Przepływ płynu śródmiąższowego jest zwiększony w guzach litych i może modulować inwazję komórek nowotworowych. W niniejszej pracy opisujemy technikę nakładania przepływu płynu śródmiąższowego na komórki zatopione w macierzy, a następnie pomiaru jego wpływu na inwazję komórek. Technika ta może być łatwo zaadaptowana do badania innych układów.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Trójwymiarowy model hodowli komórkowej do pomiaru wpływu przepływu płynu śródmiąższowego na inwazję komórek nowotworowych
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Wzrost i progresja większości guzów litych zależą od początkowej transformacji komórek nowotworowych oraz ich odpowiedzi na sygnalizację związaną ze zrębem w mikrośrodowisku guza 1. Wcześniejsze badania nad mikrośrodowiskiem guza koncentrowały się głównie na oddziaływaniach między guzem a zrębem 1-2. Mikrośrodowisko guza obejmuje jednak również szereg sił biofizycznych, których efekty pozostają słabo poznane. Siły te są biomechanicznymi następstwami wzrostu guza, które prowadzą do zmian w ekspresji genów, podziałach komórkowych, różnicowaniu oraz inwazji3. W miarę progresji nowotworu ulega zmianie gęstość macierzy 4, jej sztywność 5-6 i struktura 6-7, a także ciśnienie płynu śródmiąższowego 8 oraz przepływ płynu śródmiąższowego 8.
Przepływ płynu śródmiąższowego jest w szczególności wyższy w guzach w porównaniu do tkanek prawidłowych 8-10. Szacunkowe prędkości przepływu płynu śródmiąższowego zostały zmierzone i okazały się mieścić w zakresie 0,1-3 μm s-1, w zależności od wielkości i stopnia zróżnicowania guza 9, 11. Wynika to z podwyższonego ciśnienia płynu śródmiąższowego spowodowanego indukowaną przez guz angiogenezą oraz zwiększoną przepuszczalnością naczyń 12. Wykazano, że przepływ płynu śródmiąższowego zwiększa inwazję komórek nowotworowych 13-14, fibroblastów naczyniowych oraz komórek mięśni gładkich 15. Inwazja ta może wynikać z autologicznych gradientów chemotaktycznych tworzących się wokół komórek w 3D 16 lub ze zwiększonej ekspresji metaloproteinaz macierzy (MMP) 15, sekrecji chemokin oraz ekspresji cząsteczek adhezyjnych 17. Mechanizm, dzięki któremu komórki wyczuwają przepływ płynu, nie jest jednak dobrze poznany. Poza zmianą zachowania komórek nowotworowych, przepływ płynu śródmiąższowego moduluje aktywność innych komórek w mikrośrodowisku guza. Jest on związany z (a) stymulowaniem różnicowania fibroblastów w pronowotworowe myofibroblasty 18, (b) transportem antygenów i innych rozpuszczalnych czynników do węzłów chłonnych 19 oraz (c) modulowaniem morfogenezy komórek śródbłonka limfatycznego 20.
Przedstawiona tutaj technika narzuca przepływ płynu śródmiąższowego na komórki in vitro i kwantyfikuje jego wpływ na inwazję (Rycina 1). Metoda ta została opisana w wielu badaniach w celu pomiaru wpływu przepływu płynu na inwazję komórek zrębu oraz komórek nowotworowych 13-15, 17. Poprzez zmianę składu macierzy, typu komórek oraz ich stężenia, metodę tę można zastosować w badaniu innych chorób i systemów fizjologicznych, aby przeanalizować wpływ przepływu śródmiąższowego na procesy komórkowe, takie jak inwazja, różnicowanie, proliferacja i ekspresja genów.
Protokół
1. Przygotowanie analizy
- Rozmrozić niewielką alikwot (<500 μl) Matrigelu na lodzie w temperaturze 4 °C (około 2 h).
