Interferencja RNA oparta na wektorach DNA w badaniu funkcji genów w nowotworach

Podsumowanie

Interferencja RNA (RNAi) posiada wiele zalet w porównaniu z nokautem genów i jest szeroko stosowana jako narzędzie w badaniach nad funkcjami genów. Wynalezienie technologii RNAi opartej na wektorach DNA umożliwiło długotrwałe i indukowalne wyciszanie genów, a także zwiększyło wykonalność wyciszania genów in vivo.

Streszczenie

Interferencja RNA (RNAi) hamuje ekspresję genów poprzez specyficzną degradację docelowych cząsteczek mRNA. Od czasu odkrycia dwuniciowych krótkich interferujących RNA (siRNA) w procesie wyciszania genów¹, RNAi stało się potężnym narzędziem badawczym w studiach nad funkcjami genów. W porównaniu z delecją genetyczną, wyciszanie genów za pośrednictwem RNAi posiada wiele zalet, takich jak łatwość przeprowadzenia oraz odpowiedniość dla większości linii komórkowych. Liczne badania wykazały zastosowania technologii RNAi w badaniach nad nowotworami. W szczególności opracowanie technologii opartej na wektorach DNA do produkcji krótkich rybich RNA (shRNA) sterowanych przez promotor U6 lub H1 umożliwiło długotrwałe i indukowalne wyciszanie genów^2,3. Jej zastosowanie w połączeniu z genetycznie zmodyfikowanymi wektorami wirusowymi, takimi jak lentiwirusy, ułatwia wysoką wydajność dostarczania shRNA i/lub jego integrację z DNA genomowym w celu stabilnej ekspresji shRNA.

Opisujemy szczegółową procedurę z wykorzystaniem technologii RNAi opartej na wektorach DNA w celu określenia funkcji genów, obejmującą konstrukcję wektorów lentiwirusowych wykazujących ekspresję shRNA, produkcję lentiwirusów i infekcję komórek, a także badania funkcjonalne z wykorzystaniem modelu ksenoprzeszczepu mysiego.

W literaturze opisano różne strategie generowania konstruktów shRNA. Protokół opisany w niniejszej pracy, wykorzystujący amplifikację PCR oraz ligację trzech fragmentów, może być użyty do bezpośredniego i wydajnego generowania konstruktów lentiwirusowych zawierających shRNA, bez pozostawiania dodatkowych nukleotydów sąsiadujących z sekwencją kodującą shRNA. Ponieważ kasety ekspresyjne shRNA utworzone za pomocą tej strategii mogą być wycinane enzymami restrykcyjnymi, mogą być one łatwo przenoszone do innych wektorów z różnymi markerami fluorescencyjnymi lub antybiotykowymi. Większość komercyjnych odczynników do transfekcji może być stosowana w produkcji lentiwirusów. W niniejszym raporcie przedstawiamy jednak ekonomiczną metodę z wykorzystaniem wytrącania fosforanu wapnia, która pozwala osiągnąć ponad 90% wydajności transfekcji w komórkach 293T. W porównaniu z wektorami do konstytutywnej ekspresji shRNA, indukowalny system shRNA jest szczególnie odpowiedni do wyciszania genów niezbędnych dla proliferacji komórek. Demonstrujemy wyciszenie genu Yin Yang 1 (YY1), potencjalnego onkogenu w raku piersi^4,5, za pomocą indukowalnego systemu shRNA Tet-On oraz jego wpływ na tworzenie nowotworów. Badania z wykorzystaniem lentiwirusów wymagają przeglądu i zatwierdzenia protokołu bezpieczeństwa biologicznego przez Komitet Bezpieczeństwa Biologicznego w instytucji badawczej. Badania z wykorzystaniem modeli zwierzęcych wymagają przeglądu i zatwierdzenia protokołu zwierzęcego przez Komitet ds. Opieki i Wykorzystania Zwierząt (ACUC) w instytucji badawczej.

