Badania biologicznych makrocząsteczek w roztworach z wykorzystaniem małokątowego i szerokokątowego rozpraszania promieni rentgenowskich

Podsumowanie

Demonstracja procedury małokątnego i szerokokątnego rozpraszania promieni rentgenowskich (SWAXS) stała się kluczowa w badaniu biologicznych makrocząsteczek. Dzięki zastosowaniu aparatury oraz procedur przygotowania i metod specyficznych kątów, dane eksperymentalne z SWAXS pozwalają na charakteryzację makrocząsteczek w skali atomowej i nanometrycznej.

Streszczenie

W niniejszej pracy zaprezentowano analizę makrocząsteczek z wykorzystaniem rozpraszania promieni rentgenowskich pod małym i szerokim kątem (SWAXS) w drodze eksperymentów. SWAXS to technika, w której promienie rentgenowskie są rozpraszane sprężystie przez niejednorodną próbkę w zakresie nanometrycznym pod małymi kątami (zazwyczaj 0,1 - 5°) oraz szerokimi kątami (zazwyczaj > 5°). Technika ta dostarcza informacji o kształcie, rozmiarze i rozkładzie makrocząsteczek, charakterystycznych odległościach w materiałach częściowo uporządkowanych, wielkościach porów oraz stosunku powierzchni do objętości. Rozpraszanie promieni rentgenowskich pod małym kątem (SAXS) pozwala na uzyskanie informacji strukturalnych o makrocząsteczkach o rozmiarach od 1 do 200 nm, natomiast rozpraszanie promieni rentgenowskich pod szerokim kątem (WAXS) może rozdzielić jeszcze mniejsze odstępy Bragga w próbkach, w zakresie od 0,33 nm do 0,49 nm, w zależności od konfiguracji systemu i detektora. Odstęp ten wyznacza się na podstawie prawa Bragga i zależy on od długości fali oraz kąta padania.

W eksperymencie SWAXS materiały mogą być w stanie stałym lub ciekłym i mogą zawierać domeny stałe, ciekłe lub gazowe (tzw. cząstki) tego samego lub innego materiału w dowolnej kombinacji. Zastosowania SWAXS są bardzo szerokie i obejmują koloidy wszystkich typów: metale, kompozyty, cement, oleje, polimery, tworzywa sztuczne, białka, żywność i farmaceutyki. W przypadku próbek stałych grubość jest ograniczona do około 5 mm.

W niniejszej pracy szczegółowo opisano sposób wykorzystania laboratoryjnego instrumentu SWAXS. Dzięki dostępnemu oprogramowaniu dla systemu SWAXS (np. pakietowi GNOM-ATSAS 2.3 opracowanemu przez D. Sverguna z EMBL-Hamburg oraz oprogramowaniu EasySWAXS) można przeprowadzić eksperyment w celu wyznaczenia określonych parametrów interesujących dla danej próbki. Przykładem eksperymentu z makrocząsteczką biologiczną jest analiza 2% wag. lizozymu w wodnym buforze, który można dobrać i przygotować na wiele sposobów. Przygotowanie próbki odbywa się zgodnie z wytycznymi przedstawionymi w poniższej sekcji Przygotowanie próbki. Dzięki badaniom SWAXS można przeanalizować istotne parametry strukturalne lizozymu, np. promień żyracji.

Protokół

1. Przygotowanie próbki

1. Za pomocą igły pobrać niewielką ilość próbki z pojemnika z próbką.*
2. Użyć igły do napełnienia kapilary (o maksymalnej średnicy 2,2 mm) próbką. Kapilara musi zostać napełniona na wysokość od 2 do 3 cm od dna.
3. Zamknąć kapilarę, topiąc wosk na jej końcówce.
4. Odkręcić próżniowy uchwyt na próbkę z systemu.
5. Chwycić kapilarę za zlutowany koniec (koniec z woskiem) i włożyć niezlutowany koniec do uchwytu na próbkę.
6. Umieścić uchwyt z powrotem w systemie i przykręcić.

* Próbki stałe (w tym próbki w proszku) można umieszczać bezpośrednio w uchwycie na próbki (kapilara nie jest wymagana), natomiast próbki ciekłe muszą być umieszczone w kapilarze.

