On-Chip Śródbłonkowe fenotypowanie zapalne

Podsumowanie

Mikroprzepływowe komory przepływowe wytrawione przez fotolitografię i wykonane z PDMS są stosowane do badania funkcjonalnych wyników związanych z dysfunkcją EC i stanem zapalnym. W reprezentatywnym eksperymencie wykazano zdolność różnicowego naprężenia ścinającego do modulowania adhezji komórek monocytowych do monowarstw EC aktywowanych cytokinami.

Streszczenie

Miażdżyca jest wzmacniana przez nieprawidłowości metaboliczne, które przyczyniają się do podwyższonego stanu zapalnego ogólnoustrojowego, co prowadzi do dysfunkcji śródbłonka. Jednak wczesne zmiany funkcjonalne w śródbłonku, które oznaczają indywidualny poziom ryzyka, nie są bezpośrednio oceniane klinicznie, aby pomóc w kierowaniu strategią terapeutyczną. Co więcej, regulacja stanu zapalnego przez lokalną hemodynamikę przyczynia się do nielosowego rozkładu przestrzennego miażdżycy, ale mechanizmy są trudne do nakreślenia in vivo. Opisujemy podejście oparte na lab-on-a-chip do ilościowego oznaczania zaburzeń metabolicznych zdarzeń zapalnych w ludzkich komórkach śródbłonka (EC) i monocytach w precyzyjnych warunkach przepływu. Standardowe metody miękkiej litografii są stosowane do mikrowytwarzania naczyniowych mimetycznych komór mikroprzepływowych (VMMC), które są wiązane bezpośrednio z hodowanymi monowarstwami EC. ¹ Urządzenia te mają tę zaletę, że wykorzystują małe objętości odczynników, zapewniając jednocześnie platformę do bezpośredniego obrazowania zdarzeń zapalnych na błonie EC wystawionej na działanie dobrze zdefiniowanego pola ścinającego. Z powodzeniem zastosowaliśmy te urządzenia do badania zapalenia wywołanego cytokinami-,^{2 lipidami-3, 4} i RAGE⁵ w ludzkim EC aorty (HAEC). Tutaj dokumentujemy zastosowanie VMMC do oznaczania toczenia i zatrzymywania komórek monocytowych (THP-1) na monowarstwach HAEC, które są kondycjonowane pod różnicową charakterystyką ścinania i aktywowane przez cytokinę zapalną TNF-α. Badania takie jak te dostarczają mechanistycznego wglądu w podatność na miażdżycę w przypadku metabolicznych czynników ryzyka.

Protokół

1. Hodowla komórkowa i przygotowanie substratu

1. Wytnij 3-calowe okrągłe podłoża z naczynia do hodowli tkankowych o wymiarach 100 x 20 mm (BD Falcon) za pomocą tokarki. Sterylizuj podłoża przez zanurzenie w 70% etanolu. Umieścić na szalce Petriego i pokryć 4 ml kolagenu typu I (100 μg/ml) przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej, a następnie spłukać 4 ml 1 x PBS.
2. Zawiesić ludzkie komórki śródbłonka aorty (HAEC, pasaż 4-6) w stężeniu 6,5x10⁵ komórek/ml i wysiać, nakładając 1 ml bezpośrednio na podłoże. Umieścić w inkubatorze o temperaturze 37 °C, 5% CO₂ i pozostawić komórki do przylegania do podłoża przez 1 godzinę.
3. Dodać do komórek 9 ml pożywki Endothelial Growth Medium-2 (EGM-2) uzupełnionej 1x roztworem antybiotykowo-przeciwgrzybiczym. Zmieniaj pożywkę co 2 dni, aż komórki osiągną 90% konfluencji.
4. Utrzymuj komórki THP-1 w pożywce RPMI 1640 uzupełnionej 10% FBS i 1x roztworem antybiotykowo-przeciwgrzybiczym. Komórki pasażowe, gdy osiągną gęstość 10⁶ komórek/ml.

2. Protokół ścinania komórek

Komórki są kondycjonowane w niestandardowym urządzeniu do ścinania komórek (CSD) w kształcie stożka i płytki. Szczegóły urządzenia i specyfikacje konstrukcyjne są udokumentowane w tabeli 1 i na rysunku 4.

