Metoda wytłaczania ze stałym sterowanym ciśnieniem do otrzymywania nanopęcherzyków lipidowych

Podsumowanie

Ten protokół opisuje metodę ekstruzji do przygotowania pęcherzyków lipidowych o rozmiarach submikronowych o wysokim stopniu jednorodności. Metoda ta wykorzystuje system sterowany ciśnieniem z kontrolowanymi natężeniami przepływu azotu do przygotowania liposomów. W niniejszym artykule zostanie przedstawiony preparat lipidowy^1,2, ekstruzja liposomów oraz charakterystyka wielkości.

Streszczenie

Liposomy to sztucznie przygotowane pęcherzyki składające się z naturalnych i syntetycznych fosfolipidów, które są szeroko stosowane jako platforma naśladująca błonę komórkową do badania interakcji białko-białko i białko-lipid³, monitorowania dostarczania leków^4,5 i enkapsulacji⁴. Fosfolipidy w naturalny sposób tworzą zakrzywione dwuwarstwy lipidowe, odróżniając się od miceli. ⁶ Liposomy są tradycyjnie klasyfikowane według wielkości i liczby dwuwarstw, tj. dużych pęcherzyków jednowarstwowych (LUV), małych pęcherzyków jednowarstwowych (SUV) i pęcherzyków wielowarstwowych (MLV)⁷. W szczególności przygotowanie jednorodnych liposomów o różnych rozmiarach jest ważne dla badania krzywizny błony, która odgrywa istotną rolę w sygnalizacji komórkowej, endo- i egzocytozie, fuzji błonowej i transporcie białek⁸. Kilka grup analizuje, w jaki sposób białka są wykorzystywane do modulowania procesów obejmujących krzywiznę błony, a tym samym przygotowują liposomy o średnicach <100 - 400 nm, aby zbadać ich zachowanie na funkcjach komórek³. Inni koncentrują się na kapsułkowaniu liposomów i leków, badając liposomy jako nośniki do przenoszenia i dostarczania interesującego leku⁹. Kapsułkowanie leku można osiągnąć, jak podano podczas tworzenia liposomów⁹. Nasz etap ekstruzji nie powinien mieć wpływu na kapsułkowany lek z dwóch powodów, tj. (1) kapsułkowanie leku powinno zostać osiągnięte przed tym etapem oraz (2) liposomy powinny zachować swoją naturalną stabilność biofizyczną, bezpiecznie przenosząc lek w rdzeniu wodnym. Te cele badawcze sugerują ponadto potrzebę zoptymalizowanej metody projektowania stabilnych submikronowych pęcherzyków lipidowych.

Niemniej jednak, obecne technologie przygotowania liposomów (sonikacja¹⁰, zamrażanie i rozmrażanie¹⁰, sedymentacja) nie pozwalają na przygotowanie liposomów o bardzo zakrzywionej powierzchni (tj. średnicy <100 nm) o wysokiej konsystencji i wydajności^10,5, co ogranicza badania biofizyczne rozwijającej się dziedziny wykrywania krzywizny błony. W niniejszym artykule przedstawiamy solidną metodę przygotowania różnych biologicznie istotnych liposomów.

Ręczne wytłaczanie za pomocą gazoszczelnych strzykawek i membran poliwęglanowych^10,5 jest powszechną praktyką, ale często obserwuje się niejednorodność przy użyciu porów o rozmiarach <100 nm, ze względu na zmienność stosowanego nacisku ręcznego. Zastosowaliśmy aparat do wytłaczania o stałym sterowanym ciśnieniu do przygotowania syntetycznych liposomów o średnicach od 30 do 400 nm. Dynamiczne rozpraszanie światła (DLS)¹⁰, mikroskopia elektronowa¹¹ i analiza śledzenia nanocząstek (NTA)¹² zostały wykorzystane do ilościowego określenia rozmiarów liposomów zgodnie z opisem w naszym protokole, z komercyjnymi kulkami polistyrenowymi (PS) użytymi jako standard kalibracji. Zaobserwowano niemal liniową korelację między zastosowanymi rozmiarami porów a eksperymentalnie wyznaczonymi liposomami, co wskazuje na wysoką wierność naszej metody przygotowania liposomów sterowanej ciśnieniem. Ponadto wykazaliśmy, że ta metoda przygotowania pęcherzyków lipidowych ma ogólne zastosowanie, niezależnie od różnych rozmiarów liposomów. Wreszcie, wykazaliśmy również w badaniu czasowym, że te przygotowane liposomy były stabilne do 16 godzin. Reprezentatywny protokół przygotowania liposomów w rozmiarze nano przedstawiono poniżej.

