Metoda ekstruzji z kontrolowanym stałym ciśnieniem do przygotowania nano-rozmiarowych pęcherzyków lipidowych

Podsumowanie

Niniejszy protokół opisuje metodę ekstruzji służącą do przygotowania pęcherzyków lipidowych o rozmiarach submikronowych i wysokim stopniu jednorodności. Metoda ta wykorzystuje system z kontrolą ciśnienia i regulowanym przepływem azotu do przygotowania liposomów. W opracowaniu przedstawiono przygotowanie lipidów^1,2, ekstruzję liposomów oraz charakterystykę ich rozmiaru.

Streszczenie

Liposomy to sztucznie przygotowane pęcherzyki składające się z naturalnych i syntetycznych fosfolipidów, które są powszechnie wykorzystywane jako platformy naśladujące błony komórkowe do badania oddziaływań białko-białko i białko-lipid³, monitorowania dostarczania leków^4,5 oraz enkapsulacji⁴. Fosfolipidy naturalnie tworzą zakrzywione dwuwarstwy lipidowe, co odróżnia je od miceli.⁶ Liposomy są tradycyjnie klasyfikowane według rozmiaru i liczby dwuwarstw, tj. duże pęcherzyki jednowarstwowe (LUVs), małe pęcherzyki jednowarstwowe (SUVs) oraz pęcherzyki wielowarstwowe (MLVs)⁷. W szczególności przygotowanie jednorodnych liposomów o różnych rozmiarach jest istotne dla badania zakrzywienia błony, które odgrywa kluczową rolę w sygnalizacji komórkowej, endocytozie i egzocytozie, fuzji błon oraz transporcie białek⁸. Kilka grup badawczych analizuje, w jaki sposób białka są wykorzystywane do modulowania procesów związanych z zakrzywieniem błony i w związku z tym przygotowuje liposomy o średnicach <100 - 400 nm, aby badać ich wpływ na funkcje komórkowe³. Inne koncentrują się na enkapsulacji leków w liposomach, badając je jako nośniki służące do transportu i dostarczania interesującego leku⁹. Enkapsulację leku można osiągnąć, jak wykazano, podczas tworzenia liposomów⁹. Nasz etap ekstruzji nie powinien wpływać na enkapsulowany lek z dwóch powodów: (1) enkapsulacja leku powinna zostać przeprowadzona przed tym etapem i (2) liposomy powinny zachować swoją naturalną stabilność biofizyczną, bezpiecznie przenosząc lek w wodnistym rdzeniu. Cele badawcze te dodatkowo wskazują na potrzebę zoptymalizowanej metody projektowania stabilnych submikronowych pęcherzyków lipidowych.

Niemniej jednak, obecne technologie przygotowywania liposomów (sonikacja¹⁰, zamrażanie i rozmrażanie¹⁰, sedymentacja) nie pozwalają na otrzymywanie liposomów o silnie zakrzywionej powierzchni (t.j. średnicy <100 nm) z wysoką powtarzalnością i wydajnością^10,5, co ogranicza badania biofizyczne w rozwijającej się dziedzinie detekcji zakrzywienia błon. W niniejszej pracy przedstawiamy niezawodną metodę przygotowania różnych biologicznie istotnych liposomów.

Ręczna ekstruzja przy użyciu strzykawek szczelnych dla gazów i membran poliwęglanowych^10,5 jest powszechną praktyką, jednak przy rozmiarach porów <100 nm często obserwuje się heterogeniczność wynikającą ze zmienności przykładanego ciśnienia ręcznego. Zastosowaliśmy aparat do ekstruzji ze stałym, kontrolowanym ciśnieniem w celu przygotowania syntetycznych liposomów o średnicach w zakresie od 30 do 400 nm. Do ilościowego określenia rozmiarów liposomów, zgodnie z opisem w naszym protokole, wykorzystano dynamiczne rozpraszanie światła (DLS)¹⁰, mikroskopię elektronową¹¹ oraz analizę śledzenia nanocząsteczek (NTA)¹², stosując komercyjne kuleksy polistyrenowe (PS) jako wzorzec kalibracyjny. Zaobserwowano niemal liniową korelację pomiędzy zastosowanymi rozmiarami porów a eksperymentalnie określonymi rozmiarami liposomów, co wskazuje na wysoką precyzję naszej metody przygotowania liposomów z kontrolą ciśnienia. Ponadto wykazaliśmy, że ta metoda przygotowania pęcherzyków lipidowych jest ogólnie stosowalna, niezależnie od różnych rozmiarów liposomów. Na koniec, w badaniu przebiegu czasowego, wykazaliśmy, że przygotowane liposomy były stabilne przez maksymalnie 16 godzin. Poniżej przedstawiono reprezentatywny protokół przygotowania liposomów o rozmiarach nanometrycznych.

