Model szczura o niskiej śmiertelności do oceny opóźnionego naczyniowego skurczu mózgu po eksperymentalnym krwotoku podpółczepkowym

Podsumowanie

Aneuryzmalny krwotok podpajęczynówkowy (SAH) to krwawienie do przestrzeni podpajęczynówkowej następujące po pęknięciu tętniaka. Choć zapadalność i śmiertelność z powodu tego zdarzenia spadły dzięki lepszym metodom leczenia, ryzyko wystąpienia skurczu naczyń po krwotoku podpajęczynówkowym pozostaje na tym samym poziomie, co kilka lat temu. Znaczenie opracowania kompleksowego i powtarzalnego modelu zwierzęcego w celu zidentyfikowania zdarzeń inicjujących mózgowy skurcz naczyń było przedmiotem badań od pierwszego wykorzystania szczurów w eksperymentalnym modelu skurczu naczyń w 1979 roku przez Barry et al. Wczesne prace na szczurach wykazały, że pojedynczy wtrysk autologicznej krwi do cysterny wielkiej prowadzi do ostrego (w ciągu kilku minut), ale nie do opóźnionego mózgowego skurczu naczyń ^{3, 6, 14}. W niniejszej pracy opisujemy model SAH u szczurów o niskiej śmiertelności, który prowadzi do powtarzalnego opóźnionego skurczu naczyń.

Streszczenie

Cel: Scharakteryzowanie i opracowanie powtarzalnego modelu wykazującego opóźniony skurcz naczyń mózgowych po pęknięciu tętniaka i krwawieniu podpajęczynówkowym (SAH) u szczurów, w celu zidentyfikowania zdarzeń inicjujących, zmian patofizjologicznych oraz potencjalnych celów terapeutycznych.

Metody: Dwudziestu osiem samców szczurów Sprague-Dawley (250 - 300 g) przydzielono losowo do jednej z dwóch grup – SAH lub grupy kontrolnej z solą fizjologiczną. Krwawienie podpajęczynówkowe u szczurów w grupie SAH (n=15) wywołano poprzez podwójny wtrysk autologicznej krwi do cysterny wielkiej (cisterna magna) w odstępie 48 hr. Analogicznie, w grupie kontrolnej wstrzyknięto sól fizjologiczną (n=13) do cysterny wielkiej. Szczury uśpiono w piątym dniu po drugim wtrysku krwi, a mózgi zabezpieczono do analizy histologicznej. Stopień skurczu naczyń mierzono na podstawie przekrojów tętnicy podstawnej, obliczając wewnętrzną powierzchnię przekroju poprzecznego światła naczynia przy użyciu oprogramowania NIH Image-J. Istotność statystyczną sprawdzono za pomocą analizy Tukey/Kramer.

Wyniki: Po analizie przekrojów histologicznych stwierdzono, że pole powierzchni przekroju poprzecznego światła tętnicy podstawnej było mniejsze w grupie SAH niż w grupie z solą fizjologiczną, co jest zgodne z wystąpieniem skurczu naczyń mózgowych w pierwszej grupie. W grupie SAH wewnętrzna powierzchnia tętnicy podstawnej (.056 μm ± 3) była istotnie mniejsza z powodu skurczu naczyń pięć dni po drugim wtryskaniu krwi (siedem dni po pierwszym wtryskaniu krwi) w porównaniu z grupą kontrolną z solą fizjologiczną, w której powierzchnia wewnętrzna wynosiła (.069 ± 3; p=0.004). Nie odnotowano śmiertelności z powodu skurczu naczyń mózgowych.

Wniosek: Szczurzy model podwójnego SAH indukuje łagodny, przeżywalny skurcz naczyń tętnicy podstawnej, który może być wykorzystany do badania mechanizmów patofizjologicznych skurczu naczyń mózgowych w modelu małych zwierząt. Niski i akceptowalny wskaźnik śmiertelności jest istotnym kryterium, które musi zostać spełnione w idealnym zwierzęcym modelu SAH, aby można było wyjaśnić mechanizmy skurczu naczyń ^{7, 8}. Możliwe są dalsze modyfikacje modelu w celu zwiększenia nasilenia skurczu naczyń oraz przeprowadzenia badań neurologicznych.