Protokół

1. Przygotowanie liposomów

1. Pobrać szklaną fiolkę o pojemności 20 ml z nakrętką wyłożoną teflonem.
2. Przed użyciem wyczyść wszystkie szklane naczynia i strzykawki chloroformem, aby zapobiec zanieczyszczeniu.
3. Przenieść 100 μl chloroformu klasy odczynnikowej do szklanej fiolki za pomocą hermetycznej szklanej strzykawki o pojemności 250 μl.
4. Dodać 30 μl metanolu z odczynnikiem do tej samej szklanej fiolki za pomocą hermetycznej szklanej strzykawki o pojemności 100 μl.
5. Aby przygotować 2 mM 7:1,5:1,5 fosfatydylocholiny (POPC): fosfatydyloetanoloamina (POPE): roztwór lipidów cholesterolu, przenieś 216 μl 10 mg / ml POPC, 42 μl 10 mg / ml POPE i 20 μl 11 mg / ml roztworów cholesterolu w CHCl₃ do 20 ml szklanej fiolki.
6. Odparować rozpuszczalniki organiczne za pomocą argonu lub azotu o wolnym przepływie, aż na dnie fiolki pojawi się cienka warstwa lipidów.
7. Umieścić niezakorkowaną szklaną fiolkę w eksykatorze próżniowym na co najmniej 30 minut w celu usunięcia pozostałości rozpuszczalnika.
8. Przenieś 2 ml buforu, uprzednio przepuszczonego przez filtr 0,2 mikrona, do szklanej fiolki w celu uwodnienia lipidów.
9. Mieszaninę inkubować w temperaturze 4 °C przez noc i zużyć w ciągu 48 godzin.

2. Zamrażanie i rozmrażanie: Tylko dla liposomów o rozmiarach 30 - 100 nm

1. Zamrozić zawiesinę liposomów w ciekłym azocie na 15 sekund.
2. Rozmrażać zawiesinę liposomów za pomocą bloku grzewczego w temperaturze 42 °C przez ~3 minuty.
3. Powtórz kroki 2.1 i 2.2, w sumie 5 cykli.

3. Ekstruzja

Postępuj zgodnie z instrukcjami Avestin, aby poprawnie zmontować ekstruder Liposofast LF-50, korzystając z konspektu instrumentu w ich przewodniku.

1. Umieść sitko nośne z dużymi otworami (z okrągłymi otworami) w podstawie filtra nośnego, a następnie okrągłe naczynie ze spiekanego naczynia (bez otworów), jedną tarczę odpływową (o średnicy 25 mm) i jedną membranę poliwęglanową (o średnicy 25 mm).
2. Umieść mały, O-ring na górze membrany, aby przymocować go do podstawy filtra nośnego.
3. Zamocuj górną wytłaczarkę filtra, dokręcając 4 w 4 odpowiednich otworach.
4. Zamontuj ekstruder z filtrem pod dużą beczką ekstrudera. Dodaj roztwór liposomu do cylindra. Umieść w kolejności na wierzchu lufy do wytłaczania: duży okrągły O-ring, wąska nasadka, duży okrągły O-ring, okrągła nasadka.
5. Przymocuj regulator gazu do górnej części cylindra ekstrudera i zamknij wszystkie zawory, aby zapobiec wyciekowi powietrza, w tym zawór bezpieczeństwa. Umieścić szklaną fiolkę o pojemności 20 ml lub kolbę Erlenmeyera o pojemności 50 ml pod jednostką filtrującą wytłaczarki. Zawór bezpieczeństwa jest podłączony do regulatora i zwolni się, jeśli ciśnienie przekroczy 600 psi. Włącz gazowy azot i otwórz zawór gazowy podłączony do ekstrudera.
6. Zwiększ ciśnienie azotu do 25 psi dla liposomów 400 nm, 125 psi dla liposomów 100 nm i 400-500 psi dla liposomów 30 nm.
7. Obserwuj zawiesinę liposomów, która wyrzuca się do pojemnika, będąc popychaną przez azot. Utrzymuj przepływ azotu do momentu, gdy nie zauważysz już przepływu cieczy przez filtr ekstrudera do szklanej fiolki.

