Artykuł metodologiczny

Badania rozpraszania promieniowania rentgenowskiego pod kątem małych i szerokokątnych makrocząsteczek biologicznych w roztworze

DOI:

10.3791/4160

⸱

8 stycznia 2013

 ,  ,  , 
1Department of Mechanical, Aerospace, and Nuclear Engineering, Rensselaer Polytechnic Institute

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Demonstracja procedury rozpraszania promieniowania rentgenowskiego pod małym i szerokim kątem (SWAXS) stała się instrumentalna w badaniu makrocząsteczek biologicznych. Dzięki wykorzystaniu oprzyrządowania i procedur określonych metod kątowych i przygotowania, dane eksperymentalne z SWAXS przedstawiają charakterystykę makrocząsteczek w skali atomowej i nano.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W tym artykule, analiza małych i szerokokątnych rozpraszania promieniowania rentgenowskiego (SWAXS) makromolekuł została zademonstrowana poprzez eksperymenty. SWAXS to technika, w której promienie rentgenowskie są elastycznie rozpraszane przez niejednorodną próbkę w zakresie nm pod małymi kątami (zwykle 0,1 - 5°) i szerokimi kątami (zwykle > 5°). Technika ta dostarcza informacji o kształcie, wielkości i rozmieszczeniu makrocząsteczek, charakterystycznych odległościach częściowo uporządkowanych materiałów, rozmiarach porów i stosunku powierzchni do objętości. Rozpraszanie promieniowania rentgenowskiego pod małym kątem (SAXS) jest w stanie dostarczyć informacji strukturalnych makrocząsteczek o długości fali od 1 do 200 nm, podczas gdy rozpraszanie promieniowania rentgenowskiego pod kątem szerokim kątem (WAXS) może rozwiązać jeszcze mniejsze odstępy między próbkami Bragga od 0,33 nm do 0,49 nm w oparciu o specyficzną konfigurację systemu i detektor. Odstęp jest określany na podstawie prawa Bragga i zależy od długości fali i kąta padania.

W eksperymencie SWAXS, materiały mogą być stałe lub ciekłe i mogą zawierać stałe, ciekłe lub gazowe domeny (tak zwane cząstki) tego samego lub innego materiału w dowolnej kombinacji. Zastosowania SWAXS są bardzo szerokie i obejmują koloidy wszystkich typów: metale, kompozyty, cement, oleje, polimery, tworzywa sztuczne, białka, żywność i farmaceutyki. W przypadku próbek stałych grubość jest ograniczona do około 5 mm.

Użycie laboratoryjnego instrumentu SWAXS jest szczegółowo opisane w tym artykule. Dzięki dostępnemu oprogramowaniu (np. pakietowi GNOM-ATSAS 2.3 firmy D. Svergun EMBL-Hamburg i oprogramowaniu EasySWAXS) dla systemu SWAXS, można przeprowadzić eksperyment w celu wyznaczenia określonych parametrów interesujących dla danej próbki. Jednym z przykładów eksperymentu z biologicznymi makrocząsteczkami jest analiza 2% wag. lizozymu w wodnym buforze na bazie wody, który można wybrać i przygotować wieloma metodami. Przygotowanie próbki jest zgodne z poniższymi wskazówkami w sekcji Przygotowanie próbki. Dzięki eksperymentom SWAXS można analizować ważne parametry strukturalne lizozymu, np. promień bezwładności.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Przygotowanie próbki

  1. Użyj igły, aby usunąć część próbki z pojemnika na próbkę.*
  2. Za pomocą igły wypełnij kapilar (maksymalna średnica 2,2 mm) próbką. Kapilara musi być wypełniona w odległości od 2 do 3 cm od dołu.
  3. Zamknij kapilarę, topiąc wosk na jej końcówce.
  4. Odkręć uchwyt na próbkę próżniową od systemu.
  5. Wziąć kapilarnę za stopiony koniec (koniec woskowy) i włożyć niestopiony koniec do uchwytu na próbkę.
  6. Umieść uchwyt z powrotem w systemie i przykręć na miejsce.

* Próbki stałe (w tym próbki proszkowe) mogą być bezpośrednio umieszczone w uchwycie na próbki (bez konieczności kapilary), podczas gdy próbki płynne muszą być umieszczone w kapilarze.

