Artykuł metodologiczny

Zmodyfikowana metoda EPA 1623 wykorzystująca ultrafiltrację przezroświećną z przepływem stycznym oraz etapy dysocjacji termicznej do wykrywania wodnych Cryptosporidium i Giardia spp.

22.6K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/4177

⸱

9 lipca 2012

 ,  ,  ,  , 
1National Exposure Research Laboratory, Office of Research and Development, US Environmental Protection Agency, 2Shaw Environmental & Infrastructure, 3Office of Ground Water and Drinking Water, US Environmental Protection Agency

W tym artykule

Podsumowanie

Niniejszy protokół opisuje zastosowanie systemu zagęszczania próbek z wykorzystaniem ultrafiltracji stycznoprzepływowej z pustymi włóknami oraz dysocjacji termicznej jako alternatywnych kroków w wykrywaniu gatunków Cryptosporidium i Giardia przenoszonych przez wodę zgodnie z metodą EPA 1623.

Streszczenie

Cryptosporidium oraz gatunki Giardia to dwa z najpowszechniejszych pierwotniaków powodujących ogniska chorób biegunkowych przenoszonych przez wodę na całym świecie. Aby lepiej scharakteryzować rozpowszechnienie tych patogenów, opracowano metodę EPA 1623, która jest wykorzystywana do monitorowania poziomu tych organizmów w amerykańskich zasobach wody pitnej 12. Metoda ta składa się z trzech głównych etapów; pierwszym jest zagęszczanie próbki, podczas którego filtruje się co najmniej 10 L surowej wody powierzchniowej. Następnie organizmy oraz uwięzione zanieczyszczenia są eluowane z filtra i poddawane wirowaniu w celu dalszego zagęszczenia próbki. Druga część metody obejmuje procedurę immunomagnetycznej separacji, w której zagęszczona próbka wody jest nanoszona na koraliki immunomagnetyczne specyficznie wiążące oocysty Cryptosporidium i cysty Giardia, co pozwala na selektywne oddzielenie pasożytów od zagęszczonych zanieczyszczeń. Następnie (oo)cysty są oddzielane od koralików magnetycznych za pomocą procedury dysocjacji kwasowej. Ostatnią częścią metody jest barwienie immunofluorescencyjne i enumeracja, podczas której (oo)cysty nanosi się na szkiełko, barwi i zlicza pod mikroskopem.

Metoda 1623 wymienia cztery systemy zagęszczania próbek służące do wychwytywania Cryptosporidium oocysty i Giardia cysty w wodzie: filtry Envirochek (Pall Corporation, Ann Arbor, MI), filtry Envirochek HV (Pall Corporation), filtry Filta-Max (IDEXX, Westbrook, MA) lub ciągłe wirowanie w przepływie (Haemonetics, Braintree, MA). Jednakże, Cryptosporidium i Giardia Odzyskiwanie (oo)cyst wykazuje dużą zmienność w zależności od matrycy wody źródłowej oraz zastosowanych filtrów1,14Niedawno wykazano, że nowy system ultrafiltracji w układzie przepływu stycznego z wykorzystaniem włókien kapilarnych (HFUF) jest bardziej wydajny i stabilny w odzyskiwaniu Cryptosporidium oocysty i Giardia cysty z różnych matryc wodnych; ponadto jest ona tańsza niż inne opcje filtrów kapsułkowych i pozwala na jednoczesną koncentrację wielu patogenów1-3,5-8,10,11Dodatkowo wcześniejsze badania przeprowadzone przez Hilla i współpracowników wykazały, że HFUF znacząco poprawił Cryptosporidium odzyskiwanie oocyst w bezpośrednim porównaniu z filtrami Envirochek HV4. W literaturze zgłoszono również dodatkowe modyfikacje obecnych metod w celu poprawy ich wydajności. Wykazano, że zastąpienie procedury dysocjacji kwasowej dysocjacją termiczną jest skuteczniejsze w oddzielaniu Cryptosporidium z kulek magnetycznych w niektórych matrycach9,13 .

Niniejszy protokół opisuje zmodyfikowaną Metodę 1623, w której wykorzystano nowy system filtracji HFUF z etapem dysocjacji termicznej. Zastosowanie HFUF w ramach tej zmodyfikowanej metody stanowi tańszą alternatywę dla obecnych opcji filtracji przewidzianych w Metodzie 1623 EPA i zapewnia większą elastyczność, umożliwiając zagęszczanie wielu organizmów.