Protokół

1. Generowanie konstruktów shRNA

1. Zidentyfikuj sekwencję docelową dla siRNA (20-23 nukleotydów) w oparciu o wcześniej opublikowane kryteria⁶ lub skorzystaj z algorytmu dostępnego w sieci, takiego jak „siRNA Target Finder” od Ambion i GenScript.
2. Zsyntetyzuj oligonukleotydy zgodnie z projektem przedstawionym na Rysunku 1 oraz sekwencjami przykładowymi w Tabeli 1. Przeprowadź amplifikację PCR przy użyciu oligonukleotydów P1 i P2 (30 cykli: denaturacja w 94 °C przez 30 s, przyłączanie w 60 °C przez 30 s i elongacja w 72 °C przez 30 s), wykorzystując jako matrycę plazmid zawierający promotor U6 lub H1. Oczyść produkt PCR za pomocą kolumny do oczyszczania produktów PCR. Poddaj go trawieniu enzymami BamHI i HindIII, a następnie oczyść trawione DNA za pomocą kolumny do oczyszczania produktów PCR. Przeprowadź hybrydyzację oligonukleotydów P3 i P4 (po 2,5 pmol/μl każdego w 100 μl 50 mM Tris•HCl, pH 8.0) poprzez gotowanie przez 5 min, a następnie powolne chłodzenie do temperatury otoczenia. Poddaj trawieniu enzymami BamHI i EcoRI wektor lentiwirusowy, taki jak opisany na Rysunku 2A, i przeprowadź oczyszczanie żelowe.
3. Przeprowadź ligację trzech fragmentów: wektora trawionego BamHI/EcoRI, fragmentu PCR trawionego BamHI/HindIII oraz jednej pary zhybrydyzowanych oligonukleotydów (tworzących miejsca HindIII i EcoRI na obu końcach) w stosunku molowym 1:10:10 (Rysunek 1).
4. Przeprowadź transformację wysoce wydajnych kompetentnych komórek E. coli DH5α produktem ligacji. Przesiej kolonie przy użyciu oligonukleotydów P5 (w wektorze) i P6 (w promotorze H1 lub U6).⁷
5. Wyizoluj plazmidowe DNA z pozytywnych kolonii za pomocą zestawu komercyjnego i potwierdź obecność insertu poprzez trawienie BamHI/EcoRI oraz elektroforezę DNA na żelu agarozowym. Przeprowadź sekwencjonowanie regionu zawierającego promotor i shRNA przy użyciu oligonukleotydu P5.
6. Użyj zestawów do preparacji Midi- lub Maxi-plazmidów (preferowane zestawy wolne od endotoksyn), aby przygotować DNA lentiwirusa zawierające kasetę ekspresyjną shRNA. Określ stężenie DNA, mierząc absorbancję przy 260 nm. Sprawdź czystość DNA, analizując stosunek 260 nm/280 nm i upewnij się, że mieści się on w zakresie od 1,8 do 2,0. Sprawdź integralność plazmidu lentiwirusowego za pomocą elektroforezy na żelu agarozowym. DNA do transfekcji powinno być w formie superzwiniętej.

2. Transfekcja lentiwirusowa

Środki ostrożności: Wektory lentiwirusowe pochodzą z genomu ludzkiego wirusa niedoboru odporności 1 (HIV-1) i są niezdolne do replikacji. Są one szeroko stosowane w dostarczaniu genów ze względu na zdolność do infekowania zarówno komórek dzielących się, jak i niedzielących się. Niemniej jednak, w badaniach z wykorzystaniem lentiwirusów istnieją dwa główne ryzyka. (1) Potencjał do generowania zdolnych do replikacji lentiwirusów. Ryzyko to można znacznie zredukować, stosując lentiwirusowy system trzeciej generacji. (2) Potencjał do onkogenezy. Ryzyko to może wzrosnąć, jeśli przenoszone inseraty są onkogenne lub hamują białka supresorowe nowotworów. Działalność badawcza związana z lentiwirusami opartymi na HIV powinna być zgodna z wytycznymi „Biosafety Considerations for Research with Lentiviral Vectors” NIH (http://oba.od.nih.gov/rdna_rac/rac_guidance_lentivirus.html) i wymaga zatwierdzenia przez Komitet ds. Bezpieczeństwa Biologicznego instytucji badacza. Zasadniczo w warunkach laboratoryjnych, w przypadku stosowania wektorów lentiwirusowych, wymagany jest podwyższony poziom bezpieczeństwa biologicznego 2 (BSL-2).

