Trójwymiarowy model hodowli komórkowej do pomiaru wpływu przepływu płynu śródmiąższowego na inwazję komórek nowotworowych

Podsumowanie

Przepływ płynu śródmiąższowego jest podwyższony w guzach litych i może modulować inwazję komórek nowotworowych. W tym miejscu opisujemy technikę stosowania przepływu płynu śródmiąższowego do komórek osadzonych w macierzy, a następnie mierzenia jego wpływu na inwazję komórek. Technikę tę można łatwo zaadaptować do badania innych systemów.

Streszczenie

Wzrost i postęp większości guzów litych zależy od początkowej transformacji komórek nowotworowych i ich odpowiedzi na sygnalizację związaną ze zrębem w mikrośrodowisku guza ¹. Wcześniej badania nad mikrośrodowiskiem guza koncentrowały się przede wszystkim na interakcjach guz-zręb ^1-2. Jednak mikrośrodowisko guza obejmuje również różne siły biofizyczne, których skutki pozostają słabo poznane. Siły te są biomechanicznymi konsekwencjami wzrostu guza, które prowadzą do zmian w ekspresji genów, podziale komórek, różnicowaniu i inwazji³. Gęstość matrycy ⁴, sztywność ^5-6 i struktura ^6-7, ciśnienie płynu śródmiąższowego ⁸ i przepływ płynu śródmiąższowego ⁸ ulegają zmianie podczas progresji raka.

Przepływ płynu śródmiąższowego w szczególności jest wyższy w guzach niż w normalnych tkankach ^8-10. Zmierzono szacowane prędkości przepływu płynu śródmiąższowego i stwierdzono, że mieszczą się one w zakresie 0,1-3 μm ^s-1, w zależności od wielkości i zróżnicowania guza ^{9, 11}. Wynika to z podwyższonego ciśnienia płynu śródmiąższowego spowodowanego angiogenezą wywołaną przez guz i zwiększoną przepuszczalnością naczyń ^{krwionośnych 12}. Wykazano, że przepływ płynu śródmiąższowego zwiększa inwazję komórek rakowych ^13-14, fibroblastów naczyniowych i komórek mięśni gładkich ¹⁵. Ta inwazja może być spowodowana autologicznymi gradientami chemotaktycznymi utworzonymi wokół komórek w 3-D ¹⁶ lub zwiększoną ekspresją metaloproteinazy macierzy (MMP) ¹⁵, wydzielaniem chemokin i ekspresją cząsteczki adhezji komórek ¹⁷. Jednak mechanizm, za pomocą którego komórki wyczuwają przepływ płynu, nie jest dobrze poznany. Oprócz zmiany zachowania komórek nowotworowych, przepływ płynu śródmiąższowego moduluje aktywność innych komórek w mikrośrodowisku guza. Jest to związane z (a) napędzaniem różnicowania fibroblastów w miofibroblasty sprzyjające nowotworowi ¹⁸, (b) transportem antygenów i innych rozpuszczalnych czynników do węzłów chłonnych ¹⁹ oraz (c) modulowaniem morfogenezy komórek śródbłonka limfy ²⁰.

Przedstawiona tutaj technika narzuca przepływ płynu śródmiąższowego na komórki in vitro i określa ilościowo jego wpływ na inwazję (Rysunek 1). Metoda ta została opublikowana w wielu badaniach mających na celu zmierzenie wpływu przepływu płynu na inwazję komórek zrębowych i rakowych ^{13-15, 17}. Zmieniając skład macierzy, typ komórki i stężenie komórek, metoda ta może być stosowana do innych chorób i układów fizjologicznych w celu zbadania wpływu przepływu śródmiąższowego na procesy komórkowe, takie jak inwazja, różnicowanie, proliferacja i ekspresja genów.

Protokół

1. Konfiguracja testu

1. Rozmrozić niewielką porcję (<500 μl) Matrigelu na lodzie w temperaturze 4 °C (około 2 godziny).
2. Przygotuj recepturę żelu (patrz przykładowe objętości w tabeli poniżej): 10x PBS (1x w objętości całkowitej), 1N wodorotlenek sodu (co odpowiada 0,023 objętości dodanego kolagenu lub zgodnie z zaleceniami producenta kolagenu, w zależności od przypadku), Matrigel i kolagen typu I do końcowych stężeń odpowiednio 1 mg/ml i 1,3 mg/ml (w zależności od typu komórki i eksperymentu można stosować inne preparaty matrycowe).