Protokół

1. Procedura ultrafiltracji przepływem stycznym w kapilarach pustych

  1. Przygotowanie buforów i roztworów:
    Roztwór do elucji (1 L):
    Do 1 L wody czystości odczynnikowej dodać 0,1 g polifosforanu sodu, 0,1 ml Tween-80 oraz 0,01 ml odpieniacza Y-30.
  2. Przygotowanie zestawu filtracyjnego (Rysunek 1) w komorze bezpieczeństwa biologicznego:
    1. Przeciągnąć wężyk laboratoryjny Masterflex I/P 73 przez głowicę pompy Masterflex I/P Easy-Load podłączoną do precyzyjnego bezszczotkowego napędu Masterflex I/P.
    2. Zamocować wężyk za pomocą obejmy śrubowej do manometru wypełnionego gliceryną o zakresie 0-60 psi, wyposażonego w trójnik NPT, przed głowicą pompy, oraz do trójnika z HDPE za głowicą pompy.
    3. Złożyć butelkę na retentat, montując nasadkę do napełniania/odpowietrzania Nalgene 53-B z wężykiem laboratoryjnym Masterflex L/S 15 i trójnikiem, a następnie mocując ją do wytrzymałej polipropylenowej butelki Nalgene o pojemności 1 L.
    4. Wyposażyć wężyk Masterflex L/S 24 w zacisk zaciskowy (zacisk 2) i połączyć go od butelki na retentat do trójnika z HDPE.
    5. Połączyć wężyk laboratoryjny Masterflex L/S 24 od manometru do dializatora o wysokim strumieniu Asahi Kasei Rexeed 25S za pomocą obejmy śrubowej oraz od dializatora do butelki na retentat. Aby połączyć wężyk z ultrafiltrem włóknistym, należy użyć specjalnie wykonanych adapterów DIN przystosowanych do wężyków o średnicy wewnętrznej ¼".
    6. Wyposażyć wężyk laboratoryjny Masterflex L/S 24 w zacisk zaciskowy (zacisk 1) i połączyć go z plastikową pipetą o pojemności 10 ml (po usunięciu końcówki i bawełnianego czopa), aby służyła jako linia poboru próbki, a następnie przymocować wężyk do trójnika z HDPE.
    7. Wyposażyć jeden koniec wężyka laboratoryjnego Masterflex L/S-36 w zacisk rampowy i połączyć wężyk z portem odpływowym znajdującym się w pobliżu końca wyjściowego filtra. Drugi koniec umieścić w pojemniku na odpady.
  3. Do 10 L próbki wody dodać 0,01 % (w/v) polifosforanu sodu i mieszać przez 3 min.
  4. Zamknąć zacisk zaciskowy 2 i zdjąć nasadkę odpowietrzającą z butelki na retentat. Wszystkie pozostałe zaciski powinny być otwarte.
  5. Ustawić kierunek pompowania tak, aby ciecz płynęła z trójnika do manometru (z prawej strony na lewą, zgodnie z Rysunkiem 1). Ustawić prędkość pompy na 25% prędkości maksymalnej i włączyć pompę.
  6. Gdy butelka na retentat będzie wypełniona w 2/3, otworzyć zacisk zaciskowy 2 i szybko ponownie założyć nasadkę odpowietrzającą na butelkę na retentat. Sprawdzić wszystkie linie i połączenia, aby upewnić się, że nie ma wycieków.
  7. Powoli zwiększać prędkość pompy do pożądanej szybkości filtracji (około 1,5 L/min), sprawdzając szczelność. Za pomocą cylindra miarowego i stopera lub przepływomierza sprawdzić szybkość filtracji wody wypływającej z linii odpływowej (niebieski wężyk L/S 36 na Rysunku 1). Na końcu wyjściowym filtra mogą zazwyczaj tworzyć się pęcherzyki powietrza, co utrudnia uzyskanie stabilnego ciśnienia i szybkości filtracji. Można to skorygować, ściskając ręką linię odpływową na chwilę. Działanie to zazwyczaj wypchnie pęcherzyk powietrza do portu filtratu i spowoduje jego usunięcie przez linię odpływową. Powtarzać w razie potrzeby, pamiętając, że pęcherzyki powietrza wielkości ziarnka grochu są często nieuniknione.
  8. Monitorować proces filtracji. W razie potrzeby mierzyć i zapisywać ciśnienie oraz szybkość filtracji. Ciśnienie nigdy nie powinno przekroczyć 20 psi. Zaleca się, aby szybkość filtracji nie przekraczała 2,0 L/min. Ważne jest monitorowanie objętości wody w butelce na retentat, aby upewnić się, że nigdy nie zostanie ona opróżniona. Niewielkie wahania objętości są normalne. Jeśli objętość wody w butelce na retentat spadnie poniżej 1/3, zdjąć nasadkę odpowietrzającą i zamknąć zacisk zaciskowy 2 na linii butelki na retentat. Przywrócić objętość do około 2/3, otworzyć zacisk i szybko ponownie założyć nasadkę odpowietrzającą, zapewniając szczelne zamknięcie. Jeśli objętość w butelce na retentat spada szybko i stale, należy upewnić się, że pokrywa butelki jest szczelna, nasadkę odpowietrzającą zamontowano prawidłowo, a wężyk nadal ma kontakt z próbką wody. Jeśli te problemy nie występują, prawdopodobnie uszczelka w pokrywie butelki na retentat jest wadliwa i powinna zostać wymieniona.
  9. Po opróżnieniu pojemnika z próbką natychmiast zamknąć zacisk zaciskowy 1, zmniejszyć prędkość pompy do 20% wartości maksymalnej, zdjąć nasadkę odpowietrzającą z butelki na retentat i zamknąć zacisk rampowy.
  10. Dostosować objętość próbki w butelce na retentat do około 200 ml, zacieśniając lub luzując zacisk rampowy. Po uzyskaniu objętości około 200 ml zacieśnić zacisk rampowy na potrzeby etapów elucji (1.11-1.12).
  11. Dodać 500 ml roztworu do elucji do pojemnika z próbką i wypłukać wnętrze pojemnika. Umieścić pipetę 10 ml połączoną z linią poboru próbki w pojemniku zawierającym roztwór do elucji. Upewnić się, że zacisk rampowy jest zamknięty. Otworzyć zacisk zaciskowy 1 i na chwilę zamknąć zacisk zaciskowy 2, aby zassać roztwór do elucji.
  12. Po zassaniu 500 ml roztworu do elucji zamknąć zacisk zaciskowy 1 i otworzyć zacisk zaciskowy 2. Pozostawić roztwór do elucji w obiegu przez 5 minut przy prędkości pompy wynoszącej 20% prędkości maksymalnej.
  13. Dostosować objętość próbki w butelce na retentat do około 100 ml, zacieśniając lub luzując zacisk rampowy na linii odpływowej. Zacieśnić zacisk rampowy i pozwolić próbce krążyć przez 1 minutę. Aby uniknąć zassania powietrza do wężyka, należy upewnić się, że objętość próbki w butelce na retentat jest wystarczająco wysoka, aby zakryć wężyk L/S 15 wchodzący do butelki.
  14. Zmienić kierunek pracy pompy, co wymusi przepływ próbki do butelki na retentat. Pozostawić pompę pracującą w odwrocie przez 20 sekund, co pozwoli uzyskać łącznie ~225 ml w butelce na retentat. Wyłączyć pompę.
  15. Zdjąć wężyk Masterflex I/P 73 z głowicy pompy i odłączyć manometr. Odłączyć wężyk Masterflex L/S 24 wychodzący z ultrafiltra włóknistego. Trzymać wężyk nad butelką na retentat, aby wymusić spływ pozostałej próbki do butelki.
  16. Odłączyć wszystkie wężyki od butelki i zastąpić nasadkę odpowietrzającą nasadką nieodpowietrzającą.
  17. Kontynuować procedurę IMS/IFA z uzyskanym retentatem o objętości ~225 ml.