Uruchomienie maszyny SWAXS

2. Procedura zimnego startu źródła

  1. Zamknij migawkę, naciskając przycisk migawki bezpieczeństwa.
  2. Włącz główne zasilanie, naciskając zielony przycisk włączania.
  3. Sprawdź, czy przycisk awaryjnego "Wyłączanie" jest w pozycji wysuniętej.
  4. Włącz główne zasilanie, naciskając zielony przycisk.
  5. Sprawdź, czy dioda LED blokady świeci na zielono, wskazując, że wszystkie blokady są w porządku.
  6. Poczekaj, aż załaduje się ekran dotykowy. Po załadowaniu naciśnij "R6" w menu.
  7. Przekręć Standby do pozycji "ON".
  8. Przekręć kluczyk rentgenowski do pozycji "ON". Powinno zaświecić się czerwone światło rentgenowskie.
  9. Poczekaj, aż ekran dotykowy odczyta poziomy czuwania (30 kV i 0.4 mA).
  10. Przekręć kluczyk bezpieczeństwa w trybie czuwania do pozycji "OFF". Naciśnij przycisk "Rozpocznij cykl" na dole ekranu dotykowego.
  11. Poczekaj, aż ekran dotykowy odczyta moc znamionową (50 kV i 1 mA). Jeśli wymagany jest inny poziom mocy, wejdź na ekran konfiguracji, naciskając "R4" na ekranie dotykowym i wprowadzając żądane ustawienia.

3. Procedura agregatu chłodniczego

  1. Ustaw wyłącznik zasilania w pozycji "ON" na panelu sterowania temperaturą. Zaświeci się lampka kontrolna i wyświetlacz temperatury LED.
  2. Ustaw wyłącznik zasilania w pozycji "ON" na agregacie chłodniczym.
  3. Poczekaj, aż na wyświetlaczu temperatury pojawi się "OFF". To jest tryb czuwania.
  4. Naciśnij i przytrzymaj przycisk Enter (symbol powrotu) przez około 4 sekundy lub do momentu, gdy wyświetlacz temperatury wskaże rzeczywistą temperaturę.
  5. Aby zmienić temperaturę, naciśnij strzałkę w górę lub w dół. Ustawiona wartość będzie wyświetlana na wyświetlaczu temperatury przez około 8 sekund, zanim powróci do rzeczywistej wartości.
  6. Naciśnij przycisk Enter, gdy zostanie wyświetlona żądana ustawiona wartość. Spowoduje to zapisanie tej wartości.
  7. Poczekaj, aż rzeczywista temperatura osiągnie żądaną ustawioną wartość.

UWAGA: Jeśli w dowolnym momencie na wyświetlaczu temperatury pojawi się błąd "E 01", postępuj zgodnie z instrukcjami wyłączania agregatu chłodniczego, napełnij wannę, wlewając oczyszczoną wodę do napełnienia zbiornika, a następnie ponownie wykonaj procedurę uruchamiania agregatu chłodniczego.

4. Wyłączenie agregatu chłodniczego

  1. Naciśnij "enter" przez około 4 sekundy.
  2. Ustaw wyłącznik zasilania w pozycji "OFF".

5. Włączanie próżni

  1. Upewnij się, że drzwiczki odkurzacza są zabezpieczone na swoim miejscu.
  2. Przekręć pokrętła Vacuum 1 i 2 do pozycji "ON".
  3. Poczekaj, aż wakuometr VAP5 wskaże poziom podciśnienia mniejszy niż 1.5 mbar.

6. Konfiguracja systemu detektora

  1. Aby ustawić ciśnienie gazu, sprawdź, czy główny manometr zaworu redukcyjnego wynosi co najmniej 10 barów.
  2. Otwórz główny zawór.
  3. Powoli otwieraj zawór ciśnienia roboczego, aż ciśnienie na manometrze roboczym osiągnie 8 barów.
  4. Otwórz drugi główny zawór
  5. Aby wyregulować przepływ gazu, otwórz główny zawór ciśnieniowy, przekręcając pokrętło do pozycji pionowej na panelu sterowania gazem.
  6. Wyreguluj natężenie przepływu za pomocą zaworu iglicowego, aż manometr wskaże około 8 barów.
  7. Ustaw główny wyłącznik zasilania w pozycji "ON". Dioda LED powinna się zaświecić.
  8. Aby wyregulować wysokie napięcie, aktywuj wysokie napięcie, przekręcając przełącznik do pozycji "ON". Dioda LED powinna się zaświecić.
  9. Powoli obracaj pokrętło regulacji napięcia, aż na manometrze zostanie osiągnięte około 3.5 kV. NIE PRZEKRACZAĆ WARTOŚCI 4 kV.

