Opisano szybką metodę badania interakcji oraz wpływu na mechanizmy molekularne związane z obecnością przeciwciał w środowisku wewnątrzkomórkowym. Metoda ta polega na transfekcji przeciwciał do żywych komórek przy użyciu tworzenia kompleksów niekowalencyjnych w oparciu o formulację lipidową. Technika ta jest możliwa do zastosowania w unieśmiertelnionych liniach komórkowych oraz komórkach pierwotnych.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Transfekcja przeciwciał do neuronów jako narzędzie do badania patogenezy chorób
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Przeciwciała umożliwiają uzyskanie nowej wiedzy na temat różnych zjawisk zachodzących w układach żywych. Zdolność do produkcji wysoce specyficznych przeciwciał przeciwko białkom docelowym pozwoliła na rozstrzygnięcie bardzo precyzyjnych pytań biologicznych. Co istotne, przeciwciała są zaangażowane w patogenezę szeregu chorób ludzkich, w tym tocznia rumieniowatego układowego (SLE), reumatoidalnego zapalenia stawów (RA), zespołów paraneoplastycznych, stwardnienia rozsianego (MS) oraz mielopatii towarzyszącej ludzkiemu limfotropowemu wirusowi T typu 1 (HTLV-1)/tropikalnej spastycznej paraparezy (HAM/TSP) 1-9. Sposób, w jaki przeciwciała wywołują chorobę, jest przedmiotem trwałych badań, a dane sugerują, że oddziaływania między przeciwciałami a różnymi cząsteczkami wewnątrzkomórkowymi prowadzą do stanu zapalnego, zaburzeń przekazywania sygnałów komórkowych oraz apoptozy 10. Wykazano, że pacjenci z MS i HAM/TSP wytwarzają autoprzeciwciała przeciwko wewnątrzkomórkowemu białku wiążącemu RNA, heterogennemu białku rybonukleoproteinowemu A1 (hnRNP A1) 3, 5-7, 9, 11. Niedawne dane wskazują, że przeciwciała przeciwko antygenom zarówno wewnątrzneuronalnym, jak i powierzchniowym są patogenne 3, 5-9, 11. Zatem procedura umożliwiająca badanie wewnątrzkomórkowych oddziaływań przeciwciało:białko dostarczyłaby cennych informacji na temat patogenezy chorób.
Geny są powszechnie transfekowane do pierwotnych komórek i linii komórkowych w kulturze, jednak transfekcja przeciwciał do komórek była utrudniona przez zmiany w strukturze przeciwciał lub niską wydajność transfekcji 12. Inne metody transfekcji obejmują transfekcję przeciwciał opartą na liposomach kationowych (składających się z DOTAP/DOPE) oraz polietylenoiminach (PEI); obie metody te doprowadziły do dziesięciokrotnego spadku transfekcji przeciwciał w porównaniu z grupami kontrolnymi 12. Metoda zastosowana w naszym badaniu jest podobna do metod opartych na lipidach kationowych i wykorzystuje mechanizm lipidowy do tworzenia kompleksów niekowalencyjnych z przeciwciałami poprzez oddziaływania elektrostatyczne i hydrofobowe 13. Wykorzystaliśmy odczynnik Ab-DeliverIN, który jest formulacją lipidową zdolną do wychwytywania przeciwciał poprzez niekowalencyjne oddziaływania elektrostatyczne i hydrofobowe oraz dostarczania ich do wnętrza komórek. W związku z tym wiązania chemiczne i genetyczne nie są konieczne do dostarczenia funkcjonalnych przeciwciał do żywych komórek. Metoda ta umożliwiła nam przeprowadzenie różnych eksperymentów z tropieniem przeciwciał i lokalizacją białek, a także analizy molekularnych następstw wewnątrzkomórkowych oddziaływań przeciwciało:białko 9.