1. Przygotowanie CDPW. Wysterylizuj obudowę komory etanolem i spłucz sterylnym PBS. Podgrzej obudowę do 37 °C i wypoziomuj, aby upewnić się, że stożek jest prostopadły do monowarstwy ogniwa. Zmontuj podłoże z komórkami od spodu obudowy i ustaw stożek na żądaną wysokość.
2. Użyj pożywki Leibovitz-15 (L-15) uzupełnionej zestawem Endothelial BulletKit jako pożywki ścinającej, aby utrzymać prawidłowe pH przy braku  CO₂ . W celu pobudzenia stanu zapalnego należy dodać czynnik martwicy nowotworu-α (TNF-α, 0,5 ng/ml) do podłoża ścinającego i wstrzyknąć 6 ml do urządzenia za pomocą strzykawki podłączonej do portu wlotowego, uważając, aby nie wprowadzić pęcherzyków powietrza do komory.
3. Ogniwa ścinające przy stałym naprężeniu ścinającym o dużej wielkości (HSS, 15 dyn/cm²) lub oscylacyjnym naprężeniu ścinającym (OSS, 0 ± 5 dyn/cm², 1 Hz) przez 4 godziny. Pożądany SS uzyskuje się poprzez obrócenie stożka nad komórkami, który jest precyzyjnie sterowany za pomocą silnika mikrokrokowego, jak opisano wcześniej. ⁶ Ściana SS na powierzchni (τ_w) jest aproksymowana wzorem:
   
   gdzie μ jest lepkością ośrodka, ω jest prędkością kątową stożka, a α jest kątem stożka (0,5°). Wyrównanie stożka z podłożem jest regulowane z dokładnością do 0,05° poprzez precyzyjne poziomowanie i wysokość szczeliny ustawianą na 20 ± 10 μm za pomocą głębokościomierza, aby zminimalizować zmiany obwodowe i promieniowe w τ_w. Urządzenie zostało zwalidowane w celu zapewnienia charakterystyki przepływu laminarnego. Usuń komórki z urządzenia i przygotuj się do analizy adhezji monocytów.

3. Produkcja komory mikroprzepływowej PDMS

1. Uzyskaj formę wzorcową dla żądanej liczby kanałów mikroprzepływowych i wysokości kanału w zależności od zastosowania. Charakterystykę konkretnego projektu zastosowanego w niniejszym protokole wyszczególniono w tabeli 1. Sposób ich tworzenia jest już dobrze udokumentowany w literaturze.¹ Krótko mówiąc, sieć kanałów jest projektowana za pomocą oprogramowania CAD (Autodesk Inventor) i drukowana w rozdzielczości 5000 dpi na folii przezroczystej. Fotorezyst ujemny (SU8) jest przędzony na płytce krzemowej o grubości 100 μm. Przezroczystość jest nakładana i wystawiana na działanie światła UV. Niespolimeryzowany fotorezystor jest usuwany w celu wygenerowania dodatniego wzorca repliki.
2. Aby przygotować roztwór PDMS, należy zmieszać bazę silikonową z utwardzaczem silikonowym w stosunku wagowym 10:1 w łódce wagowej i wymieszać pipetą serologiczną o pojemności 5 ml. Uważaj, aby nie zeskrobać ścianek łodzi wagowej, aby uniknąć dodania plastikowych płatków do roztworu.
3. Umieść wafel wzorcowy na szalce Petriego o wymiarach 100x15mm i wlej roztwór PDMS do naczynia.
4. Przykryj naczynie i umieść je w pojemniku próżniowym na 15 minut, aby usunąć bąbelki. Po 15 minutach wyjmij szalkę Petriego i usuń nadmiar pęcherzyków, delikatnie wdmuchując powietrze na powierzchnię.
5. Umieść szalkę Petriego w piekarniku na 1 godzinę w temperaturze 70 °C. Wyjmij naczynie i wytnij komory mikroprzepływowe za pomocą ostrego ostrza.

4. Montaż urządzenia na mikroskopie

1. Włączyć źródło światła do odwróconego mikroskopu i ustawić grzałkę na 37 °C. Podłączyć rurkę do strzykawki o pojemności 10 ml i napełnić wodą destylowaną tak, aby nie było pęcherzyków. Umieścić strzykawkę w pompie strzykawkowej i ustawić natężenie przepływu tak, aby wywołać ściankę SS równą 1 dyn/^cm2. Naprężenie ścinające ścianki (τ_w) generowane wzdłuż linii środkowej kanału jest aproksymowane przy użyciu standardowego równania dla komory przepływowej z płytą równoległą:
   