- Przygotować skład żelu (patrz przykładowe objętości w poniższej tabeli): 10x PBS (1x w objętości końcowej), 1N wodorotlenek sodu (równowartość 0,023 objętości dodanego kolagenu lub zgodnie z zaleceniami producenta kolagenu, w zależności od potrzeb), Matrigel oraz kolagen typu I do stężeń końcowych odpowiednio 1 mg/ml i 1,3 mg/ml (w zależności od typu komórek i eksperymentu można zastosować inne formulacje macierzy).
Przykładowy skład żelu
| Komponenty | Stężenie roztworu macierzystego | Stężenie końcowe | Dodać objętość |
| 10X PBS | 10x | 1X | 0,090 ml |
| Woda sterylna | 0,346 ml | ||
| 1N NaOH | 0,008 ml | ||
| Matrigel | 9,90 mg/ml | 1 mg/ml | 0,101 ml |
| Kolagen typu I z ogona szczura | 3,66 mg/ml | 1,3 mg/ml | 0,355 ml |
- Wymieszaj składniki żelu na lodzie w tej samej kolejności co powyżej i inkubuj końcowy roztwór przez 1 hr w temperaturze 4 °C. Z naszego doświadczenia wynika, że 1 hr inkubacji przed wysiewem komórek prowadzi do bardziej jednorodnej żelacji kolagenu. Należy pamiętać, aby Matrigel i kolagen przez cały czas trzymać na lodzie oraz pracować jak najszybciej, aby zapobiec przedwczesnej żelacji.
- Za pomocą sterylnej pęsety umieść inserty do hodowli komórkowej o średnicy 12 mm i wielkości porów 8 μm w płytce 12-dołkowej.
- Policz komórki i resuspenduj je w medium bezsurowiczym w stężeniu 5 x 106 cells/ml (całkowita objętość powinna stanowić 10% roztworu żelu).
- Dodaj 100 μl zawiesiny komórkowej do 900 μl roztworu żelu (końcowe stężenie komórek 5 x 105 cells/ml) i wymieszaj dokładnie, delikatnie pipetując w górę i w dół.
- Dodaj 150 μl końcowej mieszaniny do każdego insertu i przenieś do inkubatora w temperaturze 37 °C i 5% CO2 na 30 minut, aż żel spolimeryzuje.
- Używając medium bezsurowiczego,
- W warunkach STATYCZNYCH (STATIC) nanieś 100 μl na powierzchnię żelu oraz 1200 μl pod wkładkę. Poziomy cieczy wewnątrz wkładki i na zewnątrz w studzience powinny być w przybliżeniu równe, co zminimalizuje różnicę ciśnień w poprzek żelu i zapobiegnie przepływowi śródmiąższowemu.
- W warunkach PRZEPŁYWU (FLOW) nanieś 100 μl pod wkładkę i 650 μl powyżej żelu. Należy uważać, aby nie wprowadzić pęcherzyków powietrza pod wkładkę, ponieważ uniemożliwią one migrację komórek przez membranę w tych miejscach. Różnica ciśnień generowana przez te objętości wynosi około 1,3 cm H2O (lub 1 mm Hg).
- Umieść płytkę w inkubatorze w temperaturze 37 °C i przy 5% CO2 na 24 hr.
2. Barwienie i liczenie komórek
- Do każdego dołka nowej płytki 24-dołkowej dodać 500 μl 1X PBS; roztwór ten posłuży do przemycia wkładów.
- Usunąć medium pozostałe w górnej części transwelli przepływowych i zmierzyć jego objętość. Obliczyć całkowitą objętość eluatu, odejmując objętość pozostałą od całkowitej objętości początkowej, tj. 650 μl (wartość ta zostanie wykorzystana do obliczeń szybkości przepływu, patrz poniżej). Za pomocą patyczków watnych usunąć żel z wkładów oraz przetrzeć górną powierzchnię membrany, aby usunąć komórki, które nie migrowały. Włożyć inserty do płytki 24-dołkowej z 1X PBS na 15 s w celu ich przemycia.
