Badania rozpraszania promieni rentgenowskich pod kątem małym i szerokim dla makrocząsteczek biologicznych w roztworze

Podsumowanie

Prezentacja procedury małokątnego i szerokokątnego rozpraszania rentgenowskiego (SWAXS) stała się kluczowa w badaniach nad biologicznymi makromolekułami. Dzięki zastosowaniu aparatury oraz procedur przygotowania i metod specyficznych kątów, dane eksperymentalne z SWAXS pozwalają na charakterystykę makromolekuł w skali atomowej i nanometrycznej.

Streszczenie

W niniejszej pracy zaprezentowano eksperymentalnie analizę makrocząsteczek za pomocą małokątnego i szerokokątnego rozpraszania promieni rentgenowskich (SWAXS). SWAXS to technika, w której promienie rentgenowskie są rozpraszane elastycznie przez niejednorodną próbkę w zakresie nm pod małymi kątami (zazwyczaj 0,1 - 5°) oraz szerokimi kątami (zazwyczaj > 5°). Technika ta dostarcza informacji o kształcie, rozmiarze i rozkładzie makrocząsteczek, charakterystycznych odległościach w materiałach częściowo uporządkowanych, wielkościach porów oraz stosunku powierzchni do objętości. Małokątne rozpraszanie promieni rentgenowskich (SAXS) pozwala na uzyskanie informacji strukturalnych o makrocząsteczkach o rozmiarach od 1 do 200 nm, natomiast szerokokątne rozpraszanie promieni rentgenowskich (WAXS) może rozdzielać jeszcze mniejsze odstępy Bragga w próbkach, od 0,33 nm do 0,49 nm, w zależności od konkretnej konfiguracji układu i detektora. Odstęp ten jest wyznaczany z prawa Bragga i zależy od długości fali oraz kąta padania.

W eksperymentach SWAXS materiały mogą być w stanie stałym lub ciekłym i mogą zawierać domeny stałe, ciekłe lub gazowe (tzw. cząstki) z tego samego lub innego materiału w dowolnej kombinacji. Zastosowania SWAXS są bardzo szerokie i obejmują koloidy wszystkich typów: metale, kompozyty, cement, olej, polimery, tworzywa sztuczne, białka, żywność i produkty farmaceutyczne. W przypadku próbek stałych grubość jest ograniczona do około 5 mm.

W niniejszej pracy szczegółowo opisano sposób wykorzystania laboratoryjnego instrumentu SWAXS. Przy użyciu dostępnego oprogramowania dla systemu SWAXS (np. pakietu GNOM-ATSAS 2.3 autorstwa D. Sverguna z EMBL-Hamburg oraz oprogramowania EasySWAXS) można przeprowadzić eksperyment w celu określenia wybranych parametrów dla danej próbki. Przykładem eksperymentu z makrocząsteczką biologiczną jest analiza 2% wag. lizozymu w buforze wodnym, który można dobrać i przygotować za pomocą licznych metod. Przygotowanie próbki odbywa się zgodnie z wytycznymi zawartymi w sekcji Przygotowanie próbki. Dzięki badaniom SWAXS można przeanalizować istotne parametry strukturalne lizozymu, np. promień gyracji.

Protokół

1. Przygotowanie próbki

1. Za pomocą igły pobrać część próbki z pojemnika z próbką.*
2. Użyć igły, aby napełnić kapilarę (o maksymalnej średnicy 2,2 mm) próbką. Kapilara musi zostać napełniona na odległość od 2 do 3 cm od dna.
3. Zamknąć kapilarę, topiąc wosk na jej końcówce.
4. Odkręcić próżniowy uchwyt na próbkę z systemu.
5. Chwycić kapilarę za koniec zespawany (z woskiem) i włożyć koniec niezespawany do uchwytu na próbkę.
6. Włożyć uchwyt z powrotem do systemu i przykręcić go na miejscu.

* Próbki stałe (w tym próbki w proszku) można umieścić bezpośrednio w uchwycie na próbki (kapilara nie jest wymagana), natomiast próbki ciekłe muszą zostać umieszczone w kapilarze.