Protokół

1. Przygotowanie liposomów

1. Przygotować szklaną fiolkę o pojemności 20 mL z nakrętką wyłożoną teflonem.
2. Przed użyciem oczyścić całe szkło laboratoryjne i strzykawki chloroformem, aby zapobiec kontaminacji.
3. Przenieść 100 μL chloroformu czystości reagentowej do szklanej fiolki, używając szczelnej szklanej strzykawki o pojemności 250 μL.
4. Dodać 30 μL metanolu czystości reagentowej do tej samej szklanej fiolki, używając szczelnej szklanej strzykawki o pojemności 100 μL.
5. Aby przygotować 2 mM roztwór lipidowy o stosunku 7:1.5:1.5 fosfatydylocholiny (POPC): fosfatydyloetanolaminy (POPE): cholesterolu, przenieść 216 μL roztworu POPC o stężeniu 10 mg/mL, 42 μL roztworu POPE o stężeniu 10 mg/mL oraz 20 μL roztworu cholesterolu o stężeniu 11 mg/mL w CHCl₃ do szklanej fiolki o pojemności 20 mL.
6. Odparować rozpuszczalniki organiczne, przepływając powoli gaz argonu lub azotu, aż do momentu zaobserwowania cienkiej warstwy lipidów na dnie fiolki.
7. Umieścić otwartą szklaną fiolkę w desykanatorze próżniowym na co najmniej 30 minut, aby usunąć pozostałości rozpuszczalnika.
8. Przenieść 2 mL buforu, uprzednio przepuszczonego przez filtr 0,2 mikrona, do szklanej fiolki w celu hydratacji lipidów.
9. Inkubować mieszaninę w temperaturze 4 °C przez noc i zużyć w ciągu 48 godzin.

2. Zamrażanie i rozmrażanie: tylko dla liposomów o rozmiarach 30 – 100 nm

1. Zamrozić zawiesinę liposomów w ciekłym azocie przez 15 sekund.
2. Odmrozić zawiesinę liposomów, używając bloku grzejnego w temperaturze 42 °C przez około 3 minuty.
3. Powtórzyć kroki 2.1 i 2.2 łącznie 5 razy.

3. Ekstruzja

Postępuj zgodnie z instrukcjami firmy Avestin, aby prawidłowo złożyć ekstruder Liposofast LF-50, korzystając ze schematu instrumentu zamieszczonego w ich podręczniku.