   gdzie μ to lepkość medium, Q to objętościowe natężenie przepływu, h to wysokość kanału, a w to szerokość kanału. Uwaga: ponieważ kanały mają skończoną szerokość, rzeczywiste τ_w będzie się różnić wraz z w w w zależności od proporcji kanału, a pomiary są unikane w 25% najbliższych ścian bocznych.^1,7
2. Umieść komorę PDMS w wodzie i użyj mikropipety o pojemności 100 μl, aby usunąć powietrze z poszczególnych kanałów. Podłącz adapter próżniowy do komory, upewniając się, że zawór jest wyłączony.
3. Umieść szalkę Petriego z monowarstwą HAEC na obiektywie. Umieść komorę PDMS nad szalką Petriego i ostrożnie ustaw ją na monowarstwie HAEC, upewniając się, że między urządzeniem a monowarstwą nie tworzą się pęcherzyki powietrza. Przekręć zawór tak, aby próżnia była włączona, a komora była mocno zamocowana.
4. Wytnij igły o rozmiarze 19 tak, aby pozostało tylko 5 mm metalu. Napełnij plastikowy zbiornik buforem i włóż do wejścia do komory PDMS. Powtórz te czynności dla odpowiedniej liczby kanałów, które mają być używane. Podłącz rurki z pomp strzykawkowych do wyjść kanałów PDMS.

5. Test adhezji monocytów pod wpływem naprężenia ścinającego

1. Zawiesić komórki THP-1 przy 2x10⁶ komórek/ml w HBSS + Ca²⁺ / Mg²⁺ + 0,1% HSA. Aktywuj komórki THP-1 przez inkubację z czynnikiem pochodzącym ze zrębu-1 (SDF-1, 50 μg/ml) przez 15 minut w temperaturze pokojowej.
2. Włączyć pompę strzykawkową, aby ustalić przepływ, a następnie dodać 50 μl zawiesiny komórek do zbiornika bez wprowadzania pęcherzyków powietrza. Gdy przepływ zostanie w pełni opracowany, rozpocznij pobieranie danych.
3. Pracować przez 5 minut przy odpowiednim natężeniu przepływu, dodając bufor do zbiornika, jeśli roztwór się wyczerpie. Kontynuuj przepływ buforu do kanałów, aby wypłukać wszelkie niezwiązane komórki w strumieniu przepływu.

6. Akwizycja i analiza danych

1. Uzyskuj cyfrowe sekwencje obrazów z prędkością 3 klatek/s przez 2 minuty po w pełni rozwiniętym przepływie wzdłuż osi podłużnej kanału w 3 miejscach kanału, uważając, aby nie nagrywać bezpośrednio po wejściu lub przed portami wyjściowymi lub w 25% najbliżej ścian bocznych.
2. Policz liczbę zatrzymanych komórek w polu, identyfikując ich jasny fazowo wygląd w tej samej płaszczyźnie ogniskowej co monowarstwa.
3. Mocne zatrzymanie komórek definiuje się jako ruch < 1/2 średnicy komórki w ciągu 10 s. Uśrednij dane z 3 losowych pól / kanał i określ ilościowo za pomocą oprogramowania ImageJ.

7. Reprezentatywne wyniki

Chociaż śródbłonek naczyń krwionośnych jest jednolicie narażony na działanie agonistów, które przyczyniają się do ogólnoustrojowego stanu zapalnego, miażdżyca jest chorobą centralną, która rozwija się preferencyjnie w miejscach zaburzeń przepływu w tętnicach, co implikuje przestrzenną heterogeniczność funkcji śródbłonka. ⁸ Krążące mediatory stanu zapalnego, takie jak TNF-α, są podwyższone w ludzkiej surowicy pod wpływem stresu metabolicznego i korelują z upośledzoną funkcją śródbłonka. ^{9, 10} TNF-α indukuje dobrze scharakteryzowaną odpowiedź w EC, która obejmuje regulację w górę cząsteczek adhezyjnych komórek (CAM; np. VCAM-1, ICAM-1, E-selektyna) i chemokin, które rekrutują monocyty z krążenia, co jest cechą charakterystyczną wczesnej zmiany miażdżycowej. ¹¹ Hemodynamika jest ważnym regulatorem fenotypu zapalnego śródbłonka. ¹² Naprężenie ścinające o dużej wielkości (HSS; np. 15 dyn/^cm2) lub pulsacyjne naprężenie ścinające (PSS; np. 15 ± 5 dyn/^cm2) związane z miejscami oporności na miażdżycę tętnic w tętnicach obniżają reakcje indukowane przez TNF-α. I odwrotnie, naprężenie ścinające o małej wielkości (LSS; np. 2 dyn/cm²) lub ścinanie oscylacyjne (OSS; np. 0 ± 5 dyn/cm²), charakterystyczne dla podatnych miejsc in vivo, nasila stan zapalny wywołany cytokinami. ^{13, 14} Nasze mikroprzepływowe urządzenia PDMS stanowią platformę do prowadzenia badań mechanistycznych w celu testowania hipotez związanych z superpozycją stresu metabolicznego z czynnikami hydrodynamicznymi w regulacji funkcji śródbłonka i patologii. Użyteczność i wszechstronność tego podejścia jest szeroko zilustrowana za pomocą poniższych reprezentatywnych wyników.