Uruchamianie urządzenia SWAXS

2. Procedura zimnego startu źródła

1. Zamknij migawkę, naciskając przycisk zabezpieczenia migawki.
2. Włącz zasilanie główne, naciskając zielony przycisk włącznika.
3. Upewnij się, że przycisk awaryjnego wyłączania znajduje się w pozycji wysuniętej.
4. Włącz zasilanie główne, naciskając zielony przycisk.
5. Upewnij się, że dioda blokady bezpieczeństwa świeci na zielono, co oznacza, że wszystkie blokady są sprawne.
6. Odczekaj, aż załaduje się ekran dotykowy. Po załadowaniu naciśnij „R6” w menu.
7. Przekręć klucz trybu czuwania (Standby) do pozycji „ON”.
8. Przekręć klucz promieni rentgenowskich (X-ray) do pozycji „ON”. Powinna zapalić się czerwona lampka ostrzegawcza promieniowania rentgenowskiego.
9. Odczekaj, aż na ekranie dotykowym pojawią się wartości trybu czuwania (30 kV i 0,4 mA).
10. Przekręć klucz zabezpieczenia trybu czuwania do pozycji „OFF”. Naciśnij przycisk „Start Cycle” w dolnej części ekranu dotykowego.
11. Odczekaj, aż na ekranie dotykowym pojawi się moc nominalna (50 kV i 1 mA). Jeśli wymagany jest inny poziom mocy, przejdź do ekranu konfiguracji, naciskając „R4” na ekranie dotykowym i wprowadzając żądane ustawienia.

3. Procedura obsługi chillera

1. Przełącz przełącznik zasilania w panelu sterowania temperaturą do pozycji „ON”. Zapali się lampka kontrolna oraz wyświetlacz temperatury LED.
2. Przełącz przełącznik zasilania w chillerze do pozycji „ON”.
3. Odczekaj, aż na wyświetlaczu temperatury pojawi się napis „OFF”. Jest to tryb czuwania.
4. Naciśnij i przytrzymaj przycisk enter (symbol powrotu) przez około 4 sec lub do momentu, gdy wyświetlacz temperatury wskaże aktualną temperaturę.
5. Aby zmienić temperaturę, naciśnij strzałkę w górę lub w dół. Wartość zadana będzie wyświetlana na ekranie przez około 8 sec, po czym wyświetlacz powróci do wskazywania wartości aktualnej.
6. Po wyświetleniu żądanej wartości zadanej naciśnij przycisk enter. Spowoduje to zapisanie tej wartości.
7. Odczekaj, aż aktualna temperatura osiągnie żądaną wartość zadaną.

UWAGA: Jeśli na wyświetlaczu temperatury pojawi się błąd „E 01”, należy postępować zgodnie z instrukcjami wyłączania urządzenia chłodzącego (Chiller Shutdown), uzupełnić wodę w kąpieli, wlewając wodę oczyszczoną do otworu napełniającego zbiornik, a następnie ponownie przeprowadzić procedurę uruchamiania urządzenia (Startup).

4. Wyłączanie chłodziarki

1. Naciśnij przycisk „enter” i przytrzymaj go przez około 4 sec.
2. Przełącz wyłącznik zasilania w pozycję „OFF”.

5. Włączenie próżni

1. Upewnij się, że drzwi komory próżniowej są szczelnie zamknięte.
2. Przekręć pokrętła Vacuum 1 i 2 do pozycji „ON”.
3. Odczekaj, aż manometr próżniowy VAP5 wskaże poziom próżni poniżej 1,5 mbar.

6. Konfiguracja systemu detektora

1. Aby ustawić ciśnienie gazu, należy sprawdzić, czy główny manometr zaworu redukcyjnego wskazuje co najmniej 10 bar.
2. Otwórz zawór główny.
3. Powoli otwieraj zawór ciśnienia roboczego, aż ciśnienie na manometrze ciśnienia roboczego osiągnie 8 bar.
4. Otwórz drugi zawór główny.
5. Aby wyregulować przepływ gazu, otwórz zawór ciśnienia głównego, przekręcając pokrętło do pozycji pionowej na panelu sterowania gazem.
6. Reguluj szybkość przepływu za pomocą zaworu iglicowego, aż manometr wskaże około 8 bar.
7. Przełącz główny wyłącznik zasilania w pozycję „ON”. Dioda LED powinna się zaświecić.
8. Aby ustawić wysokie napięcie, aktywuj je, przełączając przełącznik w pozycję „ON”. Dioda LED powinna się zaświecić.
9. Powoli przekręcaj pokrętło regulacji napięcia, aż na mierniku zostanie osiągnięta wartość około 3,5kV. NIE PRZEKROCZ 4kV.