Uruchamianie urządzenia SWAXS

2. Procedura zimnego startu źródła

1. Zamknij migawkę, naciskając przycisk bezpieczeństwa migawki.
2. Włącz zasilanie główne, naciskając zielony przycisk włączania.
3. Upewnij się, że przycisk wyłącznika awaryjnego znajduje się w pozycji wysuniętej.
4. Włącz zasilanie główne, naciskając zielony przycisk.
5. Sprawdź, czy dioda blokady jest zielona, co oznacza, że wszystkie blokady działają prawidłowo.
6. Odczekaj, aż ekran dotykowy się załaduje. Po załadowaniu wybierz opcję „R6” z menu.
7. Przekręć klucz trybu czuwania (Standby) do pozycji „ON”.
8. Przekręć klucz promieniowania rentgenowskiego do pozycji „ON”. Powinna zapalić się czerwona lampka ostrzegawcza X-ray.
9. Odczekaj, aż na ekranie dotykowym zostaną wyświetlone wartości trybu czuwania (30 kV i 0,4 mA).
10. Przekręć klucz bezpieczeństwa trybu czuwania do pozycji „OFF”. Naciśnij przycisk „Start Cycle” w dolnej części ekranu dotykowego.
11. Odczekaj, aż na ekranie dotykowym zostanie wyświetlona moc nominalna (50 kV i 1 mA). Jeśli wymagany jest inny poziom mocy, wejdź do ekranu konfiguracji, naciskając „R4” na ekranie dotykowym i wprowadzając pożądane ustawienia.

3. Procedura obsługi chłodzenia

1. Przełącz przełącznik zasilania w panelu sterowania temperaturą do pozycji „ON”. Zapali się kontrolka oraz wyświetlacz LED temperatury.
2. Przełącz przełącznik zasilania w chillerze do pozycji „ON”.
3. Odczekaj, aż na wyświetlaczu temperatury pojawi się napis „OFF”. Jest to tryb czuwania.
4. Naciśnij i przytrzymaj przycisk enter (symbol powrotu) przez około 4 s lub do momentu, aż wyświetlacz temperatury wskaże aktualną temperaturę.
5. Aby zmienić temperaturę, naciśnij strzałkę w górę lub w dół. Wartość zadana będzie wyświetlana na ekranie przez około 8 s, zanim powróci do wyświetlania wartości aktualnej.
6. Po wyświetleniu żądanej wartości zadanej naciśnij przycisk enter. Spowoduje to zapisanie tej wartości.
7. Odczekaj, aż aktualna temperatura osiągnie żądaną wartość zadaną.

UWAGA: Jeśli w dowolnym momencie na wyświetlaczu temperatury pojawi się błąd „E 01”, należy postępować zgodnie z instrukcją wyłączania chłodzenia (Chiller Shutdown), ponownie napełnić jednostkę kąpieli, wlewając wodę oczyszczoną do otworu napełniającego zbiornik, a następnie ponownie przeprowadzić procedurę uruchamiania chłodzenia (chiller Startup).

4. Wyłączanie chiller'a

1. Naciśnij przycisk „enter” i przytrzymaj go przez około 4 s.
2. Przełącz przełącznik zasilania w pozycję „OFF”.

5. Włączenie próżni

1. Upewnij się, że drzwi komory próżniowej są odpowiednio zabezpieczone.
2. Przekręć pokrętła Vacuum 1 i 2 do pozycji „ON”.
3. Odczekaj, aż manometr próżniowy VAP5 wskaże poziom próżni poniżej 1,5 mbar.

6. Konfiguracja systemu detekcji

1. Aby ustawić ciśnienie gazu, należy upewnić się, że główny manometr zaworu redukcyjnego wskazuje co najmniej 10 bar.
2. Otwórz zawór główny.
3. Powoli otwieraj zawór ciśnienia roboczego, aż ciśnienie na manometrze ciśnienia roboczego osiągnie 8 bar.
4. Otwórz drugi zawór główny.
5. Aby wyregulować przepływ gazu, otwórz zawór ciśnienia głównego, obracając pokrętło do pozycji pionowej na panelu sterowania gazem.
6. Reguluj natężenie przepływu za pomocą zaworu iglicowego, aż manometr wskaże około 8 bar.
7. Przełącz główny wyłącznik zasilania w pozycję „ON”. Powinna zaświecić się dioda LED.
8. Aby ustawić wysokie napięcie, aktywuj je, przełączając przełącznik w pozycję „ON”. Powinna zaświecić się dioda LED.
9. Powoli obracaj pokrętło regulacji napięcia, aż na mierniku zostanie osiągnięta wartość około 3,5kV. NIE PRZEKROCZAĆ 4kV.

