Ekstrakty jądrowe na małą skalę do funkcjonalnych testów maszyn do ekspresji genów

Podsumowanie

Opisano protokół przygotowania solidnych, małych ekstraktów jądrowych HeLa. Protokół ten jest cenny w przypadku testów, które wymagają użycia małych populacji komórek, takich jak komórki leczone lekami lub RNAi. Metoda ta powinna mieć zastosowanie do szerokiej gamy testów ekspresji genów i innych typów komórek, w tym komórek pacjenta.

Streszczenie

Duży postęp w zrozumieniu ekspresji genów został osiągnięty przy użyciu systemów in vitro. W przypadku większości badań testy funkcjonalne przeprowadza się przy użyciu ekstraktów, które są przygotowywane luzem z 10-50 lub więcej litrów komórek hodowanych w zawiesinie. Jednak te preparaty na dużą skalę nie są podatne na szybkie testowanie efektów in vitro, które wynikają z różnych zabiegów komórkowych lub warunków in vivo. Ten artykuł wideo w czasopiśmie przedstawia metodę przygotowania funkcjonalnych ekstraktów jądrowych na małą skalę, na przykładzie komórek HeLa. Metoda ta jest przeprowadzana przy użyciu zaledwie trzech 150 mm płytek komórek hodowanych jako przylegające monowarstwy. Aby zilustrować skuteczność ekstraktów na małą skalę, pokazujemy, że są one tak samo aktywne jak masowe ekstrakty jądrowe w reakcjach transkrypcji/splicingu sprzężonej polimerazy II RNA. Aby zademonstrować użyteczność protokołu ekstrakcji, pokazujemy, że splicing jest zniesiony w ekstraktach przygotowanych z komórek HeLa traktowanych lekiem blokującym splicing E7107. Protokół na małą skalę powinien mieć ogólne zastosowanie do każdego procesu lub typu komórki, które można badać in vitro przy użyciu ekstraktów komórkowych. Należą do nich komórki pacjentów, które są dostępne tylko w ograniczonych ilościach lub komórki narażone na działanie wielu czynników, takich jak leki, czynniki uszkadzające DNA, RNAi lub transfekcja, które wymagają użycia małych populacji komórek. Ponadto niewielkie ilości świeżo wyhodowanych komórek są wygodne i/lub wymagane w niektórych zastosowaniach.

Protokół

1. Hodowla komórek HeLa do ekstrakcji jądrowej

1. Umieść komórki HeLa na trzech płytkach o średnicy 150 mm z pożywką DMEM uzupełnioną 10% FBS i 1% penicyliną/streptomycyną. Hodować w inkubatorze o temperaturze 37 °C z 5% CO_{2 ,} aż komórki zlewają się w 90%.

Tip- Podziel komórki 1:10 z płytki zlewającej się i zbieraj 3 dni po podzieleniu.

Tip- Dodatkowa płytka może być wyhodowana w przypadku, gdy nie ma wystarczającej liczby komórek z trzema płytkami (na przykład, jeśli komórki są mniej niż 90% zlewne).

2. Przygotowanie i schłodzenie roztworów ekstraktu jądrowego

1. Przygotować świeże roztwory, jak przedstawiono w tabeli 2.
2. Podwielokrotność 10 ml buforu hipotonicznego do 15 ml probówki Falcon. Podaniec 1 ml buforu o wysokiej zawartości soli i 1 ml buforu o niskiej zawartości soli do 1,5 ml probówek Eppendorfa. Schłodzić na lodzie. Dodać odpowiednie ilości PMSF i DTT do każdego bufora bezpośrednio przed użyciem (zob. tabela 1).

3. Pozyskiwanie komórek HeLa do ekstrakcji jądrowej

1. Odessać pożywkę z komórek i przemyć komórki raz 13 ml o temperaturze pokojowej 1X PBS na płytkę.
2. Zassać płuczkę PBS.