2. Procedura separacji immunomagnetycznej

  1. Przygotowanie buforów i roztworów:
    1. Dopuścić bufory dołączone do zestawu Dynabeads: Cryptosporidium/Giardia combo do osiągnięcia temperatury pokojowej.
    2. 1X SL-buffer A: Dodać 1 ml 10X SL-buffer A do 9 ml wody czystości reagentowej.
  2. Przenieść ok. 225 ml cieczy z butelki z retentatem do opisanej stożkowej probówki wiriówkowej o pojemności 250 ml. Przepłukać butelkę z retentatem dwukrotnie 10 ml wody reagentowej i dodać płukanki do stożkowej probówki wiriówkowej. Centryfugować zawiesinę przy 1500 x g przez 15 min w temperaturze 4 °C bez hamowania.
  3. Ostrożnie odessać nadosad z poziomu granicy faz powietrze-woda do poziomu 5 ml powyżej zbitego osadu na każde 0,5 ml objętości osadu (np. odessać do 15 ml powyżej osadu o objętości 1,3 ml lub do 5 ml w przypadku osadu o objętości 0,5 ml lub mniejszej).
  4. Dokładnie resuspendować osad w nadosadzie poprzez mieszanie na wortexie i/lub pipetowanie. Przenieść każdą 5 ml objętość cieczy do płaskiej probówki Dynal L10 zawierającej po 1 ml 10X SL-buffer A oraz 10X SL-buffer B. Przepłukać stożkową probówkę wiriówkową dwukrotnie 2,5 ml wody reagentowej i dodać płukankę do probówki L10, tak aby całkowita objętość w probówce L10 wynosiła 12 ml, wliczając w to bufory.
  5. Do probówki L10 dodać po 100 μl dobrze wymieszanych resuspendowanych kulek Dynabeads anty-Cryptosporidium oraz anty-Giardia. Rotować probówkę L10 z prędkością 18 rpm przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej na mieszalniku rotacyjnym.
  6. Przystawić płaską stronę probówki L10 do magnesu MPC-6 i delikatnie kołysać probówką wzdłuż jej osi o 180° przez 2 minuty.
  7. Trzymając probówkę L10 w magnesie MPC-6 stroną z magnesem do góry, odlać nadosad, unikając zassania kompleksów kulek/(oo)cyst związanych z magnesem. Wyjąć probówkę L10 z magnesu i dodać do niej 0,5 ml 1X SL-buffer A. Przenieść zawiesinę, wykonując dwa dodatkowe płukania 0,5 ml 1X SL-buffer A, do probówki do mikrocentryfugi o pojemności 1,5 ml umieszczonej w MPC-S z magnesem w pozycji pionowej.
  8. Delikatnie kołysać probówką w magnesie MPC-S o 180° przez 1 minutę. Przy zamocowanym magnesie odessać nadosad za pomocą pipety Pasteura skierowanej do dna probówki do mikrocentryfugi.
  9. Dodać 1 ml 1X PBS do przedniej strony probówki do mikrocentryfugi, wyjąć magnes i delikatnie kołysać probówką tylko do momentu resuspensji kulek. Ponownie umieścić magnes w pozycji pionowej i delikatnie kołysać probówką o 180° przez 1 minutę. Odessać płukankę PBS za pomocą pipety Pasteura, nie naruszając osadu kulek, aby usunąć jak najwięcej zanieczyszczeń.
  10. Wyjąć magnes i dodać 50 μl wody reagentowej do tylnej strony probówki do mikrocentryfugi. Mieszać na wortexie z pełną prędkością przez 50 sekund, następnie inkubować probówkę w temperaturze 80 °C przez 10 minut, po czym ponownie mieszać na wortexie przez 30 sekund. Umieścić magnes w MPC-S w pozycji skośnej, aby związać kulki z magnesem, pozostawiając (oo)cysty w cieczy. Nanieść zawiesinę (oo)cyst na szkiełko z dołkami SingleSpot.
  11. Powtórzyć krok 2.10, nakładając ciecz do tego samego dołka, w którym znajduje się pierwsza dysocjacja. Umieścić szkiełko na podgrzewaczu do szkiełek w temperaturze 37 °C na 1 godzinę, aby zawiesina wyschła w dołku szkiełka.