4. Analiza dynamicznego rozpraszania światła (DLS)

1. Przygotuj 50 μl 20 μM roztworu liposomu.
2. Włącz źródło zasilania i źródło lampy.
3. Otwórz oprogramowanie DynaPro.
4. Ustaw oprogramowanie na model algorytmu MS/X do wykrywania liposomów o długości fali 30 nm i 100 nm oraz model algorytmu MS800 do wykrywania liposomów o długości fali >100 nm.
5. Połącz się ze sprzętem.
6. Odpipetować 14 μl próbki liposomu do kuwety kwarcowej i włożyć do uchwytu kuwety.
7. Naciśnij start.
8. Naciśnij stop po ~20 - 30 przejęciach.
9. Przeanalizuj średnie piki średnicy liposomów zarejestrowane na histogramie.

5. Analiza śledzenia nanocząstek (NTA)

1. Przygotuj 500 μl, 0,1 μM roztwór liposomów.
2. Przepłukać komorę na próbkę wodą i etanolem.
3. Osusz komorę na próbkę niestrzępiącym się ręcznikiem papierowym.
4. Włącz źródło zasilania lasera i komputer.
5. Dostarczyć 300 μl roztworu liposomu 0,1 μM do komory próbki.
6. Otwórz oprogramowanie do kontroli temperatury i analizy śledzenia nanocząstek.
7. Naciśnij przycisk przechwytywania, aby włączyć laser.
8. Użyj regulacji w poziomie i pionie, aby przesunąć stolik i dostosować ostrość mikroskopu.
9. Ustaw żądaną temperaturę (20 °C) i czas nagrywania (co najmniej 30 sekund).
10. Naciśnij przycisk nagrywania, aby zrobić wiele klatek zdjęć cząstek liposomu przez określony czas. Przeanalizuj piki odpowiadające rozmiarom liposomów o średnicy na histogramie, ponieważ śledzi on ruch każdej cząstki.

6. Reprezentatywne wyniki

Schemat opisujący metodę ekstruzji jest przedstawiony na rysunku 1. Aby uzyskać optymalne wyniki, przygotowanie liposomów o średnicach 30 nm wymaga wysokiego ciśnienia ~ 500 psi, a średnice 100 nm wymagają ciśnienia 125 psi, aby osiągnąć szybki współczynnik filtracji. W przypadku średnic 400 nm zaleca się niskie ciśnienie ~ 25 psi, aby uzyskać wolniejszą szybkość filtrowania, co pozwala pęcherzykom wydłużać się i tworzyć większe, jednorodne liposomy. Przeprowadziliśmy serię eksperymentów w celu określenia optymalnego ciśnienia do wytwarzania stałych rozmiarów pęcherzyków submikronowych. Zmienialiśmy ciśnienie, a także liczbę przejść przez filtry poliwęglanowe o wielkości porów 30, 100 i 400 nm i odkryliśmy odpowiednie ciśnienie dla każdego pożądanego rozmiaru. W przypadku porów 30 nm ciśnienie poniżej 500 psi zmniejszy natężenie przepływu, powodując wydłużenie, a tym samym większe rozmiary pęcherzyków. W przypadku porów 100 nm osiągnięto stały przepływ przy 125 psi. W przypadku porów 400 nm niskie ciśnienie (25 psi) pozwala pęcherzykom wydłużyć się do większych rozmiarów pęcherzyków. Powolny przepływ filtracji w kierunku kropli jest optymalny do tworzenia większych pęcherzyków submikronowych¹³.

