Interferencja RNA oparta na wektorach DNA w celu zbadania funkcji genów w raku

Summary

Interferencja RNA (RNAi) ma wiele zalet w porównaniu z nokautem genów i jest szeroko stosowana jako narzędzie w badaniach funkcjonalnych genów. Wynalezienie technologii RNAi opartej na wektorach DNA umożliwiło długoterminowe i indukowalne knockdown genów, a także zwiększyło wykonalność wyciszania genów in vivo.

Abstract

Interferencja RNA (RNAi) hamuje ekspresję genów poprzez specyficzną degradację docelowych mRNA. Od czasu odkrycia dwuniciowego małego interferencyjnego RNA (siRNA) w wyciszaniu genów¹, RNAi stał się potężnym narzędziem badawczym w badaniach funkcji genów. W porównaniu z delecją genetyczną, wyciszanie genów za pośrednictwem RNAi ma wiele zalet, takich jak łatwość, z jaką jest przeprowadzane, i jego przydatność dla większości linii komórkowych. Wiele badań wykazało zastosowanie technologii RNAi w badaniach nad rakiem. W szczególności rozwój technologii opartej na wektorze DNA do produkcji małego RNA spinki do włosów (shRNA) napędzanego przez promotor U6 lub H1 umożliwił długoterminowe i indukowalne wyciszanie genów^2,3. Jego zastosowanie w połączeniu z genetycznie zmodyfikowanymi wektorami wirusowymi, takimi jak lentiwirus, ułatwia wysoką wydajność dostarczania shRNA i/lub integracji z genomowym DNA w celu stabilnej ekspresji shRNA.

Opisujemy szczegółową procedurę wykorzystującą technologię RNAi opartą na wektorach DNA do określenia funkcji genu, w tym budowę wektorów lentiwirusowych wyrażających shRNA, produkcję lentiwirusa i infekcję komórkową, oraz badania funkcjonalne z wykorzystaniem mysiego modelu ksenoprzeszczepu.

Różne strategie zostały zgłoszone w generowaniu konstrukcji shRNA. Opisany tutaj protokół wykorzystujący amplifikację PCR i ligację 3 fragmentów może być wykorzystany do bezpośredniego i wydajnego generowania konstruktów lentiwirusowych zawierających shRNA bez pozostawiania dodatkowych nukleotydów w sąsiedztwie sekwencji kodującej shRNA. Ponieważ kasety z ekspresją shRNA utworzone w wyniku tej strategii mogą być wycinane przez enzymy restrykcyjne, można je łatwo przenieść do innych wektorów z różnymi markerami fluorescencyjnymi lub antybiotykowymi. Większość dostępnych na rynku odczynników do transfekcji może być stosowana w produkcji lentiwirusa. Jednak w tym raporcie przedstawiamy ekonomiczną metodę wykorzystującą wytrącanie fosforanu wapnia, która może osiągnąć ponad 90% wydajność transfekcji w komórkach 293T. W porównaniu z konstytutywnymi wektorami ekspresji shRNA, indukowalny system shRNA jest szczególnie odpowiedni do niszczenia genu niezbędnego do proliferacji komórek. Pokazujemy wyciszanie genu Yin Yang 1 (YY1), potencjalnego onkogenu w raku piersi^4,5, przez indukowalny system shRNA Tet-On i jego wpływ na tworzenie guza. Badania z użyciem lentiwirusa wymagają przeglądu i zatwierdzenia protokołu bezpieczeństwa biologicznego przez Komitet ds. Bezpieczeństwa Biologicznego instytucji badawczej. Badania z wykorzystaniem modeli zwierzęcych wymagają przeglądu i zatwierdzenia protokołu na zwierzętach przez Komitet ds. Opieki nad Zwierzętami i Wykorzystania (ACUC) instytucji badawczej.