1. Wysiać 4 × 10⁶ komórek HEK 293T w pełnej pożywce DMEM (DMEM z dodatkiem 10% płodowej surowicy bydlęcej (FBS), 2 mM L-glutaminy, 100 jednostek/ml penicyliny i 100 μg/ml streptomycyny) do szalek o średnicy 10 cm i inkubować przez noc w temperaturze 37 °C w inkubatorze z 5% CO₂. Wymienić pożywkę na 5 ml uprzednio ogrzanej pożywki Opti-MEM I Reduced Serum Media (Invitrogen).
2. Przygotować Roztwór A: 10 μg wektora lentiwirusowego zawierającego shRNA, po 5 μg każdego z plazmidów pakujących trzeciej generacji lentiwirusa (przygotowanych z wysoką czystością; trzy plazmidy pakujące obejmują VSV-G: dla białka otoczki, pRSV-Rev: dla rev oraz pMDLg/pRRE: dla gag/pol, które są niezbędne do pakowania lentiwirusów), 36 μl 2M CaCl₂ oraz 300 μl sterylnej wody.
3. Przygotować Roztwór B: 300 μl 2× buforu Hepes Buffered Saline (281 mM NaCl, 100 mM HEPES, 1,5 mM Na₂HPO₄, pH skorygowane do 7,12 za pomocą 0,5 N NaOH i sterylizowane filtrem 0,22 μm).
4. Powoli dodawać Roztwór A do Roztworu B kroplami, jednocześnie napowietrzając Roztwór B za pomocą pipety. Pozostawić probówkę w temperaturze pokojowej na 30 min.
5. Powoli dodawać kroplami zmieszane roztwory A/B do szalki z hodowlą komórek HEK 293T przygotowanej w kroku 2.1 i inkubować w temperaturze 37 °C w inkubatorze z 5% CO₂ przez 4-6 h.
6. Wymienić pożywkę na 7 ml pełnej pożywki DMEM. Po 24 h dodać dodatkowe 5 ml pełnej pożywki DMEM. Zebrać pożywkę zawierającą lentiwirusy po kolejnych 24 h hodowli.
7. Wirować pożywkę przy 1 500 rpm w temperaturze pokojowej przez 10 min. Przefiltrować nadsącz przez filtr 0,45 μm, a następnie poddać pożywkę przepuszczoną przez filtr zawierającą lentiwirusy ultrawirowaniu przy 25 000 rpm (równoważne 125 000 ×g z użyciem rotora SW28 z ruchomymi koszykami, ultrawirowarka Beckman XL-90) w temperaturze 4 °C przez 90 min. Odlać nadsącz do pojemnika z 5% wybielaczem (stężenie końcowe).
8. Resuspendować pelet lentiwirusowy w 0,5-1,0 ml zimnego PBS i rozdzielić lentiwirusy na aliquoty po 50-100 μl na probówkę. Przechowywać w temperaturze -80 °C.
9. Miano lentiwirusa można określić za pomocą zestawów komercyjnych (takich jak QuickTiter Lentivirus Quantitation Kit firmy Cell Biolabs, Inc.), protokołu PCR w czasie rzeczywistym⁸ lub poprzez oznaczenie współwyrażanego markera fluorescencyjnego za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej lub cytometrii przepływowej. Zazwyczaj jedna szalka hodowlana o średnicy 10 cm pozwala uzyskać około 0,5-1,0×10⁸ jednostek zakaźnych (IU).