Przykładowy przepis na żel

Składniki Koncentracja zapasów Stężenie końcowe Dodawanie objętości 10 razy więcej kanałów na sekundę 10-krotny wzrost 1X Pojemność 0,090 ml Sterylna woda     Pojemność 0,346 ml 1N NaOH     Pojemność 0,008 ml Matrigel 9,90 mg/ml 1 mg/ml Pojemność 0,101 ml Kolagen ze szczurzego ogona typu I 3,66 mg/ml 1,3 mg/ml Pojemność 0,355 ml

3. Wymieszać składniki żelu na lodzie w tej samej kolejności jak powyżej i inkubować końcowy roztwór przez 1 godzinę w temperaturze 4 °C. Z naszego doświadczenia wynika, że 1-godzinna inkubacja przed wysiewem komórek powoduje bardziej równomierne żelowanie kolagenu. Upewnij się, że Matrigel i kolagen są zawsze na lodzie i działają tak szybko, jak to możliwe, aby zapobiec żelowaniu.
4. Umieść wkładki do hodowli komórek porowych o średnicy 8 μm o średnicy 12 mm na 12-dołkowej płytce za pomocą wysterylizowanych kleszczyków.
5. Zliczyć komórki i ponownie zawiesić w podłożu bez surowicy w stężeniach 5 x 10⁶ komórek/ml (całkowita objętość powinna wynosić 10% roztworu żelu).
6. Dodać 100 μl zawiesiny komórek do 900 μl roztworu żelu (końcowe stężenie komórek: 5 x 10 5 komórek/ml) i dokładnie wymieszać, delikatnie pipetując w górę i w dół.
7. Dodać 150 μl końcowej mieszaniny do każdej wkładki i przenieść do inkubatora o temperaturze 37 °C, 5% CO₂ na 30 minut, aż żel się zpolimeryzuje.
8. Stosowanie pożywek niezawierających surowicy,

• Dodaj 100 μl na wierzch żelu i 1200 μl pod wkładkę dla stanu STATYCZNEGO. Poziomy płynu wewnątrz wkładu i na zewnątrz w studzience powinny być w przybliżeniu równe, co skutkuje minimalną różnicą ciśnień w poprzek żelu i brakiem przepływu śródmiąższowego.
• Dodaj 100 μl pod wkładkę i 650 μl powyżej żelu dla stanu FLOW. Należy uważać, aby uniknąć pęcherzyków powietrza pod wkładką, ponieważ zapobiegną one migracji komórek przez membranę w tych miejscach. Różnica ciśnień generowana przez te objętości wynosi około 1,3 cm H₂O (lub 1 mm Hg).

9. Umieścić płytkę w inkubatorze o temperaturze 37 °C, 5% CO₂ na 24 godziny.

2. Barwienie i liczenie komórek

1. Dodać 500 μl 1X PBS na dołek do nowej płytki 24-dołkowej; zostanie ona użyta do umycia wkładek.
2. Usunąć pożywkę pozostałą w górnej części transwelli przepływowych i określić objętość. Obliczyć całkowitą objętość elucji, odejmując pozostałą objętość od całkowitej objętości pierwotnie dodanej, 650 μl (zostanie to wykorzystane do obliczeń natężenia przepływu, patrz poniżej). Użyj bawełnianych wacików, aby usunąć żel z wkładek i wytrzeć górną powierzchnię membrany, aby usunąć niezaatakowane komórki. Umieść wkładki w 24-dołkowej płytce zawierającej 1X PBS na 15 sekund, aby umyć wkładki.
3. Usuń PBS i dodaj 500 μl 4% paraformaldehydu (PFA) pod każdą wkładkę i inkubuj przez 30 minut w temperaturze pokojowej, aby utrwalić transmigrowane komórki.
4. Usuń PFA i spłucz raz 500 μl 1X PBS, aby usunąć resztki utrwalacza.
5. Dodaj 500 μl 0,5% roztworu Triton X-100 pod wkładki i inkubuj przez 10 minut w temperaturze pokojowej, aby przepuszczalność komórek.
6. Wyciąć membrany z wkładu za pomocą żyletki i umieścić w 100 μl 2 μg/ml DAPI w roztworze 1X PBS, uważając, aby umieścić spód membrany przodem do dołu (transmigrowane komórki do dołu).
7. Zawiń talerz w folię aluminiową i umieść na shakerze z prędkością 150 obr./min na 30 minut w temperaturze pokojowej.
8. Umyj membrany w 500 μl 1X PBS na wytrząsarce (powtórz 3 razy po 10 minut), aby usunąć wolne DAPI.
9. Umieść membrany na szkiełkach z transmigrującymi komórkami skierowanymi do góry, dodaj roztwór montażowy i szkiełko nakrywkowe.

3. Analiza danych

1. Policz jądra barwione DAPI w 5 losowo wybranych miejscach każdej błony (trzymaj się z dala od krawędzi i użyj soczewki obiektywowej 10X lub 20X).
2. Oblicz średnią liczbę komórek i uzyskaj procent inwazji, używając następującej formuły:
   Procent inwazji = 100% x (średnia liczba komórek x powierzchnia błony) / (powierzchnia obrazu mikroskopowego x liczba zasianych komórek)
   Procentowa inwazja może być znormalizowana do pewnego warunku kontrolnego (zazwyczaj warunku statycznego), aby umożliwić porównanie między niezależnymi eksperymentami.
3. Obliczyć średnie natężenie przepływu: podzielić całkowitą objętość elucji w warunkach przepływu przez czas inkubacji (np. 24 godziny).
4. Obliczyć średnią prędkość przepływu: podzielić średnie natężenie przepływu przez pole przekroju poprzecznego żelu/membrany (w tym przypadku 60 mm²).