7. Kalibracja

1. Powyższe kroki eksperymentalne wykonuje się na próbce o znanych pikoch.
2. Oprogramowanie ASA 3.3 jest wykorzystywane do uzyskania wykresu intensywności w funkcji kanału z 5 pikami.
3. Przejdź do Menu → Options → Enter channels and corresponding intensities.
4. W programie ASA3 przejdź najpierw do karty „TPF”.
5. Zmień filtr w lewym górnym rogu na 1 mm Nickel (beam filter).
6. Ustaw pozycję na 32 000 (zakres od 28 000 do 32 000, obszar krytyczny w okolicach 28 000) → przejdź do pozycji, upewnij się, że próżnia wynosi poniżej 5 mbar oraz że detektor wskazuje wartość między 1k a 10K.
7. Wykonaj pomiar przez 10 sec, aby uzyskać około 52 counts per sec.
8. Zmień okna energii (lub zmierz okno energii dla samej próbki, bez obudowy filtra). Ustaw ostateczny pomiar na 10 sec.
9. Znajdź położenie wiązki pierwotnej (na przykład kanał 233).
10. W przypadku pozostałych pomiarów ponownie zmień filtr na 2 mm Tungsten (W, beam stopper) i zacznij od 30 000.
11. Znajdź położenie wszystkich pozostałych pikoów w próbkach.
12. Użyj oprogramowania ImageJ-macro do kalibracji SAXS – dokonując przejścia z intensywności w funkcji kanału na intensywność w funkcji q (lub odstęp d) (Rysunek 1).
13. Użyj oprogramowania ImageJ-macro do kalibracji WAXS – dokonując przejścia z intensywności w funkcji kanału na intensywność w funkcji q (lub odstęp d) (Rysunek 2).

8. Procedura programowa

1. Użyj oprogramowania ASA 3.3, aby zebrać dane na żywo: Live Data→ karta TPF→ Save file.
2. W przypadku EasySWAXS kliknij kartę Device Settings.
3. Wprowadź wartości „a”, lambda i d, a także środek ciężkości.
4. Wybierz Point Collimation.
5. Wybierz typ cząsteczki Globular (chyba że wiadomo, iż jest to cząsteczka w kształcie pręta lub płaska).
6. Kliknij kartę Guinier-Plot. Wyświetlony zostanie wykres I w funkcji q².
7. Przesuń linie pionowe tak, aby objęły odcinek o w przybliżeniu liniowym nachyleniu.
8. Na dole ekranu wyświetli się wartość R. Obok niej znajduje się wymóg walidacji.
9. Przesuwaj linie pionowe bliżej siebie, aż wartość walidacji znajdzie się w przedziale od 1 do 2. Jest to proces subiektywny. Uzyskana wartość R, czyli promień bezwładności, jest wartością szacunkową.

9. Procedura wyłączania źródła

1. Upewnij się, że osłony bezpieczeństwa i szybkie migawki są zamknięte.
2. Przekręć klucz Standby do pozycji „ON”.
3. Odczekaj, aż ekran dotykowy odczyta poziomy trybu czuwania.
4. Naciśnij R5 na ekranie dotykowym.
5. Zredukuj natężenie prądu do 0 A.
6. Zredukuj napięcie do 0 A.
7. Przekręć klucz X-ray do pozycji „OFF”.
8. Wyłącz główne zasilanie, naciskając czerwony przycisk wyłącznika.

Wyniki

Metody SAXS i WAXS łącznie mogą dostarczyć informacji strukturalnych o próbce poprzez następujące parametry: promień żyroskopowy, rozmiar i kształt cząstek, czynnik strukturalny roztworu, właściwą powierzchnię wewnętrzną i rozmiar porów, typ i wymiary sieci krystalicznej oraz gęstość elektronową. SAXS i WAXS mogą być również stosowane w badaniach dynamiki białek ¹.

Informacje strukturalne z eksperymentów SWAXS uzyskuje się poprzez porównanie widm wykrytych doświadczalnie z wynikami ...

Dyskusja

Procedura porównawcza systemu SWAXS pozwala na wyznaczenie licznych zmiennych na podstawie analizy eksperymentalnej. Parametry uzyskane z analizy mogą być wykorzystywane do różnych celów, w zależności od próbki i konfiguracji eksperymentu. SAXS dostarcza informacji o rozmiarze i kształcie obiektu w skali nanometrycznej, podczas gdy WAXS koncentruje się na strukturze w skali atomowej i mikrometrycznej (np. sieć molekularna, symetria wymiarów komórki elementarnej). Bardziej szczegółowo: w przypadku cząstek w roztw...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Kamera do mało- i szerokokątnego rozpraszania promieni rentgenowskich (SWAXS) System3	Hecus XRS i IBN, Graz, Austria
GNOM	Pakiet ATSAS 2.3 opracowany przez D. Sverguna, EMBL-Hamburg