Protokół

1. Operacja szczura w modelu SAH z iniekcją 0,15 ml autologicznej krwi tętniczej

1. Szczura znieczula się, podając 0,1 mg/kg koktajlu ketaminy/ksylazyny dla gryzoni, i pozostawia na 5 min.
2. Odpowiednie znieczulenie potwierdza się poprzez zniesienie odruchu kończyn tylnych.
3. Za pomocą elektronicznej golarki ogala się obszar od szyi do nosa w okolicy podpotylicznej.
4. Zwierzę ułożono na plecach na stole operacyjnym, a ogon przemyto betadyną, aby zapewnić sterylność nacięcia.
5. Wykonuje się proste, 1 cm nacięcie w linii środkowej na brzusznej stronie ogona.
6. Precyzyjnie rozszerza się nacięcie, aż do zidentyfikowania i wyizolowania tętnicy ogonowej.
7. Za pomocą sterylnego cewnika o rozmiarze 26G kaniuluje się tętnicę ogonową i pobiera 0,15 ml krwi tętniczej do strzykawki.
8. Miejsce nacięcia owija się sterylną gazą w celu zapewnienia hemostazy, a następnie stosuje się klej wetbond do zamknięcia rany.
9. Szczura obraca się na brzuch na stole i przemywa betadyną ogoloną okolicę podpotyliczną.
10. Dostęp do cysterny wielkiej (cisterna magna) uzyskuje się poprzez pionowe nacięcie w linii środkowej.
11. Po zidentyfikowaniu cysterny wielkiej wprowadza się do niej igłę o rozmiarze 25G i pobiera 0,15 ml płynu mózgowo-rdzeniowego (CSF) do strzykawki, aby zapobiec zwiększeniu ciśnienia wewnątrzczaszkowego po wstrzyknięciu autologicznej krwi.
12. Następnie 0,15 ml krwi pobranej z tętnicy ogonowej wstrzykuje się powoli do cysterny wielkiej.
13. Igłę pozostawia się w miejscu wkłucia przez 30 sec, aby zapewnić krzepnięcie w przestrzeni podpajęczynówkowej, a następnie ostrożnie wyjmuje.
14. Zapewnia się hemostazę i zamyka nacięcie za pomocą staplera chirurgicznego.
15. Zwierzę ułożono na brzuchu na powierzchni grzewczej w pozycji z głową obniżoną o 20 ° przez 20 min, aby umożliwić krzepnięcie krwi w cysternach wokół tętnicy podstawnej.
16. Kroki od 1.1 do 1.15 powtarza się podczas drugiej operacji w odstępie 48 hr.

2. Operacja szczura w modelu SAH u osobnika wstrzykniętego 0,15 ml soli fizjologicznej

1. Szczura poddaje się znieczuleniu za pomocą koktajlu dla gryzoni Ketamine/Xylazine w dawce 0,1 mg/kg i pozostawia się go na 5 min.
2. Odpowiedniość znieczulenia potwierdza się poprzez zmniejszenie odruchu kończyn tylnych.
3. Za pomocą elektronicznej maszynki do golenia usuwa się sierść z obszaru od szyi do nosa wokół regionu podpotylicznego.
4. Zwierzę kładzie się na plecach na stole operacyjnym, a ogon przemywa się betadyną, aby zapewnić sterylność nacięcia.
5. Na brzusznej stronie ogona wykonuje się proste nacięcie w linii środkowej o długości 1 cm.
6. Dysekcję rozszerza się do momentu zidentyfikowania i wyizolowania tętnicy ogonowej.
7. Za pomocą sterylnego cewnika 26G kaniuluje się tętnicę ogonową i pobiera 0,15 ml krwi tętniczej do strzykawki.
8. Miejsce nacięcia owija się sterylną gazą, aby zapewnić hemostazę, a następnie nakłada się vetbond w celu zamknięcia rany.
9. Szczura obraca się na brzuch na stole, a ogoloną okolicę nad regionem podpotylicznym smaruje betadyną.
10. Za pomocą pionowego nacięcia w linii środkowej uzyskuje się dostęp do cysterny wielkiej (cisterna magna).
11. Po zidentyfikowaniu cysterny wielkiej wprowadza się do niej igłę 25G, pobiera 0,15 ml płynu mózgowo-rdzeniowego do strzykawki i przechowuje próbkę.
12. Następnie do cysterny wielkiej powoli wstrzykuje się 0,15 ml soli fizjologicznej (37 °C).
13. Igłę pozostawia się w miejscu przez 30 sec, a następnie ostrożnie wyjmuje.
14. Zapewnia się hemostazę i zamyka nacięcie za pomocą zszywacza chirurgicznego.
15. Zwierzę kładzie się teraz na brzuchu na powierzchni grzewczej z głową skierowaną w dół pod kątem 20 ° przez 20 min.
16. Kroki od 2.1 do 2.15 powtarza się podczas drugiej operacji w odstępie 48 hr.