Tip- Odessaj jak najwięcej PBS, najpierw zasysając, następnie stawiając płytkę na boku, czekając kilka sekund i odsysając resztę.

3. Za pomocą podnośnika komórkowego zeskrob komórki do dolnej krawędzi płytek, a następnie przenieś komórki do probówki Eppendorfa. Unikaj robienia bąbelków. 3 płytki zeskrobanych komórek powinny zmieścić się w jednej probówce Eppendorf o pojemności 1,5 ml.

Tip- Łatwiej jest oszacować objętość komórek, jeśli używa się rurki Eppendorfa. Aby zwiększyć skalę, użyj rur Falcon.

4. Wirować w temperaturze 4 °C w mikrofugach przez 5 minut w temperaturze 100 x g w celu osadzenia komórek.

4. Pęczniejące komórki HeLa w hipotonicznym buforze

1. Ostrożnie odessać PBS z osadu komórkowego i oszacować objętość upakowanych komórek (PCV), patrząc na gradację na probówce. Trzy zlewające się płytki komórek HeLa dają około 500 μl PCV.
2. Dodaj 2X PCV buforu hipotonicznego do osadu komórkowego. Delikatnie wstrząśnij, aby ponownie zawiesić komórki. Za pomocą urządzenia Pipetman P1000 delikatnie zawiesić ogniwa, w razie potrzeby pipetując w górę i w dół.
3. Wirować w temperaturze 4 °C w mikrofugach przez 5 minut przy 100 x g w celu osadzenia komórek. *Do tego czasu komórki zaczną pęcznieć, a objętość komórek powinna teraz wynosić około 750 μl-1000 μl.
4. Ostrożnie odessać bufor hipotoniczny i dodać nowy bufor hipotoniczny do końcowej objętości 1,5 ml. Ponownie zawiesić komórki.
5. Zawiesić spuchnięte komórki inkubować na lodzie przez 10 minut.

5. Lizuj komórki za pomocą homogenizatora z odbiciem

1. Użyj buforu hipotonicznego, aby spłukać odbitkę, a następnie schłodzić ją na lodzie. Wytrzyj tłuczek do sucha delikatną wycieraczką zadaniową (np. Kimwipe). Usuń pozostały bufor z odrzutu za pomocą przedłużonej końcówki mikropipety o pojemności 1000 μl.
2. Przenieś spuchnięte komórki do odbicia. Powoli przesuń ciasny tłuczek odbijania w górę iw dół 5 razy, aby zlizować komórki, uważając, aby uniknąć pęcherzyków.
3. Test do lizy komórek przy użyciu 5 μl podwielokrotności komórek z odbicia. Umieścić podwielokrotność w probówce Eppendorfa i dodać równą objętość błękitu trypanowego. Umieść mieszaninę na szkiełku i zbadaj komórki za pomocą mikroskopu świetlnego. Jądra zlizowanych komórek będą niebieskie. Około 90% lizy jest idealne.

Tip- Liczba odbić komórek będzie się różnić w zależności od intensywności odbicia. Wykonując ten protokół po raz pierwszy, określ, ile razy należy odbić, wykonując krok 5.3 po każdym uderzeniu z odbiciem. Nie odbijaj się zbyt mocno, nadmierne zanurzanie zniszczy jądra.

4. Przenieś lizowane komórki do wstępnie schłodzonej probówki Eppendorfa i wiruj w mikrofugach o temperaturze 4 °C przez 5 minut w temperaturze 1500 x g. Osad zawiera jądra. Ostrożnie przenieść supernatant do nowej probówki, nie przerywając jąder. Supernatant zawiera cytoplazmę.

Tip- Cytoplazma może być używana w takiej postaci, w jakiej jest, lub dalej przetwarzana do S100 przy użyciu tego samego szybkiego wirowania, które jest używane do masowych ekstraktów (patrz¹ dla przygotowania aktywnego S100 z dużych ekstraktów).