Protocol

1. Generowanie konstruktów shRNA

1. Zidentyfikuj sekwencję docelową siRNA (20-23 nukleotydy) na podstawie wcześniej opublikowanych kryteriów⁶ lub skorzystaj z internetowego serwera algorytmów, takiego jak "siRNA Target Finder" firmy Ambion i GenScript.
2. Zsyntetyzuj oligonukleotydy w oparciu o projekt z rysunku 1 i przykładowe sekwencje w tabeli 1. Przeprowadzić amplifikację PCR przy użyciu oligonukleotydów P1 i P2 (30 cykli denaturacji w temperaturze 94 °C przez 30 sekund, wyżarzanie w temperaturze 60 °C przez 30 sekund i wydłużanie w temperaturze 72 °C przez 30 sekund) oraz plazmidu zawierającego promotor U6 lub H1 jako matrycę. Oczyść produkt PCR za pomocą kolumny oczyszczającej PCR. Trawić go za pomocą BamHI i HindIII i oczyszczać strawione DNA za pomocą kolumny oczyszczającej PCR. Wyżarzać oligonukleotydy P3 i P4 (2,5 pmol/μl każdego w 100 μl 50 mM Tris•HCl, pH 8,0) przez gotowanie przez 5 minut i powoli schładzać do temperatury otoczenia. Strawić wektor lentiwirusowy, taki jak ten opisany na rysunku 2A, przez BamHI i EcoRI, i przeprowadzić oczyszczanie żelem.
3. Przeprowadzić ligację 3-fragmentową z wektorem strawionym przez BamHI / EcoRI, fragmentem PCR strawionym przez BamHI / HindIII i jedną parą wyżarzonych oligonukleotydów (tworzących miejsca HindIII i EcoRI na dwóch końcach) w stosunku molowym 1:10:10 (Figura 1).
4. Transformacja wysoce wydajnych, kompetentnych komórek DH5α E. coli za pomocą zligowanego produktu. Przesiewać kolonie za pomocą oligonukleotydów P5 (w wektorze) i P6 (w promotorze H1 lub U6). ⁷
5. Przygotować plazmidowe DNA z dodatnich kolonii za pomocą komercyjnego zestawu i potwierdzić obecność insertu przez trawienie BamHI/EcoRI i elektroforezę agarozy DNA. Zsekwencjonuj region zawierający promotor i shRNA za pomocą oligonukleotydu P5.
6. Użyj zestawów do przygotowania plazmidowego DNA Midi lub Maxi (preferowane jest wolne od endotoksyn), aby przygotować DNA lentiwirusa przenoszące kasetę ekspresji shRNA. Oznaczyć stężenie DNA, mierząc absorpcję przy długości fali 260 nm. Sprawdź czystość DNA przy użyciu stosunku 260 nm/280 nm i upewnij się, że mieści się w zakresie od 1,8 do 2,0. Sprawdź integralność plazmidu lentiwirusa za pomocą elektroforezy w żelu agarozowym. DNA do transfekcji powinno być super zwinięte.

2. Transfekcja lentiwirusa

Środki ostrożności: Wektory lentiwirusowe pochodzą z genomu ludzkiego wirusa niedoboru odporności-1 (HIV-1) i są niekompetentne w replikacji. Są one szeroko stosowane w dostarczaniu genów ze względu na zdolność do infekowania zarówno komórek dzielących się, jak i niedzielących się. W badaniach z użyciem lentiwirusa istnieją jednak dwa główne zagrożenia. (1) Potencjał generowania lentiwirusa zdolnego do replikacji. Ryzyko to można znacznie zmniejszyć, jeśli stosuje się system lentiwirusowy trzeciej generacji. (2) Potencjał onkogenezy. Ryzyko to może się nasilić, jeśli przenoszone wstawki są onkogenne lub represory nowotworowe. Działalność badawcza związana z lentiwirusem opartym na HIV powinna być zgodna z "Rozważaniami dotyczącymi bezpieczeństwa biologicznego w badaniach z wektorami lentiwirusowymi" NIH (http://oba.od.nih.gov/rdna_rac/rac_guidance_lentivirus.html) i wymagać zgody Komitetu ds. Bezpieczeństwa Biologicznego instytucji badawczej. Ogólnie rzecz biorąc, w warunkach laboratoryjnych wymagane jest ograniczenie rozprzestrzeniania się wirusa o zwiększonym poziomie bezpieczeństwa biologicznego 2 (BSL-2), jeśli stosowane są wektory lentiwirusowe.