Rysunek 1. Naprężenie ścinające w różny sposób moduluje adhezję komórek THP-1 do monowarstw śródbłonka objętych stanem zapalnym TNF-α. Dane te zostały pozyskane przy użyciu szczegółowego protokołu opisanego powyżej i udokumentowane w filmie. Monowarstwy HAEC były jednocześnie wystawione na działanie niskiej dawki cytokiny zapalnej TNF-α (0,5 ng / ml, ~EC₅₀ dla regulacji w górę VCAM-1) i HSS (15 dyn / cm²) lub OSS (0 ± 5 dyn^{/ cm 2}, 1 Hz) w niestandardowym CSD przez 4 godziny, jak opisano w szczegółowym protokole. Zatrzymanie komórek THP-1 określono ilościowo pod wpływem przepływu ścinającego w komorze przepływowej PDMS. Ta linia komórkowa, która naśladuje fenotyp ludzkich monocytów, została wybrana ze względu na jej powtarzalność i łatwość użycia. HSS osłabił odpowiedź zapalną w porównaniu z OSS, co spowodowało zmniejszenie zatrzymania komórek THP-1. Dane zostały przeanalizowane za pomocą testu t Studenta i są reprezentowane jako średnia SEM ± 3 niezależnych eksperymentów. Zaadaptowane za zgodą DeVerse et al.⁵

Poniższe dane pokazują wszechstronność naszego podejścia na przykładzie z naszej opublikowanej pracy. W stosownych przypadkach wskazane są odstępstwa od powyższego protokołu.

Rysunek 2. Modulacja indukowanej cytokinami ekspresji VCAM-1 i rekrutacji monocytów w gradiencie naprężeń ścinających. A) Monowarstwy HAEC stymulowano TNF-α (0,3 ng / ml) przez 4 godziny pod przepływem w VMMC zaprojektowanym w oparciu o teorię przepływu Helego-Shawa. ¹⁵ Liniowy spadek wielkości SS wzdłuż linii środkowej kanału osiągnięto poprzez zaprojektowanie ścian bocznych komory tak, aby pokrywały się z liniami strumienia dwuwymiarowego przepływu stagnacyjnego i ukształtowanie końca kanału tak, aby pasował do linii potencjału izo. Naprężenie ścinające ścianki (τ_w) generowane wzdłuż osi tego kanału w odległości osiowej od wejścia (x) jest określone wzorem:

gdzie μ to lepkość medium, Q to objętościowe natężenie przepływu, h to wysokość kanału, w₁ to szerokość wejścia do kanału, a L to całkowita długość kanału. Q wybrano do wygenerowania gradientu wielkości SS od 16 dyn/^cm2 na wlocie do 0 w punkcie stagnacji "a" tuż proksymalnie do wylotu. B)-C) VCAM-1 mierzono in situ za pomocą mikroskopii immunofluorescencyjnej przy użyciu przeciwciał sprzężonych z kropkami kwantowymi i przedstawionych jako procentowa mediana intensywności fluorescencji (MFI) niestymulowanej kontroli statycznej. SS nie modulował podstawowego poziomu VCAM-1, który jest niski w niestymulowanym HAEC (szare trójkąty). Jednak ekspresja VCAM-1 wzrosła w stosunku do TNF-α przy wielkościach LSS, osiągając szczyt przy ~ 2 dynach^{/ cm 2} i wracając do linii podstawowej TNF-α lub poniżej przy wielkościach ścinania > 5 dyn / cm² (czarne kwadraty). D) Monocyty (10⁶ / ml) perfundowano przy 2 dynach^{/ cm 2} przez 5 minut w równoległych kanałach przepływu nad monowarstwami wstępnie kondycjonowanymi jak w A). Rekrutacja monocytów do śródbłonka ilościowo skorelowana z ekspresją VCAM-1 przy danej wielkości naprężenia ścinającego. Warto zauważyć, że możliwość badania ekspresji VCAM-1 i rekrutacji monocytów z drobną rozdzielczością przestrzenną w monowarstwie ujawniła znaczące zmiany w wąskim zakresie wielkości SS, które nie zostałyby docenione przy zastosowaniu tylko kilku dyskretnych wartości ścinania w oddzielnych eksperymentach. Dane analizowano za pomocą powtarzanych pomiarów ANOVA i różnic ocenianych za pomocą posttestu Newmana-Keulsa, *P < 0,05 z TNF-α w warunkach statycznych. Dane są średnie ± SEM z 3-6 niezależnych eksperymentów. Zaadaptowano za zgodą Tsou et al.^{cyfra arabska}