6. Ekstrakcja soli z jąder

1. Oszacuj objętość upakowanego jądra (PNV), patrząc na gradację na probówce. PCV o wielkości 500 μl daje zazwyczaj PNV o wielkości 400 μl.
2. Dodaj 1/2 X PNV buforu o niskiej zawartości soli do jąder, wkładając końcówkę mikropipety do dna probówki i powoli wstrzykując bufor do jąder, delikatnie mieszając. Nie pipetować w górę i w dół. Delikatnie przesuń rurki, aby upewnić się, że granulka jest całkowicie zawieszona w buforze o niskiej zawartości soli przed kontynuowaniem.
3. Dodaj 1/2 X PNV buforu o wysokiej zawartości soli i szybko wymieszaj 1 raz, odwracając probówkę. Nie potrząsać. Obracać w temperaturze 4 °C przez 30 minut.

Tip- Bądź delikatny dla jąder, gdy są w buforze o wysokiej zawartości soli, aby uniknąć ich lizy.

4. Wirować w temperaturze 4 °C w mikrofugach przez 15 minut w temperaturze 18 000 x g. Supernatantem jest ekstrakt jądrowy o wysokiej zawartości soli (HS-NE). Trzy płytki komórek zwykle dają 500-600 μl HS-NE.

7. Zagęścić i dializować ekstrakt jądrowy

1. Przenieść 500 μl HS-NE do schłodzonych mini-centrikonów (Amicon) i wirować przez 50 minut w temperaturze 4 °C w mikrofugach o sile 14000 x g. Odwrócić mini-centrikon (Amicon) i umieścić go w nowej probówce Eppendorfa. Wirować przez 2 minuty w temperaturze 4 °C 1000 x g, aby odzyskać HS-NE. HS-NE zostanie skoncentrowany do około 115 μl.
2. Za pomocą Pipetmana P200 przenieś 45 μl podwielokrotności HS-NE do mini-dializatorów Slide-A-Lyzer i umieść je w 500 ml schłodzonego buforu do dializy. Upewnij się, że spód Slide-A-Lyzer jest wyrównany z dnem pływaka. Mieszać przez 1-2 godziny w temperaturze 4 °C. NE będzie wyglądał na mętny po dializie.

Tip- Nie odwiruj, aby usunąć mętny osad, który obserwuje się po dializie, ponieważ to wirowanie zmniejsza aktywność ekstraktu.

3. NE może być używany natychmiast lub w porcjach. Podwielokrotności należy błyskawicznie zamrozić w ciekłym azocie i przechowywać w temperaturze -80 °C. NE może być przechowywany i przechodzić co najmniej dwa cykle zamrażania i rozmrażania bez utraty aktywności.

8. Reprezentatywne wyniki

Ostatnio opracowano skuteczne systemy in vitro do sprzężenia transkrypcji RNAP II z splicing^2-5. Systemy te wykorzystywały komórki HeLa hodowane masowo, a zatem nie są podatne na szybkie testowanie efektów określonych zabiegów komórkowych na wielu próbkach. Opierając się na tej potrzebie i ogólnej użyteczności protokołu ekstrakcji na małą skalę (patrz Dyskusja), opracowaliśmy solidną metodę ekstrakcji jądrowej na małą skalę. Reprezentatywne dane porównujące reakcję transkrypcji/splicingu RNAP II w małym ekstrakcie jądrowym z ekstraktem jądrowym w objętości przedstawiono na rysunku 2. Do analizy wykorzystano konstrukt CMV-DNA, który zawiera promotor CMV i koduje standardowy substrat splicingowy (Ftz³, rysunek 2A). Kiedy ten konstrukt był inkubowany w ekstrakcie masowym (ścieżki 1-3) lub na małą skalę (tory 4-6), podobne poziomy powstającego pre-mRNA zostały zsyntetyzowane przez 5-minutowy punkt czasowy (ryc. 2, tory 1 i 4). Po dodaniu α-amantyny w celu zablokowania dalszej transkrypcji, produkty pośrednie splicingu i produkty splicingu gromadziły się z czasem z podobną kinetyką w obu typach ekstraktów (ryc. 2, pasy 2, 3, 5, 6). Te reprezentatywne wyniki pokazują, że wydajność sprzężonego systemu transkrypcji/splicingu RNAP II jest podobna w przypadku ekstraktów jądrowych masowych i małoskalowych.