- Usunąć PBS i dodać 500 μl 4% paraformaldehydu (PFA) pod każdy wkład, a następnie inkubować przez 30 minut w temperaturze pokojowej, aby utrwalić zmigrowane komórki.
- Usunąć PFA i przepłukać raz 500 μl 1X PBS w celu usunięcia resztek utrwalacza.
- Dodać 500 μl 0,5% roztworu Triton X-100 pod wkładami i inkubować przez 10 minut w temperaturze pokojowej w celu permeabilizacji komórek.
- Wyciąć membrany z wkładów za pomocą żyletki i umieścić je w 100 μl roztworu 2 μg/ml DAPI w 1X PBS, dbając o to, aby dolna strona membrany była skierowana w dół (komórki zmigrowane skierowane w dół).
- Owinąć płytkę folią aluminiową i umieścić na wytrząsacie przy 150 rpm przez 30 minut w temperaturze pokojowej.
- Przemyć membrany w 500 μl 1X PBS na wytrząsacie (powtórzyć 3 razy po 10 minut każdorazowo), aby usunąć wolny DAPI.
- Umieścić membrany na szkiełkach przedmiotowych tak, aby zmigrowane komórki były skierowane do góry, dodać medium montażowe i przykryć szkiełkiem cover slip.
3. Analiza danych
- Policz jądra zabarwione DAPI w 5 przypadkowo wybranych obszarach każdej membrany (unikaj krawędzi i używaj obiektywu 10X lub 20X).
- Oblicz średnią liczbę komórek i wyznacz procent inwazji, korzystając z następującego wzoru:
Procent inwazji = 100% x (średnia liczba komórek x powierzchnia membrany) / (powierzchnia obrazu mikroskopowego x liczba wysianych komórek)
Procent inwazji można znormalizować względem warunków kontrolnych (zazwyczaj warunków statycznych), aby umożliwić porównanie pomiędzy niezależnymi eksperymentami. - Oblicz średnie natężenie przepływu: podziel całkowitą objętość eluatu w warunkach przepływu przez czas inkubacji (np. 24 hr).
- Oblicz średnią prędkość przepływu: podziel średnie natężenie przepływu przez pole przekroju poprzecznego żelu/membrany (w tym przypadku 60 mm2).
4. Reprezentatywne wyniki
Aby zmierzyć inwazję komórek nowotworowych w warunkach przepływu śródmiąższowego, przeprowadziliśmy test inwazji w przepływie 3-D z użyciem przerzutowych komórek czerniaka MDA-MB-435S. Wykazano wcześniej, że komórki te wykazują inwazyjność w odpowiedzi na przepływ płynu śródmiąższowego 13-14. Komórki osadzono w macierzy składającej się z 1,3 mg/ml kolagenu typu I z ogona szczura oraz 1 mg/ml macierzy błony podstawnej Matrigel, przy końcowym stężeniu komórek 5 x 105 komórek/ml. Porównano dwa różne warunki: (1) średni przepływ śródmiąższowy = 0,1 μm s-1 oraz (2) warunek statyczny = brak mierzalnej szybkości przepływu (Rysunek 1).
Po 24 h komórki, które przeniknęły przez pory membrany, barwiono DAPI w celu ułatwienia liczenia komórek. Rysunek 2 przedstawia reprezentatywny obraz zainwadujących komórek. W świetle przechodzącym widoczne są jedynie pory membrany. W fluorescencji jądra zbarwione DAPI posłużyły do liczenia komórek, a struktury F-aktyny zbarwione falloidyną do wizualizacji ciała komórki (opcjonalnie). Stosując test t Studenta przy założeniu równości wariancji, wykazano, że przepływ śródmiąższowy znacząco zwiększa inwazję komórek MDA-MB-435S 2,3-krotnie w porównaniu z warunkami statycznymi (p = 0,003) (Rysunek 3). Potwierdza to podobne wyniki (ale przy innych warunkach macierzy, a tym samym różnych prędkościach przepływu) uzyskane dla tej linii komórkowej 13-14.