3. Barwienie i badanie

  1. Przygotowanie buforów i roztworów:
    Roztwór roboczy DAPI: do 25 ml 1X PBS dodać 25 μl roztworu zapasowego DAPI (2 mg/ml w metanolu). Roztwory zapasowe i robocze przechowywać w ciemności w temperaturze od 1 °C do 10 °C.
  2. Nanieść 50 μl metanolu do dołka na preparacie i pozostawić do wyschnięcia w temperaturze pokojowej.
  3. Dodać 50 μl roztworu roboczego DAPI do dołka na preparacie i inkubować przez 2 minuty w temperaturze pokojowej.
  4. Za pomocą chusteczki Kimwipe odsączyć DAPI z dołka. Nanieść 50 μl EasyStain. Inkubować w temperaturze 35 °C przez 30 minut.
  5. Odsączyć barwnik z dołka chusteczką Kimwipe, a następnie powoli dodać 300 μl zimnego buforu utrwalającego EasyStain, pozwalając mu przepłynąć przez krawędź dołka. Inkubować przez 2 minuty w temperaturze pokojowej.
  6. Za pomocą chusteczki Kimwipe odsączyć bufor z dołka i nanieść 10 μl medium montażowego EasyStain Mounting Medium.
  7. Ostrożnie nałożyć szkiełko nakrywkę, usuwając powstałe pęcherzyki powietrza. Uszczelnić szkiełko bezbarwnym lakierem do paznokci.
  8. Przeskanować cały preparat przy użyciu filtru FITC, przy całkowitym powiększeniu 200X, w poszukiwaniu jajowatych lub sferycznych, jabłkowo-zielonych fluorescencyjnych obiektów przypominających oocystę lub cystę. Wszystkie takie obiekty zbadać przy użyciu filtru DAPI przy całkowitym powiększeniu 1000X, a następnie za pomocą DIC, również przy całkowitym powiększeniu 1000X. Zarejestrować rozmiar za pomocą skalibrowanego mikrometru okularowego oraz cechy morfologiczne.
  9. Udokumentować wyniki.

Uwaga: Dodatkowe informacje na temat oryginalnej procedury znajdują się w wersji z grudnia 2005 r. metody EPA Method 162312. Opisana procedura ultrafiltracji przez błony kapilarne z przepływem stycznym jest stosowana zamiast Sekcji 12.0 metody EPA Method 1623. Dysocjacja termiczna modyfikuje Sekcję 13.3.3 metody EPA Method 1623. Procedura opisuje również dodatkowe płukanie PBS podczas procesu IMS, które można wstawić do wersji z grudnia 2005 r. metody 1623 po sekcji 13.3.2.16. Pełna lista materiałów eksploatacyjnych, odczynników i sprzętu wykorzystanego w metodzie EPA Method 1623, wliczając powyższe modyfikacje, znajduje się w liście sprzętu.