3. Infekcja i charakterystyka zainfekowanych komórek

1. Wysiać komórki przeznaczone do infekcji w 2 ml pełnej pożywki w płytce 6-dołkowej, aby uzyskać 30-40% konfluencji (około 5-8 × 10⁵ komórek, w zależności od rozmiaru komórek). Inkubować komórki przez noc w temperaturze 37 °C w inkubatorze z 5% CO₂.
2. Wymienić pożywkę na 1 ml świeżej pożywki zawierającej 8 μg/ml polybrene (Sigma, Cat# H9268) lub 5 μg/ml protaminy (Sigma, Cat# P4020).
3. Określić odpowiedni zakres wielokrotności infekcji (MOI)⁹ dla danej linii komórkowej, używając lentiwirusa z markerem fluorescencyjnym. Obliczyć lub empirycznie wyznaczyć ilość lentiwirusa niezbędną do zainfekowania linii komórkowej. Powoli nanieść lentiwirusa do dołka i delikatnie wstrząsać przez 10 sec.
4. Inkubować płytkę w temperaturze 37 °C w inkubatorze z 5% CO₂ przez 6 h, a następnie wymienić pożywkę na zwykłą pełną pożywkę.
5. Przynajmniej dwa dni po infekcji sprawdzić komórki za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej w celu wykrycia lentiwirusów wykazujących markery fluorescencyjne i/lub dodać do pożywki odpowiedni antybiotyk w przypadku wektorów lentiwirusowych wykazujących geny oporności na antybiotyki. Dla wektora indukowalnego, takiego jak system Tet-On (Rycina 2), hodować komórki w pożywce przygotowanej z FBS wolnej od tetracykliny. Przesiać komórki 2-3 dni po infekcji. Odobrać część komórek w celu przetestowania indukowanego wyciszenia genu, hodując je w pożywce z dodatkiem oraz bez dodatku 1,5 μg/ml doksycyliny (Dox) przez ≥2 dni.
6. Sprawdzić wyciszenie genu za pomocą Western blot, Real-Time PCR lub immunostaining ≥2 dni po infekcji, 2 dni po selekcji antybiotykowej lub (w przypadku indukowalnego systemu Tet-On) ≥ 2 dni po dodaniu Dox.
7. Zastosować różne podejścia (takie jak testy proliferacji komórek, badania hodowli na miękkim agarze, testy migracji, testy inwazji oraz badania tworzenia guzów), aby określić wpływ wyciszenia genu docelowego na złośliwość komórek.