Rysunek 1. Schemat testu inwazji z przepływem płynu śródmiąższowego w 3D. Najpierw przygotować roztwór żelu, stosując odpowiednie stężenia i objętości. Następnie dodać komórki do roztworu żelu i przenieść do insertów do hodowli komórkowej. Na koniec dodać odpowiednią objętość pożywki do każdego wariantu i inkubować. Przepływ płynu śródmiąższowego jest wymuszany przez ciśnienie hydrauliczne.
Rysunek 2. Przemigrowane komórki MDA-MB-435S na błonie. Komórki naciekające zostały utrwalone po przeprowadzeniu testu inwazji z przepływem płynu śródmiąższowego, a następnie zabarwione DAPI oraz falloidyną sprzężoną z Alexa Fluor 488 w celu ułatwienia liczenia komórek naciekających; A) Obraz błony w świetle przechodzącym; B) Jądra zabarwione DAPI (na niebiesko); C) F-aktyna zabarwiona Alexa Fluor 488-falloidyną (na zielono). Pasek skali odpowiada 50 μm.
Rycina 3. Zwiększona inwazja komórek MDA-MB-435S w warunkach przepływu. Inwazja komórek po 24 hr była znacznie nasilona przez przepływ śródmiąższowy (p = 0.003). Wyniki zostały znormalizowane do średniej dla warunków statycznych, a wartości przedstawiają średnią ± SEM dla 6 insertów do hodowli komórkowych.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
W niniejszej pracy opisano metodologię ilościowego określania wpływu przepływu śródmiąższowego na inwazję komórek nowotworowych, z wykorzystaniem komórek osadzonych w macierzy 3-D wewnątrz insertu do hodowli komórkowej. Tę oraz podobne metody stosowano do badania wpływu przepływu śródmiąższowego na różne typy komórek 13-15, 17. Nasze podejście częściowo naśladuje mikrośrodowisko macierzy guza poprzez zastosowanie kolagenu typu I oraz Matrigelu, które zawierają białka występujące w błonie podstawnej tkanki nabł...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Nie zadeklarowano żadnych konfliktów interesów.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Kolagen (z ogona szczura) | BD Biosciences | 354236 | Przechowywać w warunkach sterylnych |
| Wkładki do hodowli komórkowych Millicell | EMD Millipore | PI8P01250 | średnica porów 8 μm, membrana poliwęglanowa |
| Matrigel | BD Biosciences | 354234 | Przechowywać w warunkach sterylnych |
| PBS | Sigma-Aldrich | 100M-8202 | 10x do przygotowania roztworu żelu, 1x do etapów płukania |
| Wodorotlenek sodu, roztwór 1,0N | Sigma-Aldrich | S2770 | Przechowywać w warunkach sterylnych |
| DMEM 1X | Cellgro | 10-013-CV | Przechowywać w warunkach sterylnych |
| Płodowa surowica bydlęca | Atlanta Biologicals | 511150 | Przechowywać w warunkach sterylnych |
| Penicylina Streptomycyna | Cellgro | 30002CI | Przechowywać w warunkach sterylnych |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100-500ml | 0,5% w PBS |
| Paraformaldehyd | Fisher Scientific | 04042-500 | 4% w PBS |
| Woda dejonizowana | Przechowywać w warunkach sterylnych | ||
| 4',6-diamidyno-2-fenyloindol (DAPI) | MP Biomedicals | 0215757401 | roztwór stokowy 1mg/ml |
| Medium montażowe | Thermo Fisher Scientific, Inc. | TA-030-FM | |
| Trypsyna-EDTA | Cellgro | 25-052-CI | Przechowywać w warunkach sterylnych |
Bibliografia
- Cichon, M. A. Microenvironmental influences that drive progression from benign breast disease to invasive breast cancer. J. Mammary Gland. Biol. Neoplasia. 15, 389-3897 (2010).