1. Płytka 4 × 10⁶ komórek HEK 293T z kompletnym podłożem DMEM (DMEM dostarczane z 10% płodową surowicą bydlęcą (FBS), 2 mM L-glutaminy, 100 jednostek/ml penicyliny, 100 μg/ml streptomycyny) w 10 cm szalkach i hodowla przez noc w temperaturze 37 °C w inkubatorze o stężeniu 5% CO_{2 .} Zastąp pożywkę 5 ml wstępnie podgrzanego podłoża Opti-MEM I o zredukowanej surowicy (Invitrogen).
2. Przygotować roztwór A: 10 μg wektora lentiwirusowego zawierającego shRNA, po 5 μg każdego z plazmidów pakujących lentiwirusa trzeciej generacji (przygotowanych o wysokiej czystości; trzy plazmidy pakujące obejmują VSV-G: dla białka otoczkowego, pRSV-Rev: dla rev i pMDLg/pRRE: dla gag/pol, które są niezbędne do pakowania lentiwirusa), 36 μl 2M CaCl₂, i 300 μl sterylnej wody.
3. Przygotować roztwór B: 300 μl 2× buforowanej soli fizjologicznej Hepes (281 mM NaCl, 100 mM HEPES, 1,5 mM Na₂HPO₄, pH dostosowane do 7,12 przez 0,5 N NaOH i wysterylizowane filtrem 0,22 μm).
4. Powoli wrzucaj roztwór A do roztworu B, jednocześnie przepuszczając powietrze przez roztwór B za pomocą pipety. Pozostaw probówkę w temperaturze otoczenia na 30 minut.
5. Powoli wrzucać zmieszane roztwory A/B do naczynia do hodowli komórkowej HEK 293T przygotowanego w kroku 2.1 i inkubować w temperaturze 37 °C w inkubatorze z 5% CO₂ przez 4-6 godzin.
6. Zastąp pożywkę 7 ml kompletnej pożywki DMEM. Po 24 godzinach dodać dodatkowe 5 ml kompletnej pożywki DMEM. Zebrać pożywkę zawierającą lentiwirusa po kolejnych 24 godzinach hodowli.
7. Wirować pożywkę z prędkością 1 500 obr./min, w temperaturze otoczenia przez 10 min. Przefiltrować supernatant za pomocą filtra 0,45 μm i odwirować przepływowe podłoże zawierające lentiwirusa przez ultrawirowanie z prędkością 25 000 obr./min (równą 125 000 ×g za pomocą wahliwego wirnika kubełkowego SW28, ultrawirówka Beckman XL-90), 4 °C przez 90 min. Zdekantować supernatant do pojemnika z 5% wybielaczem (stężenie końcowe).
8. Zawiesić osad lentiwirusa w 0,5-1,0 ml zimnego PBS i przygotować porcje lentiwirusa w ilości 50-100 μl na probówkę. Przechowywać je w temperaturze -80 °C.
9. Miano lentiwirusa można określić za pomocą komercyjnych zestawów (takich jak QuickTiter Lentivirus Quantitation Kit firmy Cell Biolabs, Inc.), za pomocą protokołu PCR w czasie rzeczywistym⁸ lub przez oznaczenie współwyrażonego markera fluorescencyjnego za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej lub cytometrii przepływowej. Zazwyczaj jedno 10-centymetrowe naczynie hodowlane może wyprodukować około 0,5-1,0×10⁸ jednostek zakaźnych (IU).

