Izolacja embrionalnej grzebieni neuralnej z rurki neuralnej umożliwia zastosowanie metod in vitro do badania migracji, samoodnawiania oraz multipotencji grzebieni neuralnej.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Izolacja i hodowla komórek grzebienia neuronalnego z zarodkowej rurki nerwowej myszy
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Zarodkowa grzebień neuronalny (NC) jest multipotentną populacją prekursorową, która powstaje w grzbietowej części rurki nerwowej, przechodzi przejście epitelialno-mezenchymalne (EMT) i migruje przez cały embrion, dając początek różnym typom komórek 1-3. NC posiada również wyjątkową zdolność wpływania na różnicowanie i dojrzewanie organów docelowych4-6. Po wyizolowaniu in vitro, prekursory NC ulegają samoodnawianiu, migrują i różnicują się w różne typy tkanek, w tym w neurony, glej, komórki mięśni gładkich, chrząstkę i kość.
Wielopotencjalność NC została po raz pierwszy opisana na przykładach eksplantów rurki nerwowej ptaków7-9. Izolacja komórek NC in vitro ułatwia badanie dynamiki NC, w tym proliferacji, migracji i wielopotencjalności. Dalsze prace w systemach ptasich i szczurzych wykazały, że eksplantowane komórki NC zachowują swój potencjał NC po ponownym przeszczepieniu do embrionu10-13. Ponieważ te wrodzone właściwości komórkowe są zachowane w eksplantowanych progenitorach NC, test z eksplantem rurki nerwowej stanowi atrakcyjną opcję badania NC in vitro.
Aby lepiej zrozumieć naturę ssaczych NC, zastosowano wiele metod izolacji populacji NC. Progenitory pochodzące z NC mogą być hodowane z lokalizacji pomigracyjnych zarówno w embrionie, jak i u osobników dorosłych, w celu zbadania dynamiki pomigracyjnych progenitorów NC11,14-20; jednak izolacja progenitorów NC w momencie ich emigracji z rurki neuralnej zapewnia optymalne zachowanie potencjału komórek NC oraz ich właściwości migracyjnych13,21,22. Niektóre protokoły wykorzystują fluorescencyjne sortowanie komórek (FACS) w celu wyizolowania populacji NC wzbogaconej o konkretne progenitory11,13,14,17. Jednak w przypadku rozpoczynania pracy z embrionami we wczesnym stadium, trudno jest uzyskać za pomocą FACS liczbę komórek wystarczającą do analiz, co komplikuje izolację wczesnych populacji NC z pojedynczych embrionów. W niniejszej pracy opisujemy podejście, które nie opiera się na FACS i pozwala uzyskać populację NC o czystości około 96%, w oparciu o aktywowany przez Wnt1-Cre reporter linii komórkowej23.
Metoda przedstawiona w niniejszej pracy została zaadaptowana z protokołów zoptymalizowanych dla hodowli komórek NC szczura11,13. Zaletą tego protokołu w porównaniu z wcześniejszymi metodami jest to, że 1) komórki nie są hodowane na warstwie karmionej, 2) do uzyskania względnie czystej populacji NC nie jest wymagana metoda FACS, 3) izolowane są premigracyjne komórki NC oraz 4) wyniki są łatwe do ilościowego określenia. Ponadto protokół ten może być wykorzystany do izolacji NC z dowolnego mutantowego modelu mysiego, co ułatwia badanie charakterystyki NC przy różnych manipulacjach genetycznych. Ograniczeniem tego podejścia jest usunięcie NC z kontekstu zarodka, co jak wiadomo wpływa na przeżywalność, migrację i różnicowanie NC2,24-28.
Protokół
1. Przygotowanie płytek
- Przez cały czas stosować technikę sterylną.
- Przygotować fibronektynę (FN), rozcieńczając 100 μL zapasu ludzkiej plazmowej FN do końcowej objętości 3,3 mL w buforze PBS Dulbecco (dPBS). Stężenie końcowe wynosi 30 μg/mL; roztwór ten można przechowywać w temperaturze 4 °C przez 1 tydzień.