Rysunek 3. Lipoproteiny bogate w trójglicerydy (TGRL) modulują stan zapalny wywołany cytokinami proporcjonalnie do poziomu trójglicerydów w surowicy dawcy i ekspresji VCAM-1. Monowarstwy HAEC stymulowano TNF-α (0,3 ng / ml) przez 4 godziny jednocześnie TGRL (10 mg / dl ApoB) wyizolowanym od ludzi po posiłku o wysokiej zawartości tłuszczu w hodowli statycznej. A) Ekspresję VCAM-1 mierzono oddzielnie w zawieszonym EC za pomocą cytometrii przepływowej i adhezji monocytów oznaczonej ilościowo za pomocą VMMC, jak opisano w szczegółowym protokole. Dane przedstawiono jako procentową zmianę w stosunku do TNF-α. Zatrzymanie monocytów różniło się wprost proporcjonalnie do śródbłonkowej ekspresji VCAM-1, która zwiększała się bezpośrednio wraz z poziomem trójglicerydów w surowicy dawcy. B) Zatrzymanie monocytów u podgrupy dawców prozapalnych zostało uchylone w obecności przeciwciała blokującego VCAM-1. Istotność określono za pomocą sparowanego testu t Studenta, czyli ± SEM z 3-5 niezależnych eksperymentów. Zaadaptowane za zgodą Wang et al.⁴

Dyskusja

Opisujemy zastosowanie mikroprzepływowych urządzeń PDMS do wbudowanej w chip oceny fenotypu zapalnego śródbłonka poprzez obrazowanie w czasie rzeczywistym ekspresji CAM i adhezji monocytów. Główną zaletą naszego podejścia jest możliwość ilościowego określenia wyników związanych z dysfunkcją śródbłonka w komórkach narażonych na mediatory stanu zapalnego, takie jak lipidy i cytokiny w diecie, w określonych warunkach hydrodynamicznych, które odzwierciedlają naprężenia ścinające w naczyniach miażdżycowych. VMMC ułatwiają kor...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
100 x 20 mm szalki Petriego	BD Falcon	353003
Etanol 95%	EMD Chemikalia	EX0290-1
DPBS	Cellgro	21-031-CV
Kolagen pochodzący z ogona szczura typu I	Gibco	A10483-01
Ludzkie komórki śródbłonka aorty	Genlantis	PH30405A
Roztwór antybiotykowo-przeciwgrzybiczy	Invitrogen	15240-062
Endothelial BulletKit	Lonza	CC-4176
Endothelial Basal Media-2	Lonza	CC-3156
10 ml Strzykawki	BD Falcon	309604
Rurka poliuretanowa	Tygon	ABW0001
Leibovitz-15 Media	Gibco	11415-069
Sylgard 184 Baza z elastomeru silikonowego	Dow Corning	184
Sylgard 184 Utwardzacz z elastomeru silikonowego	Dow Corning	184
SU8 Photoresist Master Wafel	UC Davis Pan Lab	N/A
Mikroskop odwrócony Eclipse TE200	Nikon	Eclipse TE200
Pompa strzykawkowa	Aparat Harvard	PHD2000
19 gauge podskórny igła	Kendall	8881
THP-1 Monocytarna linia komórkowa	ATCC	TIB-202
HBSS (buforowany roztwór soli fizjologicznej Hanksa) z Ca2+/Mg2+	Gibco	14025-092
Czynnik martwicy nowotworu alfa (TNF-α)	R& D Systems	210-TA-010
Współczynnik zrębowy - 1 (SDF-1)	R& D Systems	350-NS-010
RPMI 1640	Cellgro	10-040-CV
Albumina surowicy ludzkiej (HSA)	ZLB Behring	NDC 0053-7680-32
Tabela 2. Specyficzne odczynniki i sprzęt.