Aby zademonstrować użyteczność metody ekstrakcji na małą skalę, przygotowano ekstrakty z komórek HeLa potraktowanych inhibitorem splicingu, E7107, lub negatywnym związkiem kontrolnym pladienolidem F^6,7, a następnie przeprowadzono sprzężony test transkrypcji/splicingu RNAP II. Jak pokazano na rycinie 3, transkrypcja przez RNAP II zachodziła skutecznie w ekstraktach przygotowanych zarówno z komórek traktowanych pladienolidem F, jak i E7107 (10-minutowe punkty czasowe). W przeciwieństwie do tego, splicing występował normalnie w ekstrakcie przygotowanym z komórek traktowanych pladienolidem F, ale został zniesiony w komórkach traktowanych E7107 (ryc. 3, 20-60 minut punktów czasowych). Dane te dostarczają dowodów na słuszność koncepcji wykorzystania ekstraktów jądrowych na małą skalę do specjalnej obróbki komórek w małej skali.

Rysunek 1. Schemat protokołu ekstrakcji na małą skalę. Krok P1. Komórki są hodowane jako monowarstwy, zbierane z płytek za pomocą podnośnika komórkowego i pęczniejące przez dodanie buforu hipotonicznego. Krok P2. Komórki są poddawane lizie za pomocą homogenizatora Dounce i odwirowywane w celu osadzania jąder. Krok P3. Jądra są oddzielane od cytoplazmy i poddawane ekstrakcji soli. Krok P4. Ekstrakt jądrowy jest zagęszczony i dializowany. Krok P5. Uzyskano wyniki, które pokazują, że ekstrakty jądrowe są funkcjonalne (patrz rysunek 2 w celu uzyskania bardziej szczegółowych informacji).

Rysunek 2. Ekstrakty jądrowe na małą skalę są wytrzymałe w sprzężonym teście transkrypcji/splicingu RNAP II. A. Schemat matrycy DNA CMV-Ftz używanej do sprzężonej transkrypcji/splicingu RNAP II. Wskazano promotor CMV oraz rozmiary eksonów i intronów. B. Porównanie sprzężonego testu transkrypcji/splicingu RNAP II przy użyciu luzem ekstraktu jądrowego lub ekstraktu jądrowego na małą skalę. α-amantynę dodano po 5 minutach transkrypcji i pozostawiono splicing na 30 i 60 minut. RNA wyekstrahowano i frakcjonowano na 5% denaturującym żelu poliakrylamidowym i wykryto za pomocą fosfoimagera. Wskazane są półprodukty i produkty do łączenia. Wskazane są endogenne U6 snRNA i tRNA obecne w ekstrakcie, które są znakowane ³²P podczas inkubacji. Patrz³, aby zapoznać się ze szczegółowym protokołem sprzężonego systemu transkrypcji/splicingu RNAP II.

Rysunek 3. Ekstrakty jądrowe na małą skalę przygotowane z komórek HeLa poddanych działaniu inhibitora splicingu E7107 są wadliwe w splicingu. Komórki potraktowano 3 μM pladienolidem F lub E7107 zgodnie z opisem⁶, a następnie wykorzystano do przygotowania ekstraktów jądrowych na małą skalę. Przebieg czasowy przeprowadzono przy użyciu tego samego testu transkrypcji/splicingu, jak na rysunku 2. Wskazywane są półprodukty i produkty splicingu oraz U6 snRNA i tRNA.