7. Kalibracja

  1. Powyższe kroki eksperymentalne są wykonywane z próbką znanych pików.
  2. ASA 3.3 służy do uzyskania wykresu intensywności w funkcji kanału z 5 pikami.
  3. Przejdź do Menu →Opcje→Wprowadź kanały i odpowiadające im intensywności.
  4. Najpierw przejdź do ASA3, zakładka "TPF".
  5. Wymień filtr, lewy górny róg 1 mm Nikiel (filtr wiązki).
  6. Ustaw pozycję 32 000 (zakres od 28 000 do 32 000, obszar krytyczny około 28 000) → przejdź do pozycji, upewnij się, że podciśnienie jest poniżej 5 mbar, upewnij się, że detektor odczytuje od 1 do 10 K.
  7. Uruchom przez 10 sekund przez około 52 zliczenia na sekundę.
  8. Zmień okna energetyczne (lub zmierz okno energetyczne tylko za pomocą próbki, nie uwzględniając obudowy filtra). Ustaw ostatni bieg na 10 sekund.
  9. Znajdź położenie belki głównej (na przykład kanału 233).
  10. W przypadku innych przebiegów ponownie zmień filtr na 2 mm wolfram (W, ogranicznik wiązki) i zacznij od 30 000.
  11. Znajdź lokalizację wszystkich pozostałych pików próbek.
  12. Użyj oprogramowania ImageJ-macro, aby skalibrować SAXS - wykonując przejścia od intensywności w funkcji kanału do intensywności w zależności od q (lub odstępów d) (ilustracja 1).
  13. Użyj oprogramowania ImageJ-macro, aby skalibrować WAXS - tworząc przejścia od intensywności w funkcji kanału do intensywności w stosunku do odstępu q (lub d) (ilustracja 2).

8. Procedura oprogramowania

  1. Użyj oprogramowania ASA 3.3, aby zebrać dane na żywo: Dane na żywo→ zakładka TPF→ Zapisz plik.
  2. W przypadku EasySWAXS kliknij kartę Ustawienia urządzenia.
  3. Wprowadź wartości "a", lambda i d, a także środek ciężkości.
  4. Wybierz opcję Kolimacja punktów.
  5. Wybierz typ cząstki kulistej (chyba że wiadomo, że jest to pręt o płaskim kształcie).
  6. Kliknij zakładkę Guinier-Plot. Zostanie wyświetlony wykres I kontra q2.
  7. Przeciągnij pionowe linie, aby otoczyć przekrój o przybliżonym nachyleniu liniowym.
  8. U dołu ekranu zostanie wyświetlona wartość R. Obok tego istnieje wymóg walidacji.
  9. Kontynuuj przeciąganie linii pionowych bliżej siebie, aż wartość walidacji znajdzie się w zakresie od 1 do 2. To jest subiektywne. Uzyskana wartość R lub promień bezwładności jest wartością szacunkową.

9. Procedura wyłączania źródła

  1. Sprawdź, czy rolety bezpieczeństwa i szybkie migawki są zamknięte.
  2. Przekręć Standby do pozycji "ON".
  3. Poczekaj, aż ekran dotykowy odczyta poziomy czuwania.
  4. Naciśnij R5 na ekranie dotykowym.
  5. Zmniejsz prąd do 0 A.
  6. Zmniejsz napięcie do 0 A.
  7. Przekręć kluczyk rentgenowski do pozycji "OFF".
  8. Wyłącz główne zasilanie, naciskając czerwony przycisk wyłączania.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

SAXS i WAXS razem mogą dostarczyć informacji strukturalnych próbki poprzez następujące parametry: promień bezwładności, wielkość i kształt cząstek, współczynnik struktury roztworu, właściwa powierzchnia wewnętrzna i wielkość porów, typ i wymiar sieci oraz gęstość elektronów. SAXS i WAXS mogą być również stosowane do badania dynamiki białek 1.

Informacje strukturalne eksperymentów SWAXS są uzyskiwane poprzez porównanie eksperymentalnie wykrytych widm i wyników obliczeniowych systemu....