3. Zakażenie i charakterystyka zainfekowanych komórek

1. Wysiewaj komórki, które mają być zakażone, w 2 ml kompletnej pożywki na 6-dołkowej płytce z 30-40% zbiegiem (około 5-8 × 10⁵ komórek, w zależności od wielkości komórek). Hodować komórki przez noc w temperaturze 37 °C w inkubatorze o stężeniu 5% CO_{2 .}
2. Zastąp pożywkę 1 ml świeżej pożywki zawierającej 8 μg/ml polibrenu (Sigma, Cat# H9268) lub 5 μg/ml protaminy (Sigma, Cat# P4020).
3. Określ odpowiedni zakres wielokrotności infekcji (MOI)⁹ dla określonej linii komórkowej za pomocą lentiwirusa z markerem fluorescencyjnym. Oblicz lub empirycznie określ ilość lentiwirusa, która ma być użyta do zakażenia linii komórkowej. Powoli wrzuć lentiwirusa do płytki i delikatnie potrząsaj nią przez 10 sekund.
4. Inkubować płytkę w temperaturze 37 °C w inkubatorze z 5% stężeniem_{CO2 przez} 6 godzin, a następnie zastąpić pożywkę zwykłą kompletną pożywką.
5. Co najmniej dwa dni po zakażeniu należy sprawdzić komórki za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej pod kątem markerów fluorescencyjnych wykazujących ekspresję lentiwirusa i/lub dodać odpowiedni antybiotyk do pożywki dla wektorów lentiwirusowych wyrażających geny oporności na antybiotyki. W przypadku wektora indukowalnego, takiego jak system Tet-On (ryc. 2), hoduj komórki w pożywce przygotowanej z FBS wolnym od tetracyklin. Podziel komórki 2-3 dni po infekcji. Pobrać część komórek, aby przetestować indukowalny knockdown genu, hodując je w pożywce dostarczanej z i bez 1,5 μg/ml doksycykliny (Dox) przez ≥2 dni.
6. Sprawdź knockdown genu za pomocą Western blot, Real-Time PCR lub barwienia immunologicznego ≥2 dni po zakażeniu, 2 dni po selekcji antybiotyków lub (w przypadku systemu indukowanego Tet-On) ≥ 2 dni po dodaniu Dox.
7. Wykorzystaj różne podejścia (takie jak testy proliferacji komórek, badania kultur miękkiego agaru, testy migracji, testy inwazji i badania tworzenia nowotworów) w celu określenia wpływu knockdownu genu docelowego na złośliwość komórek.