4. Badanie w modelu mysim ksenoprzeszczepu

1. Oczyścić wszystkie powierzchnie przeznaczone do znieczulania i iniekcji myszy 70% etanolem, aby zapobiec infekcjom zwierząt. Znieczulić myszy nago beztymusowe (NCI-Frederick) przy użyciu 2% izofluranu wymieszanego z tlenem w komorze indukcyjnej 10 min przed inokulacją komórek. Utrzymać znieczulenie, podając 1% izofluran wymieszany z tlenem poprzez stożek nosowy. Wykonać ten krok w pomieszczeniu z doskonałą wentylacją i podłączyć filtry pochłaniające izofluran do komory indukcyjnej.
2. Namnożyć komórki niosące shRNA. W przypadku indukowalnych wektorów Tet-On stosować pożywkę wolną od tetracykliny. Trypsynizować komórki i resuspendować je w pełnej pożywce zawierającej 50% Matrigel. Umieścić myszy nago na podkładce grzewczej (30 °C) i wstrzyknąć 200 μl komórek (1-10 × 10⁶, zależnie od złośliwości komórek) w 1-2 miejscach iniekcji na mysz. Do iniekcji podskórnych stosować strzykawki z igłami o rozmiarze 25.5 G, a do iniekcji ortotopowych igły o rozmiarze 28-30 G.
3. W przypadku konstytutywnych wektorów shRNA zastosować 2 grupy myszy: jedną z iniekcją komórek wykazujących ekspresję shRNA przeciwko genowi docelowemu oraz drugą z shRNA typu scrambled. W przypadku indukowalnych wektorów shRNA Tet-On zastosować 4 grupy myszy z iniekcją komórek niosących shRNA przeciwko genowi docelowemu oraz shRNA typu scrambled, którym podawano zwykłą wodę lub wodę z Dox (1.5 mg/ml) (2 shRNA × 2 rodzaje traktowania = 4 grupy). Wodę z Dox wymieniać dwa razy w tygodniu.
4. Monitorować długość i szerokość guzów co tydzień lub co dwa tygodnie za pomocą cyfrowego suwmiarki i obliczać objętość guza (V) według wzoru V = 1/2(długość × szerokość²)¹⁰. Upewnić się, że objętość guza nie przekracza wytycznych instytucjonalnej komisji ACUC (np. 10% masy ciała). Każdą mysz wykazującą oznaki rozległego owrzodzenia lub martwicy, ewidentnej infekcji, niekontrolowanego krwawienia lub choroby w stadium końcowym uśmiercić zgodnie z protokołem zatwierdzonym przez ACUC.
5. Wzrost i przerzuty guza można monitorować w przypadku inokulowanych komórek nowotworowych wykazujących ekspresję markera bioluminescencyjnego¹¹, takiego jak lucyferaza świetlikowa. Oczyścić wszystkie powierzchnie do znieczulania i obrazowania myszy 70% etanolem, aby zapobiec infekcjom. Znieczulić myszy zgodnie z opisem w kroku 4.1. Wstrzyknąć lucyferynę (150 mg/kg) drogą dosytnynową. Umieścić myszy w zdezynfekowanej komorze obrazowania komercyjnego systemu obrazowania, np. systemu IVIS (Caliper Life Sciences, Inc.). Włączyć zawór znieczulający, aby utrzymać znieczulenie 1% izofluranem wymieszanym z tlenem. Wykonać ten krok w pomieszczeniu z doskonałą wentylacją.
6. Wykonać pierwsze zdjęcie przy czasie ekspozycji 5 min i sprawdzić intensywność sygnału. Dostosować czas ekspozycji, aby uzyskać obrazy z optymalnym stosunkiem sygnału do tła. Czas obrazowania wyznaczyć empirycznie; zazwyczaj wynosi on od 1 do 5 min dla guzów podskórnych.
7. Uśmiercić myszy zgodnie z protokołem zatwierdzonym przez ACUC, gdy rozmiar guza osiągnie około 1 000 mm³ lub zgodnie z wytycznymi ACUC. Wyciąć guzy ksenoprzeszczepione, zważyć je i sfotografować. Przetworzyć próbki guza do różnych badań, takich jak analizy patomorfologiczne w celu określenia morfologii komórek nowotworowych oraz badania Western blot i Real-Time PCR w celu analizy ekspresji genów.