W niniejszym protokole przedstawimy sposób szybkiej i powtarzalnej transfekcji przeciwciał do neuronów z wysoką wydajnością. Jako przykład wykorzystamy przeciwciała anty-hnRNP A1 oraz anty-IgG. W celu łatwej kwantyfikacji wydajności transfekcji zastosowano przeciwciała anty-hnRNP A1 znakowane Atto-550-NHS oraz IgG znakowane FITC. Atto550 NHS to nowy znacznik o wysokiej absorpcji molekularnej i wydajności kwantowej. Źródło wzbudzenia i filtry fluorescencyjne dla Atto550 są zbliżone do tych dla Cy3 (Ex. 556 Em. 578). Dodatkowo Atto550 charakteryzuje się wysoką fotostabilnością. IgG znakowane FITC posłużyło jako kontrola, aby wykazać, że metoda ta jest uniwersalna i niezależna od rodzaju barwnika. Podejście to oraz generowane za jego pomocą dane pomogą w zrozumieniu roli, jaką przeciwciała skierowane przeciwko wewnątrzkomórkowym antygenom docelowym mogą odgrywać w patogenezie ludzkich chorób.
Protokół
1. Znakowanie przeciwciał (Rysunek 1)
- Przygotować bufor NaHCO3 0,1 M:
- 8,4 g NaHCO3
- 29,2 g NaCl
- 1 liter H2O
- Dostosować pH buforu do wartości 8,4 za pomocą tego roztworu (10,6 g Na2CO3, 29,2 g NaCl, 1 liter H20).
- Dodać 35 μl Atto550 NHS do 70 μl przeciwciał anti-hnRNPA1 oraz 500 μl buforu NaHCO3 i inkubować w rotatorze przez 1 h w temperaturze pokojowej. Po godzinnej rotacji wprowadzić mieszaninę do dializatora i dializować w 2 litrach PBS przez noc.
- Następnego dnia skoncentrować zdializowane przeciwciała anti-hnRNPA1 znakowane Atto550 NHS, wykorzystując kolumnę wirową (Amicon Ultra 0,5).
- Po skoncentrowaniu przeciwciał anti-hnRNPA1 znakowanych Atto550 NHS, zmierzyć stężenie próbki za pomocą nanodropu.
2. Transfekcja przeciwciał (Rysunek 2)
- 24 godziny przed transfekcją wysiać 105 komórek/dołka w 500 μl pożywki Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM/F12+10% FBS+1% antybiotyku) na szkiełko z 8 dołkami. Konfluencja komórek powinna wynosić co najmniej 70%.
- Dwadzieścia cztery godziny po wysianiu dodać 2 μl odczynnika Ab-DeliverIN do probówki Eppendorfa.
- Następnie do tej samej probówki Eppendorfa dodać 2 μg przeciwciała anty-hnRNPA1 znakowanego Atto550 NHS (0,5 μg/μl) i inkubować przez 10-15 min w RT.
- Podczas inkubacji odessać pożywkę i dodać do komórek 394 μl świeżej pożywki DMEM.
Uwaga: Do jednej komory z nienaruszonymi komórkami dodaj 500 μl DMEM, aby służyła ona jako kontrola.
- Po inkubacji do mieszaniny przeciwciał należy dodać 100 μl DMEM, wymieszać poprzez pipetowanie w górę i w dół, a następnie dodać do komórek w DMEM, tak aby uzyskać całkowitą objętość 500 μl.
- Po 48 godz. od podania przeciwciał należy wymienić medium.
Uwaga: Protokół powtórzono z użyciem rIgG znakowanych FITC jako kontroli pozytywnej.
3. Obrazowanie żywych i utrwalonych komórek w celu określenia wydajności
- Obrazuj żywe komórki po 48 h, używając filtra Cy3 w mikroskopie fluorescencyjnym, aby zobrazować przeciwciała znakowane Atto550 NHS po transfekcji.
- Po zakończeniu obrazowania na żywo odessaj medium i utrwal komórki.
- Po odessaniu medium potraktuj komórki 0,4% Paraformaldehydem przez 15 min w temperaturze pokojowej. Przemyj komórki 4 x 5 min roztworem PBS. Następnie zamknij preparaty w medium montażowym zawierającym odczynik DAPI i przymocuj szkiełko nakrywkę. Zmierz wydajność transfekcji utrwalonych komórek za pomocą oprogramowania Axiovision. Jeśli oprogramowanie Axiovision nie jest dostępne, po prostu policz ręcznie zdarzenia na obrazie i wprowadź wyniki do obliczeń w punkcie 3.7. Alternatywnie do tych obliczeń można wykorzystać oprogramowanie ImageJ.