7. Kalibracja

1. Powyższe kroki eksperymentalne wykonuje się na próbce o znanych pikach.
2. Oprogramowanie ASA 3.3 służy do uzyskania wykresu intensywności w funkcji kanału z 5 pikami.
3. Przejdź do Menu → Options → Enter channels and corresponding intensities.
4. W programie ASA3 przejdź najpierw do karty „TPF”.
5. W górnym lewym rogu zmień filtr na 1 mm Nickel (beam filter).
6. Ustaw pozycję 32 000 (zakres od 28 000 do 32 000, obszar krytyczny wokół 28 000) → przejdź do tej pozycji, upewnij się, że próżnia wynosi poniżej 5 mbar oraz że detektor wskazuje wartość od 1k do 10K.
7. Wykonaj pomiar przez 10 sec, aby uzyskać około 52 counts per sec.
8. Zmień okna energetyczne (lub zmierz okno energetyczne dla samej próbki, bez obudowy filtra). Ustaw końcowy pomiar na 10 sec.
9. Wyznacz położenie wiązki pierwotnej (na przykład kanał 233).
10. W przypadku kolejnych pomiarów ponownie zmień filtr na 2 mm Tungsten (W, beam stopper) i zacznij od wartości 30 000.
11. Wyznacz położenie wszystkich pozostałych piki próbek.
12. Użyj oprogramowania ImageJ-macro do kalibracji SAXS – dokonując przejścia z intensywności w funkcji kanału na intensywność w funkcji q (lub odstęp d) (Rysunek 1).
13. Użyj oprogramowania ImageJ-macro do kalibracji WAXS – dokonując przejścia z intensywności w funkcji kanału na intensywność w funkcji q (lub odstęp d) (Rysunek 2).

8. Procedura oprogramowania

1. Użyj oprogramowania ASA 3.3 do zbierania danych na żywo: Live Data→ karta TPF→ Save file.
2. W przypadku EasySWAXS kliknij kartę Device Settings.
3. Wprowadź wartości „a”, lambda i d oraz środek ciężkości.
4. Wybierz Point Collimation.
5. Wybierz typ cząstki Globular (chyba że wiadomo, iż jest to cząstka w kształcie pręta lub płaskiego dysku).
6. Kliknij kartę Guinier-Plot. Wyświetlony zostanie wykres I vs. q².
7. Przesuń linie pionowe tak, aby objęły odcinek o w przybliżeniu liniowym nachyleniu.
8. W dolnej części ekranu wyświetli się wartość R. Obok niej znajduje się wymóg walidacji.
9. Przesuwaj linie pionowe bliżej siebie, aż wartość walidacji znajdzie się w przedziale od 1 do 2. Jest to proces subiektywny. Uzyskana wartość R, czyli promień gyracji, jest wartością szacunkową.

9. Procedura wyłączania źródła

1. Upewnij się, że przesłony zabezpieczające i szybkie są zamknięte.
2. Przekręć klucz Standby do pozycji „ON”.
3. Odczekaj, aż ekran dotykowy odczyta poziomy stanu czuwania.
4. Naciśnij przycisk R5 na ekranie dotykowym.
5. Zmniejsz natężenie prądu do 0 A.
6. Zmniejsz napięcie do 0 A.
7. Przekręć klucz X-ray do pozycji „OFF”.
8. Wyłącz główne zasilanie, naciskając czerwony przycisk wyłączania.

Wyniki

SAXS i WAXS łącznie mogą dostarczyć informacji strukturalnych o próbce poprzez następujące parametry: promień żyracji, rozmiar i kształt cząstek, czynnik strukturalny roztworu, właściwą powierzchnię wewnętrzną i rozmiar porów, typ i wymiary sieci oraz gęstość elektronową. SAXS i WAXS mogą być również stosowane w badaniach dynamiki białek ¹.

Informacje strukturalne z eksperymentów SWAXS uzyskuje się poprzez porównanie widm wykrytych doświadczalnie z wynikami obliczeniowymi systemu. W...

Dyskusja

Procedura porównawcza systemu SWAXS umożliwia wyznaczenie licznych zmiennych na podstawie analizy eksperymentalnej. Parametry uzyskane z analizy mogą być wykorzystywane do różnych celów, w zależności od próbki i konfiguracji eksperymentalnej. SAXS dostarcza informacji o rozmiarze i kształcie obiektów w skali nanometrycznej, podczas gdy WAXS koncentruje się na strukturze w skali atomowej i mikroskopowej (np. sieć molekularna, symetria wymiarów komórki jednostkowej). Bardziej szczegółowo, w przypadku cząstek w roz...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Kamera do mało- i szerokokątnego rozpraszania promieni rentgenowskich (SWAXS) System3	Hecus XRS i IBN, Graz, Austria
GNOM	Pakiet ATSAS 2.3 opracowany przez D. Sverguna, EMBL-Hamburg