy razy PBS. Inkubować z przeciwciałem drugorzędowym (np. anty-królicze Cy5; 1:200 w roztworze blokującym) przez 30 min w wilgotnej i ciemnej komorze w temperaturze pokojowej (RT). Na koniec przemyć próbki trzy razy PBS i zamontować na szkiełkach przedmiotowych, używając np. Vectashield.
4. Morfologię, integralność i ilość LCV wyizolowanych z D. discoideum wykazujących ekspresję GFP-kalneksyny lub z makrofagów RAW264.7 analizować za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego wyposażonego w odpowiednie filtry.

4. Reprezentatywne wyniki

Jakość i wydajność oczyszczania LCV za pomocą separacji immunoafinilacyjnej i wirowania w gradiencie gęstości można monitorować za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej (Rys. 1). Przedstawiono przegląd próbek pobranych podczas izolacji LCV z D. discoideum lub makrofagów (Rys. 2). Homogenat fagocytów zakażonych L. pneumophila wykazuje obecność nienaruszonych LCV, ale także znaczną ilość szczątków komórkowych i bakterii pozakomórkowych. Po odwirowaniu osadu obraz jest podobny do homogenatu, niekiedy nieco gęstszy. Ponieważ nienaruszone LCV powinny przylegać do kolumny, frakcja przepływowa zawiera głównie bakterie pozakomórkowe i szczątki komórkowe. Po elucji próbki z kolumny eluat zawiera duże ilości nienaruszonych LCV. W naszych badaniach oczyszczanie LCV wydaje się bardziej efektywne dla D. discoideum niż dla makrofagów. W przypadku D. discoideum wakuole patogenów wydają się bardziej okrągłe, a wydajność izolowanych LCV jest ponad 10 razy wyższa w porównaniu z makrofagami (Rys. 3). W nienaruszonych makrofagach LCV barwione różnymi przeciwciałami wykazują również bardziej nieregularny kształt.

Rycina 1. Schematyczny przegląd izolacji LCV. A) Izolacja LCV za pomocą separacji immunomagnetycznej z wykorzystaniem przeciwciała oczyszczonego powinowactwem przeciwko bakteryjnemu białku efektorowemu SidC, lokalizującemu się wyłącznie w błonie LCV. Do izolacji LCV z resztek komórkowych wykorzystuje się wtórne przeciwciało sprzężone z mikrokulkami MACS oraz magnes. B) Po separacji immunomagnetycznej LCV są dodatkowo oczyszczane za pomocą wirowania w gradiencie gęstości Histodenz. LCV są wzbogacone w frakcji 4.

Rysunek 2. Próbki pobrane podczas oczyszczania LCV. Przedstawiono obrazy z homogenatu, osadu, części przepływowej i eluate z D. discoideum lub makrofagów. Próbki wykazują L. pneumophila produkującą DsRed-Express (czerwony) w D. discoideum produkujących sygnał GFP-kalneksyny (zielony, panel górny) lub w makrofagach barwionych przeciwciałem anty-SidC (cyjan, panel dolny). Paski, 10 μm.

Rysunek 3. Oczyszczone LCV z D. discoideum lub makrofagów. Próbki przedstawiają frakcję 4 po wirowaniu w gradiencie gęstości Histodenz z wykorzystaniem L. pneumophila produkującej DsRed-Express (czerwony) w (A) D. discoideum wykazującym sygnał GFP-kalneksyny (zielony) lub (B) w makrofagach barwionych przeciwciałem anty-SidC (cyjan). Paski skali, 10 μm.

Dyskusja

W przeciwieństwie do wcześniej opublikowanych metod, niniejszy protokół opiera się na dwóch etapach: najpierw na separacji LCV metodą immunomagnetyczną, a następnie na oczyszczaniu LCV poprzez wirowanie w gradiencie gęstości. Izolację LCV można łatwo monitorować za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej, stosując bakterie znakowane fluorescencyjnie i komórki produkujące GFP lub barwienie przeciwciałami. Opisany tutaj protokół jest prostą i bezpośrednią metodą, która pozwala na wzbogacenie frakcji LCV przy zachowaniu wysokie...