- Najpierw użyj pomiaru „Events”, aby policzyć całkowitą liczbę komórek na wybranym obrazie przy powiększeniu 20x.
- Następnie użyj pomiaru „Events”, aby policzyć komórki, które nie zostały pomyślnie przetransfekowane przeciwciałami na tym samym obrazie przy powiększeniu 20x.
- Aby uzyskać dostęp do zmierzonych „Events” w formacie przypominającym arkusz Excel, kliknij „Properties”, wybierz zakładkę „Measurement” i kliknij „As Table”, aby wyświetlić wyniki w formie tabeli.
- Na koniec wykonaj poniższe obliczenia, aby określić wydajność transfekcji poprzez porównanie dwóch wcześniej zmierzonych wartości: ((Całkowita liczba komórek - Komórki nietransfekowane) / Całkowita liczba komórek) x 100 = Wydajność transfekcji.
4. Reprezentatywne wyniki
Obrazy na żywo neuronów niezatransfekowanych (Rysunek 3A) w porównaniu do neuronów zatransfekowanych (Rysunek 3B) wykazują, że znakowanie przeciwciałami (kolor czerwony lub zielony na każdym rysunku) jest wyraźnie widoczne wewnątrz komórek (Rysunek 3B, C, D). Po odessaniu i przemyciu medium w celu usunięcia przeciwciał znajdujących się między komórkami lub przylegających do ich powierzchni, znakowane przeciwciała nadal pozostają wewnątrz neuronów (Rysunek 3C, D). Aby obliczyć wydajność transfekcji, należy użyć oprogramowania Axiovision do wyznaczenia całkowitej liczby komórek w porównaniu do komórek, które nie zostały pomyślnie zatransfekowane. Wartości te wprowadzono do wzoru na wydajność transfekcji, aby uzyskać wydajność transfekcji jako procent całkowitej liczby komórek (Rysunek 4).
Rysunek 1. Schemat blokowy procedur stosowanych do znakowania przeciwciał za pomocą estru Atto 550 NHS, a następnie kroków niezbędnych do zagęszczenia znakowanych przeciwciał. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększony rysunek.
Rysunek 2. Schemat procedur wykorzystywanych do transfekcji znakowanych przeciwciał do żywych komórek w hodowli. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większy rysunek.
Rycina 3. Obrazy żywych neuronów po 48 h od transfekcji.
Rycina 4. Obrazy po utrwaleniu i przemyciu z policzonymi zdarzeniami w celu określenia wydajności transfekcji.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
W celu weryfikacji hipotez dotyczących konkretnych cząsteczek i ich ekspresji, do komórek powszechnie transfekuje się geny i inne wektory. Unikalnym aspektem tej procedury jest możliwość łatwej transfekcji przeciwciał do komórek docelowych. Przeprowadziliśmy tę metodę w pięciu oddzielnych eksperymentach, każdy w dwóch powtórzeniach. Wyniki wydajności transfekcji były podobne we wszystkich eksperymentach. Co istotne, metoda ta umożliwia wprowadzenie przeciwciał do komórki bez zmiany ich struktury lub funkcji. Ponadto, dzi...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Nie zgłoszono żadnych konfliktów interesów.