- Przykryć dno każdego dołka w sterylnej czterodołkowej płytce do hodowli tkankowych roztworem FN i pozostawić na 15 minut. Należy upewnić się, że cała powierzchnia jest pokryta. W tym czasie przygotować pożywki (kroki 2 i 3).
- Usunąć roztwór FN i pozwolić płytkom wyschnąć. Delikatnie wypłukać dołki 500 μL D....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Aby zapewnić sukces tego podejścia, należy zwrócić szczególną uwagę na stopień rozwoju zarodka. Liczenie somytów we wczesnych zarodkach myszy jest kluczowe zarówno dla dopasowania stadium rozwoju zarodków w obrębie jednego miotu, jak i dla wyznaczenia prawidłowych obszarów rurki nerwowej do izolacji. Różnica jednego lub dwóch somytów między zarodkami mieści się w dopuszczalnym zakresie czasu rozwoju, w zależności od wymaganej rozdzielczości prowadzonego eksperymentu. Zarodek w wieku od 9 do 9,5 dpc będzie miał od 17 do 2.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Nie mamy nic do ujawnienia.
Podziękowania
Pragniemy podziękować Marcowi Wozniakowi za pomoc przy nagrywaniu wideo. Chcielibyśmy również podziękować Seanowi Morrisonowi z UT Southwestern za oryginalny protokół hodowli komórek NC szczura. Praca ta była wspierana przez Vanderbilt University Medical Center Academic Program Support oraz granty z NIH (HD36720 i HD036720-11S109) i AHA 11GRNT7690040 dla PAL, stypendia przeddoktoranckie z AHA (0615209B) i NIH (NS065604) dla NAM, a ERP otrzymał wsparcie z grantu szkoleniowego NIH T32HD007502.
....Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| DMEM (niska zawartość glukozy) | GIBCO, by Life Technologies | 11885 | |
| Pożywka Neurobasal | GIBCO, by Life Technologies | 21103 | |
| BSA | Sigma-Aldrich | A3912-10G | |
| dPBS | GIBCO, by Life Technologies | 14190-144 | |
| IGF1 | BD Biosciences | 354037 | Przechowywać w alikwotach 50 μg/mL |
| bFGF | BD Biosciences | 354060 | Przechowywać w alikwotach 25 μg/mL |
| Fibronektyna | GIBCO, by Life Technologies | 33016-015 | Przechowywać w alikwotach 1mg/mL |
| Kwas retinowy | Sigma-Aldrich | R2625 | Rozpuścić w etanolu, przygotować alikwoty 35 μg/ml |
| 2-merkapto–etanol | Sigma-Aldrich | D-5637 | |
| Suplement N2 | GIBCO, by Life Technologies | 17502-048 | |
| Suplement B27 | GIBCO, by Life Technologies | 17504-044 | |
| Filtry Steriflip 0,22 μm | EMD Millipore | SCGP00525 | |
| Penicylina/streptomycyna | Invitrogen | 15140122 | |
| Filtry 0,20 μm | Corning | 431219 | |
| Strzykawki (do filtracji) | BD Biosciences | 301604 | |
| Płytki czterodołkowe | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 176740 | |
| Kolagenaza/Dyspaza | Roche Group | 269 638 | Aktywność różni się w zależności od partii. Przechowywać w alikwotach 100 mg/mL. |
| Igły insulinowe (rozmiar 29 ½ G) | BD Biosciences | 309306 | |
| Komora hipoksyczna | Billups-Rothenberg, Inc. | ||
| Analizator tlenu | Billups-Rothenberg, Inc. | ||
| Pinceta nr 5 | Fine Science Tools | Do usuwania macicy i błony decidualnej. |
Bibliografia
- Le Douarin, N., Kalcheim, C. The neural crest. , 2nd edn, Cambridge University Press. (1999).
- Kulesa, P. M., Gammill, L. S. Neural crest migration: patterns, phases and signals. Developmental biology. 344, 566-568 (2010).
- Saint-Jeannet, J. -P.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