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Procedura porównawcza systemu SWAXS pozwala na wyznaczenie wielu zmiennych na podstawie analizy eksperymentalnej. Parametry, które są uzyskiwane w wyniku analizy, mogą być wykorzystywane do różnych celów, w zależności od próbki i konfiguracji eksperymentalnej. SAXS dostarcza informacji o rozmiarze i kształcie obiektu w skali nano, podczas gdy WAXS skupia się na strukturze atomowej i mikroskali (np. sieć molekularna, symetria wymiarów komórek elementarnych). Dokładniej rzecz ujmując, w przypadku cząstek w rozcień...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nie stwierdzono konfliktu interesów.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Chcielibyśmy podziękować Dr. Manfredowi Kriechbaumowi z Hecus XRS oraz Instytutowi Biofizyki i Badań Nanosystemów Austriackiej Akademii Nauk w Grazu, Austria. LL i XW były częściowo wspierane przez Departament Energii Stanów Zjednoczonych, w ramach nagrody NERI-C Award No. DE-FG07-07ID14889 oraz U.S. Nuclear Regulatory Commission, na mocy nagrody nr NRC-38-08-950. Instrument SWAXS jest również częściowo wspierany przez Departament Energii Stanów Zjednoczonych, w ramach nagrody nr 1. DE-NE0000325.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Kamera System3 do mało- i szerokokątnego rozpraszania promieniowania rentgenowskiego (SWAXS) HecusXRS i IBN,
Graz, Austria
GNOM ATSAS 2.3 autorstwa D. Svergun EMBL-Hamburg
Pakiet

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Bernadó, P., Blackledge, M. Structural biology: Proteins in dynamic equilibrium. Nature. 468, 1046-1048 (2010).
  2. Zhang, F., Skoda, M. W. A., Jacobs, R. M. J., Martin, R. A., Martin, C. M., Schreiber, F. Protein Interactions Studied by SAXS: Effect of Ionic Strength and Protein Concentration for BSA in Aqueous Solutions. J. Phys. Chem. B. 111, 251-259 (2007).
  3. Maranas, J. K. The effect of environment on local dynamics of macromolecules. Current Opinion in Colloid & Interface Science. 12, 29-42 (2007).
  4. Lysozyme in Water [Internet]. , Available from: http://www.bevanlab.biochem.vt.edu/Pages/Personal/justin/gmx-tutorials/lysozyme/10_analysis2.html (2008-2012).
  5. Stribeck, N. X-Ray Scattering of Soft Matter. , Springer. Heidelberg. (2007).
  6. Mertens, H. D., Svergun, D. I. Structural characterization of proteins and complexes using small-angle X-ray solution scattering. J. Struct. Biol. 172 (1), 128(2010).
  7. Svergun, D. I. Small-angle X-ray and neutron scattering as a tool for structural systems biology. Biol. Chem. 391 (7), 737(2010).
  8. Putnam, C. D., Hammel, M., Hura, G. L., Tainer, J. A. X-ray solution scattering (SAXS) combined with crystallography and computation: defining accurate macromolecular structures, conformations and assemblies in solution. Quat. Rev. Biophys. 40, 191-285 (2007).
  9. Bonini, M., Fratini, E., Baglioni, P. SAXS study of chain-like structures formed by magnetic nanoparticles. Materials Science & Engineering C-Biomimetic and Supramolecular Systems. 27 (5-8), 1377-1381 (2007).
  10. Falletta, E., Ridi, F., Fratini, E., Vannucci, C., Canton, P., Bianchi, S., Castelvetro, V., Baglioni, P. A tri-block copolymer templated synthesis of gold nanostructures. Journal of Colloid and Interface Science. 357 (1), 88-94 (2011).
  11. Glatter, O., Scherf, G., Schillen, K., Brown, W. Characterization of a Poly(ethylene oxide) Poly(propylene oxide) Triblock Copolymer (EO(27)-PO39-EO(27)) in Aqueous-Solution. Macromolecules. 27 (21), 6046-6054 (1994).
  12. Mittelbach, R., Glatter, O. Direct structure analysis of small-angle scattering data from polydisperse colloidal particles. Journal of Applied Crystallography. 31, 600-608 (1998).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Ma ok towe rozpraszanie promieni rentgenowskichanaliza rozpraszania promieni rentgenowskichparametry strukturalnepromie gyracjianaliza lizozymuinstrumentacja SWAXSoprogramowanie GNOM ATSASoprogramowanie EasySWAXS

Powiązane artykuły