4. Badanie modelu myszy ksenoprzeszczepu

1. Oczyść wszystkie powierzchnie do znieczulenia i wstrzyknięcia myszy 70% etanolem, aby zapobiec infekcji myszy. Znieczulenie atymicznych nagich myszy (NCI-Frederick) za pomocą 2% izofluranu zmieszanego z tlenem w komorze indukcyjnej znieczulenia 10 minut przed inokulacją komórek. Utrzymuj znieczulenie za pomocą 1% izofluranu zmieszanego z tlenem przez stożek nosowy. Wykonaj ten krok w pomieszczeniu o doskonałej wentylacji i przymocuj filtry zmiatające izofluran do komory indukcyjnej.
2. Propaguj komórki przenoszące shRNA. Użyj pożywki wolnej od tetracyklin dla wektorów indukowanych Tet-On. Trypsynizuj komórki i ponownie zawieś je w kompletnym podłożu zawierającym 50% Matrigel. Umieść nagie myszy na poduszce grzewczej (30 °C) i wstrzyknij 200 μl komórek (1-10 ×^{10 6}, w zależności od złośliwości komórek) myszom z 1-2 miejscami wstrzyknięcia na mysz. Do iniekcji podskórnych należy używać strzykawek z igłami o rozmiarze 25,5 i igłami o rozmiarze 28-30 do iniekcji ortotopowych.
3. W przypadku konstytutywnych wektorów shRNA wykorzystaj 2 grupy myszy, którym wstrzyknięto komórki wyrażające docelowy gen shRNA i zaszyfrowany shRNA. W przypadku indukowalnych wektorów shRNA Tet-On należy wykorzystać 4 grupy myszy, którym wstrzyknięto komórki przenoszące docelowy gen shRNA i zaszyfrowane shRNA, zaopatrzone w normalną wodę i Dox (1,5 mg / ml) zawierającą wodę (2 shRNA × 2 zabiegi = 4 grupy). Wodę zawierającą Dox należy wymieniać dwa razy w tygodniu.
4. Monitoruj długość i szerokość guzów co tydzień lub co dwa tygodnie za pomocą suwmiarki z noniuszem cyfrowym i obliczaj objętość guza (V) według wzoru V = 1/2 (długość × szerokość²)¹⁰. Upewnij się, że objętość guza nie przekracza wytycznych instytucjonalnego ACUC (np. 10% masy ciała). Poddaj eutanazji każdą mysz przy użyciu protokołu zatwierdzonego przez instytucję ACUC, jeśli wykazuje jakiekolwiek oznaki rozległego owrzodzenia lub martwicy, oczywistej infekcji, niekontrolowanego krwawienia lub schyłkowej fazy choroby.
5. Wzrost guza i przerzuty można monitorować pod kątem inokulowanych komórek nowotworowych wyrażających bioluminescencyjny marker¹¹, takich jak lucyferaza świetlika. Oczyść wszystkie powierzchnie do znieczulenia i obrazowania myszy 70% etanolem, aby zapobiec infekcji myszy. Znieczulij myszy zgodnie z opisem w kroku 4.1. Wstrzyknąć lucyferynę (150 mg/kg) dootrzewnowo. Umieść myszy w zdezynfekowanej komorze obrazowania komercyjnego systemu obrazowania, takiego jak IVIS Imaging System (Caliper Life Sciences, Inc.). Włącz dźwignię znieczulenia, aby utrzymać znieczulenie za pomocą 1% izofluranu zmieszanego z tlenem. Przeprowadź ten krok w pomieszczeniu o doskonałej wentylacji.
6. Zrób pierwsze zdjęcie, naświetlając je na 5 minut i sprawdź intensywność sygnału. Dostosuj czas ekspozycji, aby uzyskać obrazy z optymalnym sygnałem w stosunku do tła. Określ empirycznie czas obrazowania, który zwykle wynosi 1-5 minut w przypadku guzów podskórnych.
7. Poddaj myszy eutanazji za pomocą protokołu zatwierdzonego przez instytucję ACUC, gdy rozmiary guza osiągną około 1000 mm³ lub zgodnie z wytycznymi ACUC. Wytnij guzy ksenoprzeszczepu, zważ je i zrób zdjęcia. Przetwarzaj próbki guza do różnych badań, takich jak analizy patologiczne w celu określenia morfologii komórek nowotworowych oraz badania Western blot i Real-Time PCR w celu zbadania ekspresji genów.