5. Reprezentatywne wyniki

Niniejszy protokół został zastosowany w celu zbadania wpływu wyciszenia YY1 na tworzenie guzów ksenoprzeszczepowych z komórek MDA-MB-231 (komórki gruczolakoraka piersi człowieka; Caliper Life Sciences) wykazujących ekspresję lucyferazy Firefly u myszy nago atymicznych. Sekwencja docelowa shRNA dla ludzkiego YY1 to „GGG AGC AGA AGC AGG TGC AGA T”. Na potrzeby kontroli (cont) shRNA stworzono również sekwencję wymieszaną (scrambled) „GGG ACT ACT CTA TTA CGT CAT T”, która nie wykazywała istotnego podobieństwa do żadnego znanego transkryptu. Oligonukleotydy wykorzystane do wytworzenia indukowalnych konstrukcji shRNA Tet-On, na przykładzie YY1, przedstawiono w Tabeli 1. W rezultacie skonstruowano dwa wektory lentiwirusowe: pLu-Puro-Indu-YY1 shRNA oraz pLu-Puro-Indu-cont shRNA, które posłużyły do produkcji lentiwirusów. Lentiwirusy te wykorzystano do indywidualnego zakażenia dwóch klonów komórek MDA-MB-231 (klony 1 i 3) wykazujących ekspresję zarówno regulatora tetracykliny (tetR), jak i lucyferazy Firefly. Poliklonalne populacje komórek uzyskano po selekcji puromycyną. Rysunek 3A przedstawia indukowane doksycykliną (Dox) wyciszenie YY1 w tych komórkach MDA-MB-231 zakażonych lentiwirusem pLu-Puro-Indu-YY1 shRNA. Następnie wykorzystano poliklonalne komórki klonu 3, zakażone indywidualnie indukowalnymi lentiwirusami YY1 shRNA i cont shRNA, i zaobserwowano, że deplecja YY1 zmniejszyła inwazyjność komórek MDA-MB-231 (Rysunek 3B). Analizy Western blot potwierdziły indukowane Dox wyciszenie YY1 w komórkach MDA-MB-231 z indu-YY1 shRNA, podczas gdy w komórkach zawierających indu-cont shRNA efekt ten nie wystąpił (Rysunek 3C). Następnie komórki te wykorzystano w badaniu na modelu ksenoprzeszczepów mysich. W porównaniu z grupami kontrolnymi, u myszy z wszczepionymi komórkami MDA-MB-231 z indu-YY1 shRNA i podawaną wodą z dodatkiem Dox zaobserwowano zmniejszone tworzenie guzów, co wykazano za pomocą bioluminescencji (Rysunek 4A) oraz określono na podstawie masy guzów (Rysunek 4B). Wyciszenie YY1 w tych guzach ksenoprzeszczepowych potwierdzono badaniami Western blot przedstawionymi na Rysunku 4C.

Rycina 1. Schemat generowania konstruktu shRNA oraz transkrypcji shRNA. Przedstawiono primery P1 do P6 (przykładowe sekwencje znajdują się w Tabeli 1). Pol III: polimeraza RNA III. (d): koniec trawiony. Rysunek nie jest w skali. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększony obraz.

Rycina 2. Schematy (A) wektora lentiwirusowego oraz (B) mechanizmu indukowalnego promotora H1 Tet-On stosowanego do wyciszania genów. Wektor lentiwirusowy został zrekonstruowany na podstawie pLL3.7¹⁴ . H1-Pr: promotor H1; Ubc-Pr: ludzki promotor ubikwityny C; Puro: puromycyna; TRE: element odpowiedzi na tetracyklinę; Dox: doksycylina. TetR: regulator tetracykliny. 5'LTR, 3'SIN-LTR oraz WRE to niezbędne elementy wektora lentiwirusowego¹⁴ .

Rysunek 3. Wywołane doksycykliną wyciszanie YY1 i jego wpływ na inwazyjność komórek MDA-MB-231. A. Poziomy YY1 w dwóch poliklonalnych populacjach komórek pochodzących z klonów 1 i 3 wykazujących ekspresję TetR, zainfekowanych lentiwirusem pLu-Puro-Indu-YY1 shRNA i hodowanych bez oraz w obecności Dox. B. Test w komorze Boydena dla komórek MDA-MB-231 z indukowalnymi shRNA. (* P < 0,05 w porównaniu z pozostałymi trzema grupami). C. Reprezentatywne analizy Western blot ekspresji YY1 w tych czterech populacjach komórek.

Rysunek 4. Wpływ indukowanego wyciszenia YY1 na tworzenie ksenoprzeszczepów nowotworowych przez komórki MDA-MB-231. A. Schemat implantacji komórek (po lewej) oraz reprezentatywne obrazy bioluminescencyjne zarejestrowane przez system obrazowania IVIS w 4. tygodniu (po prawej) po inokulacji komórek. B. Masa ksenoprzeszczepów nowotworowych w 4. tygodniu. * P ≤ 0.05. C. Analiza Western blot ekspresji YY1 i β-aktyny w ksenoprzeszczepach komórek MDA-MB-231 z indu-YY1 shRNA w obecności i przy braku Dox. Etykiety na górze to nazwy poszczególnych myszy.