Przeprowadziliśmy DLS, aby określić rozmiary liposomów wytłaczanych przez trzy różne średnice, tj. 30, 100 i 400 nm. DLS to uznana metoda, która zbiera rozproszone światło w celu określenia średnicy cząstek. Wytłaczaliśmy uwodnione liposomy o wielkości 2 mM przez membranę poliwęglanową 30 nm przy 500 psi z 5 przejściami przez pory filtra; Membrana poliwęglanowa 100 nm przy 125 psi z 5 przejściami przez pory filtracyjne i membrana poliwęglanowa 400 nm przy 25 psi z 2 przejściami przez pory filtra. Średnice liposomów mierzone za pomocą DLS dla wielkości porów 30, 100 i 400 nm wynosiły 66 ± 28, 138 ±18 i 360 ± 25 nm (ryc. 2). Jako wzorzec kalibracyjny użyto zawiesiny kulek polistyrenowych o długości fali 50 nm, jak pokazano na rysunku 2, gdzie zarejestrowano średnicę 47 ± 16 nm. Procentowa polidyspersyjność pokazuje, że nie ma nakładania się na rozmiary liposomów. Typowe jest obserwowanie średnic większych niż 30 nm podczas korzystania z analizy DLS ze względu na znaną tendencję tego instrumentu do większych cząstek¹². Natężenie rozproszenia światła od dużych i małych cząstek jest zbierane jednocześnie z jednej metody detekcji, a zatem trudniej jest rozdzielić liposomy w zawiesinie¹². Pomimo tego instrumentalnego ograniczenia, krzywa kalibracyjna opisuje korelację niemal liniową.

NTA to nowa technologia, która mierzy wielkość każdej cząstki na podstawie bezpośrednich obserwacji dyfuzji w ciekłym ośrodku, niezależnie od indeksu refrakcji cząstek lub gęstości. Ta technika o wysokiej rozdzielczości może być wykorzystana do uzupełnienia pomiaru liposomów za pomocą DLS. NTA zarejestrowała średnice 95 ± 48 i 356 ± 51 nm, do kalibracji użyto dwóch roztworów polistyrenu 100 nm i 400 nm. Zaobserwowano, że roztwory lipidów o długości fali 30 nm i 100 nm mają bardziej porównywalną średnicę w stosunku do DLS, jak pokazano na rysunku 3, dając średnie rozmiary 29 ± 14, 95 ± 17 i 359 ± 73 nm. NTA może być bardziej ogólną techniką charakterystyki do ilościowego określania mikroskopijnych cząstek, ponieważ jej czułość pozwala na pomiar cząstek o długości 50 - 1000 nm. Krzywa kalibracyjna pokazuje liniową korelację między porami membrany poliwęglanowej a zarejestrowaną średnicą NTA.

Rozmiary liposomów Próg wykrywalności Oczekiwana minimalna wielkość cząstek (nm) 30 nm 11 Rozdział 30 100 nm 11 100 szt. 400 nm 21 400 szt.

Tabela 1. Parametry Nanosight.

Rysunek 1. Schemat blokowy metody wytłaczania, opisujący, w jaki sposób ciśnienie i przepływ azotu kontrolują jednorodność różnych średnic liposomów. Po uwodnieniu liposomów pęcherzyki jednowarstwowe o różnych rozmiarach są wytłaczane przez różne pory filtra membranowego z poliwęglanu pod różnymi ciśnieniami.