Dyskusja

Opracowaliśmy szybką i powtarzalną metodę przygotowania ekstraktów jądrowych z niewielkich ilości komórek HeLa hodowanych jako monowarstwy. Wykazaliśmy, że ekstrakty te są solidne, wykazując, że kinetyka i wydajność testów transkrypcji/splicingu RNAP II są podobne w ekstraktach jądrowych na małą i masową skalę. Wykazaliśmy użyteczność ekstraktów, wykazując, że ekstrakty przygotowane z komórek traktowanych lekiem hamującym splicing są aktywne w transkrypcji, ale wadliwe w splicingu.

Nasza metoda otrzymywania ekstraktów jądrowych na małą skalę została opracowana przez połączenie i optymalizację metod wcześniej ustalonych dla wytwarzania ekstraktów z komórek HeLa hodowanych w zawiesinie w dużej skali^1,8 oraz metody otrzymywania ekstraktów na małą skalę⁹. Ustaliliśmy nasz protokół, ponieważ poprzednie ekstrakty na małą skalę nie działały w przypadku niektórych testów, takich jak sprzężony test transkrypcji/splicingu. Ważną różnicą między poprzednim protokołem⁹ na małą skalę a naszym jest to, że zoptymalizowaliśmy warunki lizy komórek za pomocą mini-odbicia, podczas gdy poprzedni protokół lizował komórki, przepychając je przez igłę o małej średnicy⁹. W wyniku igłowej lizy powstają pęcherzyki, co może wyjaśniać, dlaczego ekstrakty były nieaktywne i/lub trudne do odtworzenia w niektórych testach. Do naszego protokołu dodaliśmy również etap koncentracji. Ten etap zwiększa aktywność ekstraktów, które są niezwykle wrażliwe na stężenie, a także ogranicza zmienność między ekstraktami, która jest nieodłącznie związana z preparatami na małą skalę. Wreszcie, nasze przygotowanie jest rutynowo przeprowadzane przy użyciu tylko trzech 150-milimetrowych płytek komórek jednowarstwowych, bez znaczącego wpływu na aktywność w porównaniu z ekstraktami masowymi. W związku z tym procedura ta jest łatwo dostępna w przypadku preparatów na małą skalę, które wymagają kosztownych odczynników lub ograniczonej dostępności komórek. Na przykład przygotowaliśmy ekstrakty na małą skalę z komórek knockdown RNAi oraz z komórek pacjentów z przewlekłą białaczką limfocytową (CLL) i wykorzystaliśmy te ekstrakty do testów funkcjonalnych i/lub biochemicznych (EGF, JLH, TY i RR, niepublikowane). Odkryliśmy, że ekstrakty są cenne dla RNAi, a następnie przeprowadza się specyficzne testy biochemiczne, takie jak immunoprecypacja, barwienie zachodnie i srebro. Po ustaleniu skuteczności powalania określonego białka, można przeprowadzić bardziej szczegółowe badanie, tworząc stabilną linię komórkową knockdown, którą można wykorzystać do przygotowania dodatkowych ekstraktów przy niższych kosztach. Spektrometria mas białek obecnych w immunoprecypitatach otrzymanych z tych linii komórkowych knockdown będzie również użytecznym zastosowaniem tej metody. Oprócz sprzężonego testu transkrypcji/splicingu, którego