3. Uśmiercenie szczura

1. W 5. dniu po drugim zabiegu szczury są uśmiercane poprzez perfuzję przez serce.
2. Szczurowi podaje się dawkę śmiertelną (0,2 ml/kg) preparatu Fatal Plus (VORTECH PHARMACEUTICALS LTD., DEARBORN, MI).
3. Przez pionowe nacięcie w linii środkowej uzyskano dostęp do jamy brzusznej i otwarto otrzewną.
4. Wykonano przednią torakotomię i odsłonięto serce.
5. Przy użyciu cewnika 26G podłączonego do roztworu buforu fosforanowego (PBS pH 7,4 w temperaturze 37 °C) zwierzę zostaje upuszczone z krwi, a następnie poddane perfuzji 4% paraformaldehydem.
6. Po upewnieniu się, że perfuzja przebiegła prawidłowo, przerywa się ją i przenosi szczura na stół do dekapitacji.
7. Po dekapitacji za pomocą kleszczy kostnych usuwa się czaszkę w celu wyjęcia mózgu.
8. Mózg oraz pień mózgu są ostrożnie wyjmowane z czaszki, umieszczane w 4% roztworze paraformaldehydu i przechowywane w temperaturze 4 °C przez 48 hr.

4. Przygotowanie przekrojów do oceny skurczu naczyń

1. Mózg szczura, który był zanurzony w 30% sacharozie przez 4 dni, przenosi się do kriotomu w celu wykonania przekrojów.
2. Po kriotekcji, przy użyciu kriotomu, wykonuje się przekroje o grubości 12 μM, przyjmując przednią dolną tętnicę móżdżkową (AICA) jako punkt wyjścia, aby zapewnić spójność między osobnikami.
3. Dla każdego zwierzęcia wykonuje się 20 przekrojów, kończąc na górnej tętnicy móżdżkowej (SCA).
4. Przekroje nanosi się na szkiełko przedmiotowe i ocenia pod kątem występowania skurczu naczyń za pomocą metod histologicznych.

Wyniki

W opisanych powyżej protokołach znajduje się kilka etapów, które w naszej ocenie wymagają dokładniejszej charakterystyki modelu niż ta, która została wcześniej opisana w literaturze. Tutaj skupiamy się na krokach niezbędnych do uzyskania powtarzalnego modelu skurczu naczyń mózgowych u małych zwierząt z niską śmiertelnością oraz na unikaniu potencjalnych błędów związanych z tym modelem, jeśli nie zostanie on przeprowadzony prawidłowo.

1. Pobieranie autologicznej krwi z tętnicy ogonowej:

Dyskusja

Naczelne, posiadając skład genetyczny i cechy anatomiczne bardziej zbliżone do ludzkich, dokładniej odwzorowują przebieg opóźnionego skurczu naczyń mózgowych i łatwiej poddają się nieinwazyjnemu obrazowaniu (MRI i angiografii) w celu monitorowania zmian tętniczych niż gryzonie ⁸. Jednak modele naczelnych są zbyt kosztowne i wiążą się z bardziej złożoną opieką oraz kwestiami etycznymi niż modele małych zwierząt. Wcześniej opracowane modele SAH u małych zwierząt koncentrowały się na trzech metodach indukcji SAH:...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Samce szczurów SD (250-300 g)	Taconic	SD-M
Kaniule 26 G	Webster	8416683
Igły 25 G	Buffalo	305122
Strzykawki 1 cc	Central stores	54245
Mieszanina ketaminy/ksylazyny	Animal Care (SUNY)*	-
Betadyna	Central stores	51458
Sacharoza	Sigma	S9378-1kg
Paraformaldehyd	Sigma	P6148-500G
Bufor fosforanowy	Fisher	BP-399-4
Stół operacyjny	Harvard	PY2 72-2590
Związek OCT (krioprotekcja)	VWR	25608-930
Szkiełka Superfrost	Fisher	12-550-15
* Przygotowano w Departamencie Opieki nad Zwierzętami Laboratoryjnymi, SUNY Upstate Medical University. Dodać 1 cc [100 mg/ml] ksylazyny do 10 ml [100 mg/ml] ketaminy.