4. Reprezentatywne wyniki

Cryptosporidium oocysty oraz cysty Giardia odzyskane w procesach filtracji i immunomagnetycznej separacji są wykrywane za pomocą analizy mikroskopowej. Przy całkowitym powiększeniu 200X każdy organizm wykazujący typowy wzór barwienia, rozmiar i kształt, jak pokazano na Rysunku 2, powinien zostać poddany dalszej obserwacji z użyciem imersji olejowej przy całkowitym powiększeniu 1000X. Pozwoli to na pomiar i identyfikację typowych cech charakterystycznych lub cech atypowych, które wykluczyłyby pozytywną identyfikację. Cryptosporidium to obiekt od owalnego do sferycznego o średnicy od 4 do 6 μm, który wykazuje intensywną, jabłkowo-zieloną fluorescencję FITC z wyraźnie zaznaczonymi krawędziami (Rysunek 3A). Przy użyciu DAPI UV oocysta będzie wykazywać jedną z następujących typowych kategorii cech: jasnoniebieskie barwienie wewnętrzne z zieloną obręczą i brakiem wyraźnych jąder (DAPI negatywne), intensywnie niebieskie barwienie wewnętrzne lub do czterech wyraźnych, błękitnych jąder (DAPI pozytywne - Rysunek 3B). Cechy atypowe obejmują odchylenia w kolorze, strukturze lub fluorescencji DAPI (np. zbyt wiele zabarwionych jąder, czerwone fluorescencyjne struktury wewnętrzne). Jeśli obiekt fluorescencyjny spełnił kryteria typowego barwienia FITC i DAPI, jest on badany przy użyciu kontrastowego mikroskopu różnicowego (DIC). Obiekt jest analizowany pod kątem atypowych zewnętrznych lub wewnętrznych cech morfologicznych, takich jak ornamentacja ściany komórkowej lub jedno lub dwa duże jądra wypełniające komórkę. Jeśli nie zaobserwowano struktur atypowych, obiekt zostaje ujęty w całkowitej liczbie IFA i sklasyfikowany jako pusta struktura amorficzna lub zawierająca od jednego do czterech sporozoitów (Rysunek 3C). Podobnie obiekty przypominające Giardia są badane pod kątem barwienia FITC i DAPI, a także cech DIC, takich jak aksonemy, ciała pośrednie i jądra. Cysty Giardia to okrągłe lub owalne, intensywnie jabłkowo-zielone obiekty o długości 8 - 18 μm i szerokości 5 - 15 μm z wyraźnie zaznaczonymi krawędziami (Rysunek 3D). Przy użyciu DAPI UV cysta Giardia będzie wykazywać barwienie DAPI-negatywne lub cechy DAPI-pozytywne (Rysunek 3E). Obiekt fluorescencyjny jest badany za pomocą DIC pod kątem cech typowych i atypowych w ten sam sposób, jak opisano dla Cryptosporidium. Jeśli nie zaobserwowano cech atypowych, obiekt zostaje ujęty w całkowitej liczbie IFA i sklasyfikowany jako pusty, zawierający strukturę amorficzną lub jeden lub więcej typów struktur wewnętrznych (Rysunek 3F).

Każdy organizm wykazujący nietypowe cechy nie powinien być liczony jako (oo)cysta. Analiza mikroskopowa próbek środowiskowych może być trudna, ponieważ istnieją organizmy, które mogą wykazywać autofluorescencję lub reagować krzyżowo z przeciwciałami anty-Cryptosporidium i/lub anty-Giardia sprzężonymi z FITC 1. Zaleca się, aby analityk był zaznajomiony z mikroorganizmami wodnymi i przeanalizował kilkadziesiąt preparatów w celu zdobycia doświadczenia w identyfikacji Cryptosporidium i Giardia. Przed każdą sesją przy mikroskopie należy zidentyfikować co najmniej trzy (oo)cysty na preparacie kontrolnym z barwieniem pozytywnym.

Próbki kontroli jakości można wzbogacić o oocysty, aby określić procent odzysku dla każdego pierwotniaka, korzystając z obliczenia:
Procent odzysku oocyst = ((Liczba w próbce QC - Liczba w próbce niewzbogaconej) / Ilość dodana) x 100.

Schemat filtracji włóknistej; konfiguracja systemu ultrafiltracji; proces oddzielania odpadów i retentatu.
Rysunek 1. Graficzna reprezentacja systemu ultrafiltracji włóknistej z przepływem stycznym. Przewody są oznaczone kolorami, aby ułatwić montaż systemu.

Obraz z mikroskopii fluorescencyjnej; komórki z barwionymi jądrami, pasek skali 50μm do analizy komórkowej.
Rysunek 2. Reprezentatywny obraz fluorescencyjny oocyst Cryptosporidium i cyst Giardia. Oocysty Cryptosporidium oraz cysty Giardia zabarwiono przeciwciałami anty-Cryptosporidium/Giardia znakowanymi FITC. Strzałki: cysty Giardia; groty strzałek: oocysty Cryptosporidium. W płaszczyźnie ostrości znaleziono łącznie cztery oocysty Cryptosporidium i sześć cyst Giardia. Próbki obserwowane przy powiększeniu 200X.