1. Umieścić sitko wspierające z dużymi otworami (z otworami okrągłymi) w podstawie filtra wspierającego, a następnie okrągły spiekany dysk (bez otworów), jedną płytkę odpływową (o średnicy 25 mm) oraz jedną membranę poliwęglanową (o średnicy 25 mm).
2. Umieścić mały, czarny pierścień O-ring na membranie, aby przymocować ją do podstawy filtra wspierającego.
3. Zamocować górną część wytłaczarki filtra, dokręcając 4 śruby w 4 odpowiadających im otworach.
4. Zmontować jednostkę wytłaczarki filtra pod dużym cylindrem wytłaczarki. Dodać roztwór liposomów do cylindra. Na górze cylindra wytłaczarki umieścić w następującej kolejności: duży okrągły pierścień O-ring, wąską nasadkę, duży okrągły pierścień O-ring oraz okrągłą nasadkę.
5. Przyłączyć regulator gazu do górnej części cylindra wytłaczarki i zamknąć wszystkie zawory, w tym zawór bezpieczeństwa, aby zapobiec wyciekom powietrza. Pod jednostką filtra wytłaczarki umieścić szklaną fiolkę o pojemności 20 mL lub kolbę Erlenmeyera o pojemności 50 mL. Do regulatora podłączony jest zawór bezpieczeństwa, który zwolni ciśnienie, jeśli przekroczy ono 600 psi. Włączyć dopływ azotu i otworzyć zawór gazowy podłączony do wytłaczarki.
6. Zwiększyć ciśnienie azotu do 25 psi dla liposomów o rozmiarze 400 nm, 125 psi dla liposomów o rozmiarze 100 nm oraz 400-500 psi dla liposomów o rozmiarze 30 nm.
7. Obserwować zawiesinę liposomów podczas jej wypływania do naczynia pod wpływem ciśnienia azotu. Utrzymywać przepływ azotu do momentu, aż ciecz przestanie przechodzić przez filtr wytłaczarki do szklanej fiolki.

4. Analiza dynamicznego rozpraszania światła (DLS)

1. Przygotować 50 μL roztworu liposomów o stężeniu 20 μM.
2. Włączyć zasilanie oraz źródło światła lampy.
3. Uruchomić oprogramowanie DynaPro.
4. W oprogramowaniu wybrać model algorytmu MS/X do detekcji liposomów o rozmiarach 30 nm i 100 nm oraz model algorytmu MS800 do detekcji liposomów o rozmiarach >100 nm.
5. Połączyć się z urządzeniem.
6. Pipetować 14 μL próbki liposomów do kuwety kwarcowej i umieścić ją w uchwycie na kuwetę.
7. Nacisnąć start.
8. Nacisnąć stop po wykonaniu około 20 - 30 pomiarów.
9. Przeanalizować piki średniej średnicy liposomów zarejestrowane na histogramie.

5. Analiza śledzenia nanocząstek (NTA)

1. Przygotować 500 μL roztworu liposomów o stężeniu 0,1 μM.
2. Przepłukać komorę na próbkę wodą i etanolem.
3. Osuszyć komorę na próbkę ręcznikiem papierowym beztroskowym.
4. Włączyć źródło zasilania laser oraz komputer.
5. Nanieść 300 μL roztworu liposomów o stężeniu 0,1 μM do komory na próbkę.
6. Uruchomić sterownik temperatury oraz oprogramowanie do analizy śledzenia nanocząstek (Nanoparticle Tracking Analysis).
7. Nacisnąć przycisk Capture, aby włączyć laser.
8. Za pomocą regulacji poziomej i pionowej przesunąć stoлик i ustawić ostrość mikroskopu.
9. Ustawić żądaną temperaturę (20 °C) oraz czas rejestracji (co najmniej 30 sekund).
10. Nacisnąć przycisk Record, aby wykonać serię klatek obrazu cząsteczek liposomów przez określony czas. Przeanalizować piki odpowiadające średnicom liposomów na histogramie, który rejestruje ruch każdej cząsteczki.

6. Reprezentatywne wyniki

Schemat przedstawiający metodę ekstruzji zaprezentowano na Rysunku 1. Aby uzyskać optymalne wyniki, przygotowanie liposomów o średnicy 30 nm wymaga wysokiego ciśnienia rzędu ~ 500 psi, natomiast średnica 100 nm wymaga ciśnienia 125 psi w celu osiągnięcia szybkiej prędkości filtracji. W przypadku średnic 400 nm zaleca się niskie ciśnienie ~ 25 psi, aby uzyskać wolniejszą prędkość filtracji, co pozwala pęcherzykom na wydłużenie się i utworzenie większych, jednorodnych liposomów. Przeprowadziliśmy serię eksperymentów, aby określić optymalne ciśnienie dla produkcji powtarzalnych rozmiarów pęcherzyków submikronowych. Zmienialiśmy ciśnienie oraz liczbę przejść ekstruzyjnych przez filtry poliwęglanowe o rozmiarach porów 30, 100 i 400 nm, co pozwoliło ustalić odpowiednie ciśnienie dla każdego pożądanego rozmiaru. Dla porów 30 nm ciśnienie poniżej 500 psi zmniejszy prędkość przepływu, powodując wydłużenie i tym samym zwiększenie rozmiarów pęcherzyków. Dla porów 100 nm stały przepływ uzyskano przy 125 psi. W przypadku porów 400 nm niskie ciśnienie (25 psi) pozwala pęcherzykom wydłużyć się do większych rozmiarów. Powolny, kroplowy przepływ filtracyjny jest optymalny dla tworzenia większych pęcherzyków submikronowych¹³.