użyliśmy jako przykładu do naszego opisu protokołu, ekstrakty na małą skalę powinny mieć ogólne zastosowanie w wielu testach funkcjonalnych i biochemicznych, takich jak te stosowane na różnych etapach ekspresji genów (np. capping, splicing, transkrypcja, poliadenylacja, przetwarzanie mikroRNA). Protokół można również dostosować do typów komórek pacjenta, które można uzyskać w zawiesinie (takie jak komórki CLL) lub hodowane w kulturze (takie jak fibroblasty pacjenta). Wreszcie, frakcja cytoplazmatyczna uzyskana podczas zabiegu powinna okazać się przydatna zarówno do testów funkcjonalnych, jak i biochemicznych, które wymagają cytoplazmy.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
HEPES	Kwas 4-(2-hydroksyetylo)piperazyno-1-etanosulfonowy	Sigma	H3375-500G
MgCl2.6H2O	Sześciowodny chlorek magnezu	Sigma	M2670-500G
KCl	Chlorek potasu	Fisher	P335-212
PMSF	Fluorek fenylometanosulfonylu	Sigma	P7626-100G
DTT	Ditiothreitol	American Bioanalytical	AB00490-5G
EDTA	Etylenodiaminotetraoctan disodium, dihydrat	American Bioanalytical	AB00500-01000
Glicerol		MP Biomedicals	800689
DMEM	Dulbecco’ s Minimal Essential Medium	Invitrogen	11995-073
FBS	Płodowa surowica bydlęca	Gibco	16140
Penicylina/Streptomycyna		Gibco	15070
PBS	Sól fizjologiczna buforowana fosforanem	Cellgro	21-040-CV
Trypan Blue Stain 0,4%		Gibco	15250
Podnośniki		Corning	29442-200
	150 mm	VWR	353025
Przedłużona końcówka		Denville	P1126
Homogenizator Dounce, 1 ml, z ciasnym tłuczkiem		Wheaton	357538
Slidealyzery, MWCO 10kDa		ThermoScientific	69572
Mini-centrikony, MWCO 3kDa		Millipore (Amicon)	UFC500396
Tabela 1. Specyficzne odczynniki i sprzęt.
Hipotoniczny	10 mM HEPES, pH 7,9	1M HEPES, pH 7,9	5 ml
	1,5 mM MgCl2	1M MgCl2	750 μ l
	10 mM KCl	3 M KCl	1,67 ml
	0,2 mM PMSF	200 mM PMSF	500 μ l
	0,5 mM naziemna telewizja cyfrowa	2 m naziemna telewizja cyfrowa	125 i mu; l
Dodać do 500 ml wody
Low Salt	20 mM HEPES, pH 7,9	1M HEPES, pH 7,9	2 ml
	1,5 mM MgCl2	1M MgCl2	150 μ l
	20 mM KCl	3M KCl	667 μ l
	0,2 mM EDTA	0,5 M EDTA	40 i mu; l
	25% Glicerol	Glicerol	25 ml
	0,2 mM PMSF	200 mM PMSF	100 μ l
	0,5 mM naziemna telewizja cyfrowa	2 m naziemna telewizja cyfrowa	25 i mu; l
Dodać do 100 ml wody
High Salt	20 mM HEPES, pH 7.9	1M HEPES, pH 7.9	2 ml
	1.5 mM MgCl2	1M MgCl2	150 μ l
	1,4 M KCl	3 M KCl	48 ml
	0,2 mM EDTA	0,5 M EDTA	40 μ l
	25% Glicerol	Glicerol	25 ml
	0,2 mM PMSF	200 mM PMSF	100 μ l
	0,5 mM naziemna telewizja cyfrowa	2 m naziemna telewizja cyfrowa	25 i mu; l
Dodać do 100 ml wody
Dialysis	20 mM HEPES, pH 7,9	1M HEPES, pH 7,9	10 ml
	100 mM KCl	3M KCl	16,625 ml
	0,2 mM EDTA	0,5 M EDTA	200 μ l
	20% Glicerol	Glicerol	100 ml
	0,2 mM PMSF	200 mM PMSF	500 μ l
	0,5 mM naziemna telewizja cyfrowa	2 m naziemna telewizja cyfrowa	125 i mu; l
Uzupełnij wodą do 500 ml
Tabela 2. Roztwory do przygotowania ekstraktu jądrowego.