Rysunek 2. Dane dynamicznego rozpraszania światła (DLS) opisujące ilościowe rozmiary liposomów po wytłaczaniu. (a) Przedstawiono wykresy słupkowe opisujące średnice trzech próbek liposomów. Jako odniesienie użyto wzorca kalibracyjnego kulek polistyrenowych (PS) o długości fali 50 nm. Średnie średnice liposomów są wskazane powyżej słupka dla każdej próbki. Oś x opisuje rozmiary porów, przez które wytłaczano roztwory. Oś y opisuje średnicę zarejestrowaną przez DLS. Chociaż rozmiary 30 nm i 100 nm rejestrowały wartości wyższe niż ich rozmiary porów, podczas gdy większe rozmiary 400 nm rejestrowały nieco niższy rozmiar, krzywa kalibracyjna (b) pokazuje korelację prawie liniową, gdzie oś x wyraża rozmiary porów membrany poliwęglanowej, a oś y opisuje zarejestrowaną średnicę liposomu przez DLS.

Rysunek 3. Dane Nanoparticle Tracking Analysis (NTA) opisujące rozmiary liposomów po wytłaczaniu. (a) Wykresy słupkowe reprezentują średnicę każdej próbki liposomowej. Oś x opisuje rozmiary porów, przez które wytłaczano roztwory. Oś y opisuje średnicę rozmiaru zarejestrowaną przez NTA. Średnie średnice liposomów są oznaczone nad każdą próbką. (b) Krzywa kalibracyjna NTA wykazuje bardziej liniową korelację niż krzywa kalibracyjna DLS między wielkościami porów membrany filtracyjnej a zarejestrowaną średnicą. Oś x opisuje rozmiary porów membrany poliwęglanowej. Oś y opisuje zarejestrowaną średnicę liposomu przez NTA.

Rysunek 4. Obrazy z mikroskopii elektronowej (TEM) z transmisją barwienia ujemnego przedstawiające każdy rozmiar liposomu (500 μM), po którym następuje ekstruzja. Siatki z siatki węglowej Formvar zostały wyładowane ujemnie przed barwieniem próbki, przy czym 1% octan uranylu w wodzie użyto do barwienia próbek przed suszeniem i obrazowaniem w powiększeniu 34 000×. Rozmiary 30, 100 i 400 nm wyraźnie się od siebie różnią. Powiększenie ustawiono na 25 000×. Podziałka odpowiada 0,5 μm.

Rysunek 5. Przeprowadzono eksperyment z trzema rozmiarami liposomów. Dynamiczne rozpraszanie światła (DLS) mierzono dla każdego roztworu liposomowego bezpośrednio po ekstruzji. Wszystkie roztwory liposomów przechowywano przez noc w temperaturze 4 °C. Ich średnice zostały zarejestrowane przez DLS po całonocnej inkubacji. Po 16-godzinnym okresie inkubacji zaobserwowano niewielkie lub żadne zmiany.

Dyskusja

Korzystając z ekstrudera Avestin Liposofast LF-50, zademonstrowaliśmy, w jaki sposób za pomocą systemu kontrolowanego ciśnieniem przygotowuje się małe, syntetyczne liposomy. Należy zauważyć, że pęcherzyki wieloblaszkowe tworzą się spontanicznie po uwodnieniu liposomów, co może prowadzić do produkcji mniejszych nanocząstek. Te małe pęcherzyki wielopłytkowe nieuchronnie przepływają przez większy rozmiar porów membrany poliwęglanowej, powodując niejednorodność w roztworach pęcherzyków jednowarstwowych wytwarzanych przez duż...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Chloroform	Sigma-Aldrich	02432-25ML	95% stabilizatory
Wysokiej jakości metanol	Sigma-Aldrich	179337-4L
Wytłaczarka Liposofast LF-50	Avestin, Inc.
Fosfolipidy	Avanti Polar Lipids
Poliwęglanowe pory	Avestin, Inc.		średnicy 25 mm
PE	Avestin, Inc.	230600	Średnica 25 mm