Mikroskopia fluorescencyjna struktur komórkowych; strzałki wskazują obszary barwione; paski skali 5 µM, 10 µM.
Rycina 3. Reprezentatywne obrazy mikroskopowe oocyst Cryptosporidium oraz cyst Giardia wykorzystanych do charakterystyki. Oocysty Cryptosporidium (A - C). Intensywna, jabłkowo-zielona fluorescencja FITC obiektów sferycznych o średnicy od 4 do 6 μm z wyraźnie zaznaczonymi krawędziami (A), zawierających do czterech wyraźnych, błękitnych jąder barwionych DAPI (B) oraz od jednego do czterech sporozoitów (S) na oocystę (C). Cysty Giardia (D - F). Intensywna, jabłkowo-zielona fluorescencja FITC obiektów od okrągłych do jajowatych o długości 8 - 18 μm i szerokości 5 - 15 μm z wyraźnie zaznaczonymi krawędziami (D), zawierających do czterech błękitnych jąder barwionych DAPI (E) oraz jedną lub więcej rozpoznawalnych struktur wewnętrznych, takich jak jądra (N), ciało pośrodkowe (M) i/lub aksonemy (A) (F). Białe strzałki: intensywna jabłkowo-zielona fluorescencja barwiąca ściany oocyst Cryptosporidium i cyst Giardia; białe groty strzałek: jądra dodatnie dla DAPI. Próbki obserwowane przy powiększeniu 1000X.

Dyskusja

Ultrafiltracja tangentialna z zastosowaniem włókien kapilarnych jest alternatywną i skuteczną techniką wstępnego zagęszczania oocyst Cryptosporidium i cyst Giardia z wody. Ultrafiltracja kapilarna jest tańsza niż tradycyjne filtry. Ponieważ pozwala ona na zagęszczanie oocyst Cryptosporidium i cyst Giardia z różnych matryc wodnych, stanowi użyteczną alternatywę dla obecnych technik filtracji stosowanych w metodzie EPA 1623. Podobnie jak w przypadku większości innych metod filtracji, ultrafiltracja kapilarna jest podatna na zapychanie przy próbkach o bardzo wysokiej mętności. Zapychanie filtra prowadziłoby do wzrostu ciśnienia wody, dlatego zaleca się monitorowanie ciśnienia podczas procesu filtracji. Wykazano, że oprócz oocyst Cryptosporidium i cyst Giardia, ultrafiltracja kapilarna jest zdolna do zagęszczania bakterii i wirusów1-3,5,8. Ultrafiltracja kapilarna opisana w niniejszej metodzie może być wykorzystana do zagęszczania wielu organizmów w jednej próbce. Warto zaznaczyć, że uzyskanie objętości końcowej od 200 do 250 ml jest krytycznym końcowym etapem procedury zagęszczania, co pozwala uniknąć dodatkowych etapów wirowania, które mogłyby doprowadzić do utraty (oo)cyst (krok 2.2). Jednak dopuszczenie do zbyt dużego spadku objętości w butelce może niekorzystnie wpłynąć na odzysk, ponieważ objętość cieczy będzie niewystarczająca, aby przetłoczyć wszystkie oocysty lub cysty do butelki z retentatem. Dlatego zaleca się utrzymanie objętości końcowej w zakresie od 200 do 250 ml.

Dysocjacja termiczna stanowi alternatywę dla etapu dysocjacji kwasowej w Metodzie 1623. Wykazano, że ten alternatywny krok poprawia odzysk oocyst Cryptosporidium i zmniejsza zmienność metody podczas izolacji zarówno z wody rzecznej, jak i wody z odczynników9. Porównanie metod dysocjacji kwasowej i termicznej wykazało, że zastosowanie ciepła do oddzielenia organizmów od kulek immunomagnetycznych pozwoliło uzyskać wyższe średnie wartości odzysku zarówno dla Cryptosporidium, jak i Giardia. Ponadto precyzja odzysku Cryptosporidium i Giardia była wyższa w próbkach poddanych dysocjacji termicznej w porównaniu z dysocjacją kwasową9.

Zastosowanie HFUF jako etapu zagęszczania zapewnia większą elastyczność, umożliwiając zagęszczanie wielu organizmów. Ponadto stanowi ono tańszą alternatywę dla obecnych opcji filtracji przewidzianych w Metodzie 1623.

Oświadczenia

Badania opisane w niniejszym opracowaniu zostały sfinansowane przez Agencję Ochrony Środowiska Stanów Zjednoczonych (US EPA) za pośrednictwem Biura Badań i Rozwoju we współpracy z Centrum Wsparcia Technicznego Biura Wód Gruntowych i Wody Pitnej. Wszystkie prace były wspierane na miejscu w siedzibie US EPA w Cincinnati w stanie Ohio. Choć informacje opisane w tym artykule zostały sfinansowane w całości lub w części przez Agencję Ochrony Środowiska Stanów Zjednoczonych na podstawie umowy (Umowa EP-C-06-031) z firmą Shaw Environmental and Infrastructure, Inc, nie odzwierciedlają onekoniecznie poglądów Agencji i nie należy z nich wywnioskować oficjalnego poparcia. Treść została poddana recenzji Agencji i zatwierdzona do publikacji.