Oligonukleotyd	Sekwencja (5' - 3')	Zastosowanie i lokalizacja
P1 (Tet-On H1)	cagt GGATCC CGA ACG CTG ACG TCA TCA ACC C	PCR; na końcu 5' promotora H1
P1 (U6)	cagt GGATCC GAC GCC GCC ATC TCT AGG	PCR; na końcu 5' promotora U6
P2 (dla YY1 z Tet-On H1)	cagc AAGCTT GAA atc tgc acc tgc ttc tgc tcc c GGG ATC TCT ATC ACT GAT AGG GAA C	PCR; na końcu 3' indukowalnego promotora H1 Tet-On
P2 (dla YY1 z U6)	cagc AAGCTT GAA atc tgc acc tgc ttc tgc tcc c aaa caa ggc ttt tct cca agg gat a	PCR; na końcu 3' promotora U6
P3 (dla YY1)	agc tt atc tgc acc tgc ttc tgc tcc c ttttt g	Do hybrydyzacji z P4
P4 (dla YY1)	aattc aaaaa ggg agc aga agc agg tgc aga t a	Do hybrydyzacji z P3
P5 (dla pLL3.7)	ggg tac agt gca ggg gaa aga ata g	Do przesiewania metodą PCR, stosowany z P6
P6 (dla Tet-On H1)	GAT TTC CCA GAA CAC ATA GCG AC	Do przesiewania metodą PCR, stosowany z P5
P6 (dla U6)	AGG GTG AGT TTC CTT TTG TGC TG	Do przesiewania metodą PCR, stosowany z P5

Tabela 1. Syntetyzowane oligonukleotydy użyte do generowania konstruktów shRNA. Podano sekwencje P1 i P6 dla mysiego promotora U6 oraz indukowalnego systemem Tet-On ludzkiego promotora H1. Jako przykład zastosowano ludzkie YY1 z sekwencją docelową shRNA GGG AGC AGA AGC AGG TGC AGA T. Sekwencje specyficzne dla YY1 zostały wyróżnione. Zaprojektowano dwie sekwencje P2 dla YY1, odpowiednio dla obu promotorów. Konstytutywne shRNA U6/YY1 zostało opisane wcześniej¹⁵, natomiast w niniejszym protokole zastosowano Tet-On H1/YY1. P5 jest specyficzne dla wektora i pokazano sekwencję dla pLL3.7¹⁴. Sekwencje enzymów restrykcyjnych są podkreślone, a sekwencje służące do hybrydyzacji z promotorami podczas amplifikacji PCR są zapisane kursywą.

Dyskusja

Niniejszy protokół opisuje metodę wyciszania genu za pomocą shRNA oraz wizualizacji jego efektu biologicznego przy użyciu obrazowania bioluminescencyjnego wzrostu komórek nowotworowych in vivo. Miejsce docelowe shRNA nie powinno zawierać żadnego z trzech miejsc restrykcyjnych (BamHI, HindIII oraz EcoRI) wykorzystywanych do subklonowania. W rzadkich przypadkach, gdy którekolwiek z tych miejsc jest obecne, do stworzenia konstruktu można użyć dodatkowego enzymu restrykcyjnego w celu jego zastąpienia.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Oprócz powszechnie stosowanego wyposażenia laboratoryjnego do analiz RNA i białek oraz hodowli komórkowych, do wykonania niniejszego protokołu wymagane są następujące materiały i odczynniki.
dygestorium z laminarnym przepływem powietrza odpowiednie dla poziomu bezpieczeństwa biologicznego 2
Termocykler do PCR
Ultracentryfuga
Komora indukcji znieczulenia z systemem odsysania izofluranu
Cyfrowy suwmiarka noniuszowa
system obrazowania IVIS
Wysoce kompetentne szczepy E. coli DH5a
EcoRI, BamHI, &enzymy restrykcyjne amp; HindIII
T4 DNA ligaza
Plazmidy pakujące trzeciej generacji lentiwirusowe VSV-G, pRSV-Rev i pMDLg/pRRE
Lista materiałów