Podziękowania
Niniejsza praca jest wspierana przez Office of Research and Development, Medical Research Service, Department of Veterans Affairs. Badanie to zostało sfinansowane z grantu VA Merit Review Award (przyznanego MCL) oraz z funduszu Multiple Sclerosis Research Fund Uniwersytetu Tennessee Health Science Center.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Mikroskop fluorescencyjny AxioObserver A1 | Zeiss | ||
| Axiovision wersja 4.2 | Zeiss | ||
| Przeciwciało anty-rhnRNPA1 | Abcam | Ab4791 | |
| Przeciwciało anty-rIgG znakowane FITC | OZ Biosciences | AI20100 | |
| Atto550 NHS ester | Sigma | 92835 | |
| Ab-DeliverIN | OZ Biosciences | AI20100 | |
| DMEM/F12 +10% FBS+1% antybiotyków | Gibco | 11320-033 | |
| Slajdy hodowlane 8-dołkowe z poli-D-lizyną | BD | 354632 | |
| Rotator wielofunkcyjny | Scientific Industries Inc | Model 151 | |
| Medium montażowe z DAPI | Millipore | S7113 | |
| PBS | Ambion | 9626 | |
| Dializator | Thermo Fisher Scientific | 66380 | |
| Amicon Ultra-0.5 | Millipore | UFC501096 | |
| Paraformaldehyd (roztwór 4%) | Electron Microscopy Sciences | ||
| Nano-Drop | Thermo Fisher Scientific |
Bibliografia
- Burkhardt, H. Epitope-specific recognition of type II collagen by rheumatoid arthritis antibodies is shared with recognition by antibodies that are arthritogenic in collagen-induced arthritis in the mouse. Arthritis Rheum. 46, 2339-2348 (2002).
- Chester, K. A. Lambert-Eaton syndrome antibodies: reaction with membranes from a small cell lung cancer xenograft. J. Neuroimmunol. 18, 97-104 (1988).
- Lee, S. M. HTLV-1 induced molecular mimicry in neurological disease. Curr. Top Microbiol. Immunol. 29, 125-136 (2005).
- Reeves, W. H. Systemic lupus erythematosus. Antibodies to DNA, DNA-binding proteins, and histones. Rheum. Dis. Clin. North Am. 20, 1-28 (1994).
- Levin, M. C. Autoimmunity due to molecular mimicry as a cause of neurological disease. Nat. Med. 8, 509-513 (2002).
- Lee, S. M. Autoantibodies that recognize functional domains of hnRNPA1 implicate molecular mimicry in the pathogenesis of neurological disease. Neurosci. Lett. 401, 188-193 (2006).
- Kalume, F. Molecular mimicry: cross-reactive antibodies from patients with immune-mediated neurologic disease inhibit neuronal firing. J. Neurosci. Res. 77, 82-89 (2004).
- Levin, M. C. Cross-reactivity between immunodominant human T lymphotropic virus type I tax and neurons: implications for molecular mimicry. J. Infect. Dis. 186, 1514-1517 (2002).
- Lee, S. A potential link between autoimmunity and neurodegeneration in immune-mediated neurological disease. J. Neuroimmunol. 235, 56-69 (2011).
- Smeenk, R. J. Antinuclear antibodies: cause of disease or caused by disease. Rheumatology (Oxford). 39, 581-584 (2000).
- Lee, S. Post-translational glycosylation of target proteins implicate molecular mimicry in the pathogenesis of HTLV-1 associated neurological disease. J. Neuroimmunol. 204, 140-148 (2008).
- Reisinger, H. Serum-free transfection of CHO cells with chemically defined transfection systems and investigation of their potential for transient and stable transfection. Cytotechnology. 60, 115-123 (2009).
- Weill, C. O., Biri, S., Erbacher, P. Cationic lipid-mediated intracellular delivery of antibodies into live cells. Biotechniques. 44, Pvii-Pxi (2008).
- Radic, M. Z. Heterogeneous nuclear ribonucleoprotein P2 is an autoantibody target in mice deficient for Mer, Axl, and Tyro3 receptor tyrosine kinases. J. Immunol. 176, 68-74 (2006).
- Vincent, A. Successful 'passive transfer' of paraneoplastic stiff person syndrome with antibodies to an intracellular antigen. Brain. 133, 3164-3165 (2010).
- Vincent, A. Stiff, twitchy or wobbly: are GAD antibodies pathogenic. Brain. 131 (Pt 10), 2536-2537 (2008).
- Magrys, A. The role of anti-alpha-enolase autoantibodies in pathogenicity of autoimmune-mediated retinopathy. J. Clin. Immunol. 27, 181-192 (2007).
- Geis, C. Stiff person syndrome-associated autoantibodies to amphiphysin mediate reduced GABAergic inhibition. Brain. 133, 3166-3180 (2010).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