5. Reprezentatywne wyniki

Ten protokół został wykorzystany do zbadania wpływu knockdownu YY1 na tworzenie się guza ksenoprzeszczepu komórek MDA-MB-231 eksprymujących lucyferazę świetlików (ludzkie komórki gruczolakoraka piersi; Caliper Life Sciences) u atymicznych nagich myszy. Docelowa sekwencja shRNA ludzkiego YY1 to "GGG AGC AGA AGC AGG TGC AGA T". Stworzono również zaszyfrowaną sekwencję "GGG ACT ACT, CTA, TTA, CGT, CAT T" dla kontrolnego (ciągu) shRNA, który nie wykazywał znaczącego podobieństwa do żadnego znanego transkryptu. Oligonukleotydy używane do wytwarzania indukowalnych konstruktów shRNA Tet-On, na przykładzie YY1, przedstawiono w tabeli 1. W rezultacie skonstruowano dwa wektory lentiwirusowe, pLu-Puro-Indu-YY1 shRNA i pLu-Puro-Indu-cont shRNA, które wykorzystano do produkcji lentiwirusów. Użyliśmy tych lentiwirusów do indywidualnego zakażenia dwóch klonów komórek MDA-MB-231 (klonów 1 i 3) eksprymujących zarówno regulator tetracykliny (tetR), jak i lucyferazę Firefly. Populacje komórek poliklonalnych uzyskano po selekcji puromycyny. Rycina 3A przedstawia knockdown YY1 wywołany przez Dox w tych komórkach MDA-MB-231 zakażonych lentiwirusem shRNA pLu-Puro-Indu-YY1. Następnie użyliśmy komórek poliklonalnych klonu 3 zakażonych indywidualnie przez te indukowalne lentiwirusy YY1 shRNA i cont shRNA i zaobserwowaliśmy, że wyczerpanie YY1 zmniejszyło inwazyjność komórek MDA-MB-231 (Figura 3B). Analizy Western blot potwierdziły wyciszenie YY1 indukowane przez Dox w komórkach MDA-MB-231 z indu-YY1 shRNA, podczas gdy komórki zawierające indu-cont shRNA nie wykazywały tego efektu (Figura 3C). Następnie wykorzystaliśmy te komórki do badania na mysim modelu ksenoprzeszczepu. W porównaniu z grupami kontrolnymi, myszy wszczepione komórkom MDA-MB-231 z indu-YY1 shRNA i zaopatrzone w wodę zawierającą Dox wykazywały zmniejszone tworzenie guza, gdy były wizualizowane przez bioluminescencję (Figura 4A) i określane przez masę guza (Figura 4B). Wyciszenie YY1 w tych guzach ksenoprzeszczepu zostało potwierdzone w badaniach Western blot pokazanych na rycinie 4C.

Rysunek 1. Schemat ideowy generowania konstruktu shRNA i transkrypcji shRNA. Pokazano startery od P1 do P6 (patrz tabela 1 dla przykładowych sekwencji). Pol III: polimeraza RNA III. (d): strawiony koniec. Rysunek nie jest w skali. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większy obraz.

Rysunek 2. Schematy ideowe (A) wektora lentiwirusowego i (B) mechanizmu indukowanego przez Tet-On promotora H1 używanego do wyciszania genów. Wektor lentiwirusowy zrekonstruowano na podstawie pLL3.7¹⁴ . H1-Pr: promotor H1; Ubc-Pr: Ludzki promotor ubikwityny C; Puro: puromycyna; TRE: Element reagujący na tetracyklinę; Dox: doksycyklina. TetR: regulator tetracykliny. 5'LTR, 3'SIN-LTR i WRE są niezbędnymi składnikami wektora lentiwirusowego¹⁴ .

Rysunek 3. Wyciszenie YY1 wywołane przez Dox i jego wpływ na inwazyjność komórek MDA-MB-231. A. Poziomy YY1 w dwóch populacjach komórek poliklonalnych pochodzących z klonów 1 i 3 wykazujących ekspresję TetR zakażonych lentiwirusem pLu-Puro-Indu-YY1 shRNA i hodowanych pod nieobecność i w obecności Dox. B. Test komorowy Boydena komórek MDA-MB-231 z indukowalnymi shRNA. (* P < 0,05 w porównaniu z pozostałymi trzema grupami). C. Reprezentatywne Western blot ekspresji YY1 w tych czterech populacjach komórek.

Rysunek 4. Wpływ indukowanego wyciszania YY1 na tworzenie guza ksenoprzeszczepu przez komórki MDA-MB-231. A. Schemat ideowy implantacji komórek (po lewej) i reprezentatywne obrazy bioluminescencyjne uchwycone przez system obrazowania IVIS po 4 tygodniach (po prawej) po inokulacji komórek. B. Waga guza ksenoprzeszczepu po 4 tygodniach. * P ≤ 0,05. C. Western blot ekspresji YY1 i β-aktyny w ksenoprzeszczepach komórek MDA-MB-231 z indu-YY1 shRNA przy braku i obecności Dox. Etykiety na górze to nazwy poszczególnych myszy.