Wykonaliśmy DLS w celu określenia rozmiarów liposomów przeciskanych przez membrany o trzech różnych średnicach, tj. 30, 100 i 400 nm. DLS to uznana metoda, która polega na pomiarze światła rozproszonego w celu wyznaczenia średnicy cząstek. Nawodnione liposomy o stężeniu 2 mM przeciskaliśmy przez membranę poliwęglanową 30 nm pod ciśnieniem 500 psi (5 przejść przez pory filtra), membranę poliwęglanową 100 nm pod ciśnieniem 125 psi (5 przejść przez pory filtra) oraz membranę poliwęglanową 400 nm pod ciśnieniem 25 psi (2 przejścia przez pory filtra). Średnice liposomów zmierzone metodą DLS dla rozmiarów porów 30, 100 i 400 nm wyniosły odpowiednio 66 ± 28, 138 ±18 i 360 ± 25 nm (Rysunek 2). Jako standard kalibracyjny wykorzystano zawiesinę kulek polistyrenowych o średnicy 50 nm, co przedstawiono na Rysunku 2, gdzie odnotowano średnicę 47 ± 16 nm. Procent polidyspersyjności wskazuje na brak nakładania się rozmiarów liposomów. W analizie DLS typowe jest obserwowanie średnic większych niż 30 nm ze względu na znaną tendencję tego instrumentu do faworyzowania większych cząstek¹². Intensywności rozproszenia światła z dużych i małych cząstek są zbierane jednocześnie za pomocą jednej metody detekcji, co utrudnia rozdzielenie liposomów w zawiesinie¹². Pomimo tego ograniczenia instrumentalnego, krzywa kalibracyjna wykazuje niemal liniową korelację.

NTA to nowa technologia, która mierzy rozmiar każdej cząstki na podstawie bezpośrednich obserwacji dyfuzji w medium ciekłym, niezależnie od współczynnika załamania światła lub gęstości cząstki. Ta technika o wysokiej rozdzielczości może być stosowana jako uzupełnienie pomiaru liposomów za pomocą DLS. NTA zarejestrowała średnice 95 ± 48 oraz 356 ± 51 nm; do kalibracji wykorzystano dwa roztwory polistyrenu o rozmiarach 100 nm i 400 nm. Zaobserwowano, że roztwory lipidowe o rozmiarach 30 nm i 100 nm mają średnice bardziej porównywalne z wynikami DLS, co pokazano na Rysunku 3, dając średnie rozmiary 29 ± 14, 95 ± 17 oraz 359 ± 73 nm. NTA może być bardziej uniwersalną techniką charakteryzacji służącą do ilościowego oznaczania cząstek mikroskopowych, ponieważ jej czułość pozwala na pomiar cząstek o rozmiarach od 50 do 1000 nm. Krzywa kalibracyjna wykazuje liniową korelację między porami membrany z poliwęglanu a zarejestrowaną średnicą NTA.

Rozmiary liposomów	Próg detekcji	Oczekiwany minimalny rozmiar cząsteczek (nm)
30 nm	11	30
100 nm	11	100
400 nm	21	400

Tabela 1. Parametry Nanosight.

Rysunek 1. Schemat metody ekstruzji, opisujący wpływ ciśnienia i przepływu azotu na homogeniczność liposomów o różnych średnicach. Po hydratacji liposomów, pęcherzyki jednowarstwowe o różnych rozmiarach są ekstrudowane przez pory filtrów z membran poliwęglanowych o różnych wielkościach przy różnym ciśnieniu.