- Proia, D. A., Kuperwasser, C. Stroma: tumor agonist or antagonist. Cell Cycle. 4, 1022-1025 (2005).
- Dvorak, H. F. Tumor microenvironment and progression. J .Surg. Oncol. 103, 468-474 (2011).
- Provenzano, P. P. Collagen density promotes mammary tumor initiation and progression. BMC Med. 6, 11(2008).
- Engler, A. J. Matrix elasticity directs stem cell lineage specification. Cell. 126, 677-689 (2006).
- Paszek, M. J. Tensional homeostasis and the malignant phenotype. Cancer Cell. 8, 241-254 (2005).
- Levental, K. R. Matrix crosslinking forces tumor progression by enhancing integrin signaling. Cell. 139, 891-906 (2009).
- Butler, T. P., Grantham, F. H., Gullino, P. M. Bulk transfer of fluid in the interstitial compartment of mammary tumors. Cancer Res. 35, 3084-3088 (1975).
- Dafni, H. Overexpression of vascular endothelial growth factor 165 drives peritumor interstitial convection and induces lymphatic drain: magnetic resonance imaging, confocal microscopy, and histological tracking of triple-labeled albumin. Cancer Res. 62, 6731-6739 (2002).
- Chary, S. R., Jain, R. K. Direct measurement of interstitial convection and diffusion of albumin in normal and neoplastic tissues by fluorescence photobleaching. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 86, 5385-5389 (1989).
- Heldin, C. H. High interstitial fluid pressure - an obstacle in cancer therapy. Nat. Rev. Cancer. 4, 806-813 (2004).
- Fukumura, D. Tumor microvasculature and microenvironment: novel insights through intravital imaging in pre-clinical models. Microcirculation. 17, 206-225 (2010).
- Shields, J. D. Autologous chemotaxis as a mechanism of tumor cell homing to lymphatics via interstitial flow and autocrine CCR7 signaling. Cancer Cell. 11, 526-538 (2007).
- Shieh, A. C. Tumor cell invasion is promoted by interstitial flow-induced matrix priming by stromal fibroblasts. Cancer Res. 71, 790-800 (2011).
- Shi, Z. D., Wang, H., Tarbell, J. M. Heparan sulfate proteoglycans mediate interstitial flow mechanotransduction regulating MMP-13 expression and cell motility via FAK-ERK in 3D collagen. PLoS One. 6, e15956(2011).
- Fleury, M. E., Boardman, K. C., Swartz, M. A. Autologous morphogen gradients by subtle interstitial flow and matrix interactions. Biophys J. 91, 113-121 (2006).
- Miteva, D. O. Transmural flow modulates cell and fluid transport functions of lymphatic endothelium. Circ. Res. 106, 920-931 (2010).
- Ng, C. P., Hinz, B., Swartz, M. A. Interstitial fluid flow induces myofibroblast differentiation and collagen alignment in vitro. J. Cell. Sci. 118, 4731-4739 (2005).
- Kunder, C. A. Mast cell-derived particles deliver peripheral signals to remote lymph nodes. J. Exp. Med. 206, 2455-2467 (2009).
- Helm, C. L. Synergy between interstitial flow and VEGF directs capillary morphogenesis in vitro through a gradient amplification mechanism. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102, 15779-15784 (2005).
- McGuire, P. G., Seeds, N. W. The interaction of plasminogen activator with a reconstituted basement membrane matrix and extracellular macromolecules produced by cultured epithelial cells. J Cell Biochem. 40, 215-227 (1989).
- Kleinman, H. K. Isolation and characterization of type IV procollagen, laminin, and heparan sulfate proteoglycan from the EHS sarcoma. Biochemistry. 21, 6188-6193 (1982).
- Haessler, U. Migration dynamics of breast cancer cells in a tunable 3D interstitial flow chamber. Integr. Biol. (Camb). , (2011).
- Polacheck, W. J., Charest, J. L., Kamm, R. D. Interstitial flow influences direction of tumor cell migration through competing mechanisms. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108, 11115-11120 (2011).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