Podziękowania

Chcielibyśmy podziękować Ann Grimm i Michaelowi Zimmermanowi za krytyczną recenzję niniejszego manuskryptu oraz Dougowi Hamiltonowi za wsparcie techniczne.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
mokre ultrafiltry włókienstowe Asahi Kasei Rexeed 25 S/RDial MedicalREXEED25S/R
pompa perystaltyczna 73 (Masterflex R-3603) lub równoważnaCole-ParmerEW-06408-73
L/S 24 (Masterflex Platinum-Cured) lub odpowiednikCole-ParmerEW-96410-24
L/S 15 (Masterflex Platinum-Cured) lub odpowiednikCole-ParmerEW-96410-15
L/S 36 (Masterflex Platinum-Cured) lub odpowiednikCole-ParmerEW-96410-36
Precyzyjny bezszczotkowy napęd I/PCole-ParmerEW-77410-10
Głowica pompy I/P Easy LoadCole-ParmerEW-77601-10
Trójnik z czarnego HDPE, 1/4"x 3/8" x 3/8"Tworzywa sztuczne w USA62064
Konektor T-kształtny Masterflex L/S 15-25Cole-ParmerEG-30613-12
butelka Nalgene heavy-duty pp 1 LCole-ParmerEW-06257-10
pipety 10 mlFisher Scientific13-678-11C
nakrętka Nalgene do napełniania/odpowietrzania dla 1/4" przewód, 53BCole-ParmerEW-06258-10
ManometrCole-ParmerA-680-46-10
Złączka prosta, NPT(F), 1/4" Cole-ParmerEW-06469-18
trójnik NPT, naturalny ppCole-ParmerA-30610-75
Zaciski zaciskowe, 1/2"Cole-ParmerEW-06833-00
Adaptery DIN o niestandardowym dopasowaniuMolded Products CorpMPC-855NS.250
Statyw laboratoryjnyFisher Scientific14-670B
Zaciski do statywów laboratoryjnychFisher Scientific05-769-6Q
zacisk do rampy Keck, 14 mmCole-ParmerEW-06835-10
Polifosforan soduSigma-Aldrich305553
Pentahydrat tiosiarczanu soduSigma-Aldrich72050
emulsja odpieniacza Y-30Sigma-AldrichA5758
Tween-80Sigma-AldrichP1754
10 L składany pojemnik cubitainer z polietylenu o wysokiej gęstościVWR internationalIR314-0025
Statyw na butelki do wirówkiFisher Scientific05-663-103
stożkowate probówki wirówkowe 250 mlCorning430776
Lejek jednorazowyCole-ParmerU-6122-10
Butelka do płukaniaCole-ParmerU-06252-40
WirówkaBeckman Coulter Inc.Allegra X-15R
Rotor z koszyczkami odchylanymiBeckman Coulter Inc.ARIES SX4750
Adaptery do koszyków wirówki dla probówek stożkowych o pojemności 250 mlBeckman Coulter Inc.349849
200 μkońcówki do pipet o szerokim wylocieFisher Scientific02-707-134
Filtr VacuShieldGelman629-4402
pipety 5 mlFisher Scientific13-678-11D
Dynabeads: Cryptosporidium/Giardia zestaw kombinowany IDEXX73002
probówki wirówkowe stożkowe 50 mlFalcon BD352098
probówki z płaskim dnem Dynal L10IDEXX74003
Licznik czasuVWR international23609-202
magnes Dynal MPC-6IDEXX12002D
pipety 1 mlVWR international53283-700
probówki do mikrowirówki o niskiej adhezji o pojemności 1,5 mlFisher Scientific02-681-320
1000 μpipeta 1 ml &or odpowiednie końcówki z filtremGilson, Inc.P1000/DF1000ST
100 μpipeta 1 ml &or odpowiadające im końcówki z filtremGilson, Inc.P100/DF100ST
pipety Pasteura 9 caliVWR international14672-412
magnes Dynal MPC-SIDEXX12020D
Mieszanie w wirówce (Vortex)VWR international14216-188
Mieszalnik rotacyjny DynabeadsIDEXX94701
Blok grzejnyFisher Scientific11-718-2
Kuleczki Lab ArmorLab Armor42370-750
Termometr cyfrowyFisher Scientific15-077-60
Bufor fosforanowo-solny 1X pH 7,4 (1X PBS)Sigma-AldrichP4417
Predki z pojedynczą plamkąIDEXX30201
Szkiełko nakrywkoweCorning287018
zestaw EasyStain directBTF-
10 μpipeta 1 μl &oraz odpowiednie końcówki z filtremGilson, Inc.P10 & DF10ST
4',6-diamidyno-2-fenyloindol dichlorowodorek (DAPI)Sigma-AldrichD9542
Przezroczysty lakier do paznokciFisher ScientificS30697
MetanolFisher ScientificL6815
KimwipesKimberly Clark34155
InkubatorBoekel Scientific133000
podgrzewacz do szkiełek przedmiotowychFisher Scientific11-474-521
Olejek imersyjny, typ A ND= 1,515 Nikon InstrumentsMXA20234
mikroskop Nikon 90i z możliwością kontrastu DICNikon InstrumentsMBA 77000
Obiektyw Plan APO 100X z imersją olejowąNikon InstrumentsMRD01901
Obiektyw Plan Achromat 20X Nikon InstrumentsMRL00202
filtr FITCNikon Instruments96302
filtr DAPINikon Instruments96301
Iluminator fluorescencyjny X-citeNikon Instruments87540
Papier do soczewekNikon Instruments76997
Jednorazowy worek na odpady biologiczneFisher Scientific01-829D
Pojemnik na odpady ostre z zagrożeniem biologicznymFisher Scientific14-827-117
3% nadtlenek wodoruVWR internationalBDH3540-2
WybielaczFisher Scientific1952030
WypadnięcieKimberly Clark34790