Rysunek 2. Dane dynamicznego rozpraszania światła (DLS) opisujące ilościowe rozmiary liposomów po ekstruzji. (a) Przedstawiono wykresy słupkowe opisujące średnice trzech próbek liposomów. Jako odnośnik wykorzystano wzorzec kalibracyjny w postaci kulek polistyrenowych (PS) o rozmiarze 50 nm. Średnie średnice liposomów są wskazane nad słupkiem dla każdej próbki. Oś x opisuje wielkości porów, przez które ekstrudowano roztwory. Oś y opisuje średnicę zarejestrowaną przez DLS. Chociaż dla rozmiarów 30 nm i 100 nm zarejestrowano wartości wyższe niż wielkość porów, a dla największego rozmiaru 400 nm zarejestrowano wartość nieco niższą, krzywa kalibracyjna (b) wykazuje niemal liniową korelację, gdzie oś x wyraża wielkości porów membrany poliwęglanowej, a oś y opisuje średnicę liposomów zarejestrowaną przez DLS.

Rysunek 3. Dane z analizy śledzenia nanocząstek (NTA) opisujące rozmiary liposomów po ekstruzji. (a) Wykresy słupkowe przedstawiają średnicę każdej próbki liposomów. Oś X opisuje wielkość porów, przez które ekstrudowano roztwory. Oś Y opisuje średnicę rozmiaru zarejestrowaną przez NTA. Średnie średnice liposomów są oznaczone nad każdą próbką. (b) Krzywa kalibracyjna NTA wykazuje bardziej liniową korelację między wielkością porów membrany filtracyjnej a zarejestrowaną średnicą niż krzywa kalibracyjna DLS. Oś X opisuje wielkość porów membrany poliwęglanowej. Oś Y opisuje średnicę liposomów zarejestrowaną przez NTA.

Rycina 4. Obrazy z transmisyjnej mikroskopii elektronowej (TEM) z barwieniem negatywowym, przedstawiające każdą wielkość liposomów (500 μM) po ekstruzji. Siatki z Formvaru na podłożu węglowym zostały rozładowane negatywnie przed barwieniem próbek, do czego użyto 1% octanu uranylu w wodzie, a następnie próbki wysuszono i obrazowano przy powiększeniu 34 000×. Wielkości 30, 100 i 400 nm są wyraźnie od siebie odróżnialne. Powiększenie ustawiono na 25 000×. Pasek skali odpowiada 0,5 μm.

Rysunek 5. Przeprowadzono eksperyment w zależności od czasu dla trzech rozmiarów liposomów. Dynamiczne rozpraszanie światła (DLS) mierzono dla każdego roztworu liposomów bezpośrednio po ekstruzji. Wszystkie roztwory liposomów przechowywano w 4 °C przez noc. Ich średnice zarejestrowano za pomocą DLS po inkubacji przez noc. Po 16-godzinnym okresie inkubacji nie zaobserwowano niemal żadnych zmian.

Dyskusja

Wykorzystując ekstruder Avestin Liposofast LF-50, zaprezentowaliśmy sposób przygotowania syntetycznych liposomów o małych rozmiarach za pomocą systemu z kontrolowanym ciśnieniem. Należy zauważyć, że pęcherzyki wielowarstwowe tworzą się samoistnie po hydratacji liposomów, co może prowadzić do powstania mniejszych nanocząstek. Te małe pęcherzyki wielowarstwowe nieuchronnie przenikną przez pory membrany poliwęglanowej o większym rozmiarze, co spowoduje heterogeniczność roztworów pęcherzyków jednowarstwowych otrzymywanych pr...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Chloroform	Sigma-Aldrich	02432-25ML	95% stabilizatory
Metanol wysokiej czystości	Sigma-Aldrich	179337-4L
Ekstruder Liposofast LF-50	Avestin, Inc.
Fosfolipidy	Avanti Polar Lipids
Membrany poliwęglanowe	Avestin, Inc.		średnica 25 mm
Tarcze odpływowe PE	Avestin, Inc.	230600	średnica 25 mm