4. Reprezentatywne wyniki

Aby zmierzyć inwazję komórek nowotworowych pod wpływem przepływu śródmiąższowego, przeprowadziliśmy nasz test inwazji przepływu 3D przy użyciu komórek czerniaka z przerzutami MDA-MB-435S. Wcześniej wykazano, że komórki te atakują w odpowiedzi na przepływ płynu śródmiąższowego ^13-14. Komórki osadzono w macierzy złożonej z 1,3 mg/ml kolagenu ze ścięgna ogona szczura typu I i 1 mg/ml macierzy błony podstawnej Matrigel przy końcowym stężeniu komórek 5 x 10^{5 komórek}/ml. Porównano dwa różne warunki: (1) średni przepływ śródmiąższowy = 0,1 μm ^s-1 i (2) stan statyczny = brak mierzalnego natężenia przepływu (rysunek 1).

Po 24 godzinach, komórki, które przeniknęły przez pory błony, zostały zabarwione DAPI, aby ułatwić liczenie komórek. Rysunek 2 przedstawia reprezentatywny obraz zaatakowanych komórek. W jasnym polu widoczne są tylko pory membrany. Za pomocą fluorescencji jądra wybarwione DAPI wykorzystano do zliczania komórek, a struktury F-aktyny barwione falloidyną wykorzystano do wizualizacji ciała komórki (opcjonalnie). Korzystając z testu t Studenta zakładającego równe wariancje, wykazaliśmy, że przepływ śródmiąższowy znacznie zwiększa inwazję komórek MDA-MB-435S 2,3-krotnie w stosunku do warunków statycznych (p = 0,003) (Figura 3). Potwierdza to podobne wyniki (ale z różnymi warunkami matrycy, a tym samym prędkościami przepływu) przy użyciu tej linii komórkowej ^13-14.

Rysunek 1. Schemat testu inwazji przepływu płynu śródmiąższowego 3D. Najpierw przygotuj roztwór żelu o odpowiednich stężeniach i objętościach. Następnie dodaj komórki do roztworu żelu i przenieś do wkładek do hodowli komórkowych. Na koniec dodaj odpowiednią objętość pożywki do każdego warunku i inkubuj. Przepływ płynu śródmiąższowego jest napędzany przez głowicę ciśnieniową płynu.

Rysunek 2. Transmigracja komórek MDA-MB-435S na błonie. Zaatakowane komórki zostały utrwalone po naszym teście inwazji przepływu płynu śródmiąższowego i wybarwione falloidyną sprzężoną z DAPI i Alexa Fluor 488, aby ułatwić liczenie zaatakowanych komórek; A) Obraz membrany w jasnym polu; B) jądra barwione DAPI (na niebiesko); C) Alexa Fluor 488-phalloidyna barwiona F-aktyną (na zielono). Podziałka skali reprezentuje 50 μm.

Rysunek 3. Zwiększona inwazja komórek MDA-MB-435S pod przepływem. Inwazja komórek po 24 godzinach znacznie zwiększona przez przepływ śródmiąższowy (p = 0,003). Wyniki są znormalizowane do średniego stanu statycznego, a wartości reprezentują średnią ± SEM z 6 wkładek do hodowli komórkowych.

Dyskusja

Tutaj opisaliśmy metodologię ilościowego określania wpływu przepływu śródmiąższowego na inwazję komórek nowotworowych przy użyciu komórek osadzonych w matrycy 3D we wstawce do hodowli komórkowej. Ta i podobne metody zostały wykorzystane do zbadania wpływu przepływu śródmiąższowego na różne typy komórek ^{13-15, 17}. Nasze podejście częściowo naśladuje mikrośrodowisko macierzy guza przy użyciu kolagenu typu I i Matrigel, które zawierają białka znajdujące się w błonie podstawnej tkanki nabłonkowej i otaczającym zrę...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Kolagen (ogon szczura)	BD Biosciences	354236	Utrzymuj sterylną
wkładkę do hodowli komórek milikomórkowych	EMD Millipore	PI8P01250	8 i mu; m średnica porów, membrana poliwęglanowa
Matrigel	BD Biosciences	354234	Utrzymuj sterylność
PBS	Sigma-Aldrich	100M-8202	10x do przygotowania roztworu żelu, 1x do etapów mycia
Wodorotlenek sodu, roztwór 1,0N	Sigma-Aldrich	S2770	Utrzymuj sterylność
DMEM 1X	Cellgro	10-013-CV	Utrzymuj sterylną
surowicę bydlęcą	Atlanta Biologicals	511150	Utrzymuj sterylną
penicylinę Streptomycin	Cellgro	30002CI	Utrzymuj sterylną
Triton X-100	Sigma-Aldrich	X100-500ml	0,5% w PBS
Paraformaldehyd	Fisher Scientific	04042-500	4% w PBS
Dejonizowana woda			Utrzymuj sterylność
4',6- diaminido-2-fenyloindol (DAPI)	MP Biomedicals	0215757401	1mg/ml roztwór podstawowy
Roztwór montażowy	Thermo Fisher Scientific, Inc.	TA-030-FM
Trypsyna-EDTA	Cellgro	25-052-CI	Utrzymuj sterylność