Oligonukleotyd Sekwencja (5' - 3') Użytkowanie i lokalizacja P1 (Tet-On H1) cagt GGATCC CGA ACG CTG ACG TCA TCA TCA ACC C PCR; na końcu 5' promotora H1 P1 (U6) cagt GGATCC GAC GCC GCC ATC TCT AGG PCR; na końcu 5' promotora U6 P2 (dla YY1 z Tet-On H1) cagc AAGCTT GAA atc tgc acc tgc ttc tgc tcc c GGG ATC TCT ATC ACT GAT AGG GAA C PCR; na końcu 3' indukowanego promotora H1 Tet-On P2 (dla YY1 z U6) cagc AAGCTT GAA atc tgc acc tgc ttc tgc tcc c aaa caa ggc ttt tct cct cca agg gat a PCR; na końcu 3' promotora U6 P3 (dla YY1) AGC TT ATC TGC ACC TGC TTC TTC TCC C TTTTT G Do wyżarzania za pomocą P4 P4 (dla YY1) aattc aaaaa ggg agc aga aga agc ag tgc aga t a Do wyżarzania za pomocą P3 P5 (dla pLL3.7) ggg tac agt gca ggg gaa aga ata g Do badań przesiewowych PCR, używany z P6 P6 (dla Tet-On H1) GAT TTC CCA GAA CAC ATA GCG AC Do badań przesiewowych PCR, stosowany z P5 P6 (dla U6) AGG GTG AGT TTC CTT TTG TGC TG TG Do badań przesiewowych PCR, stosowany z P5

Tabela 1. Zsyntetyzowane oligonukleotydy wykorzystywane do generowania konstruktów shRNA. Podano sekwencje P1 i P6 dla mysich promotorów H1 indukowanych przez U6 i Tet-On u ludzi. Ludzki YY1 jest używany jako przykład z docelową sekwencją shRNA GGG AGC AGA AGA AGC AGG TGC AGA T. Sekwencje specyficzne dla YY1 są podświetlone. Dwie sekwencje P2 YY1 są zaprojektowane odpowiednio dla dwóch promotorów. Składowe shRNA U6/YY1 zostało opisane wcześniej¹⁵, podczas gdy Tet-On H1/YY1 został użyty w tym protokole. P5 jest specyficzny dla wektora i pokazana jest sekwencja dla pLL3.7¹⁴. Sekwencje enzymów restrykcyjnych są podkreślone, natomiast sekwencje do wyżarzania do promotorów podczas amplifikacji PCR są podkreślone kursywą.

Discussion

Protokół ten opisuje metodę obalania genu za pomocą shRNA i wizualizacji jego efektu biologicznego za pomocą bioluminescencyjnego obrazowania wzrostu komórek nowotworowych in vivo. Miejsce docelowe shRNA nie powinno zawierać żadnego z trzech miejsc restrykcyjnych (BamHI, HindIII i EcoRI) wykorzystywanych do subklonowania. W rzadkim scenariuszu, gdy którekolwiek z tych miejsc jest obecne, dodatkowy enzym restrykcyjny może być użyty do zastąpienia go w generowaniu konstruktu.

Kilka kluc...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Oprócz powszechnie używanego sprzętu laboratoryjnego do analiz RNA i białek oraz hodowli komórkowych, do tego protokołu wymagane są następujące materiały i odczynniki.
Szafa bezpieczeństwa biologicznego odpowiednia do
Ultrawirówka
Komora anestezjo-indukcyjna ze zmiataczami izofluranu
Suwmiarka
IVIS
Wysoce kompetentny DH5a E. coli
EcoRI, BamHI i Enzymy
Ligaza
Plazmidy pakowania lentiwirusa trzeciej generacji VSV-G, pRSV-Rev i pMDLg/pRRE
Lista materiałów