Bibliografia

  1. DiGiorgio, C. L., Gonzalez, D. A., Huitt, C. C. Cryptosporidium and Giardia recoveries in natural waters by using Environmental Protection Agency Method 1623. Appl. Environ. Microbiol. 68, 5952(2002).
  2. Hill, V. R., Kahler, A. M., Jothikumar, N., Johnson, T. B., Hahn, D., Cromeans, T. L. Multistate evaluation of an ultrafiltration-based procedure for simultaneous recovery of enteric microbes in 100-liter tap water samples. Appl. Environ. Microbiol. 73, 4218-4225 (2007).
  3. Hill, V. R., Polaczyk, A. L., Hahn, D., Narayanan, J., Cromeans, T. L., Roberts, J. M., Amburgey, J. E. Development of a rapid method for simultaneous recovery of diverse microbes in drinking water by ultrafiltration with sodium polyphosphate and surfactants. Appl. Environ. Microbiol. 71, 6878-6884 (2005).
  4. Hill, V. R., Polaczyk, A. L., Kahler, A. M., Cromeans, T. L., Hahn, D., Amburgey, J. E. Comparison of hollow-fiber ultrafiltration to the USEPA VIRADEL technique and USEPA method 1623. J. Environ. Qual. 38, 822-825 (2009).
  5. Holowecky, P. M., James, R. R., Lorch, D. P., Straka, S. E., Lindquist, H. D. Evaluation of ultrafiltration cartridges for a water sampling apparatus. J. Appl. Microbiol. 106, 738-7347 (2009).
  6. Lindquist, H. D., Harris, S., Lucas, S., Hartzel, M., Riner, D., Rochele, P., Deleon, R. Using ultrafiltration to concentrate and detect Bacillus anthracis, Bacillus atrophaeus subspecies globigii, and Cryptosporidium parvum in 100-liter water samples. J. Microbiol. Methods. 70, 484-492 (2007).
  7. Polaczyk, A. L., Roberts, J. M., Hill, V. R. Evaluation of 1MDS electropositive microfilters for simultaneous recovery of multiple microbe classes from tap water. J. Microbiol. Methods. 68, 260-266 (2007).
  8. Rhodes, E. R., Hamilton, D. W., See, M. J., Wymer, L. Evaluation of hollow-fiber ultrafiltration primary concentration of pathogens and secondary concentration of viruses from. 176, 38-45 (2011).
  9. Shaw, N. J., Villegas, L. F., Eldred, B. J., Gaynor, D. H., Warden, P. S., Pepich, B. V. Modification to EPA Method 1623 to address a unique seasonal matrix effect encountered in some U.S. source waters. J. Microbiol. Methods. 75, 445-448 (2008).
  10. Simmons, O. D. 3rd, Sobsey, M. D., Heaney, C. D., Schaefer, F. W. 3rd, Francy, D. S. Concentration and detection of Cryptosporidium oocysts in surface water samples by method 1622 using ultrafiltration and capsule filtration. Appl. Environ. Microbiol. 67, 1123-1127 (2001).
  11. Sobsey, M. D., Glass, J. S. Influence of water quality on enteric virus concentration by microporous filter methods. Appl. Environ. Microbiol. 47, 956-9560 (1984).
  12. USEPA. Method 1623: Cryptosporidium and Giardia in Water by Filtration/IMS/FA. Office of Water. 815-R-05-002, EPA. (2005).
  13. Ware, M. W., Wymer, L., Lindquist, H. D., Schaefer, F. W. 3rd Evaluation of an alternative IMS dissociation procedure for use with Method 1622: detection of Cryptosporidium in water. J. Microbiol. Methods. 55, 575-583 (2003).
  14. Zuckerman, U., Tzipori, S. Portable continuous flow centrifugation and method 1623 for monitoring of waterborne protozoa from large volumes of various water matrices. J. Appl. Microbiol. 100, 1220-1227 (2006).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Tangencyjna ultrafiltracja przep ywowafiltracja w knami kapilarnymiseparacja immunomagnetycznamikroskopia immunofluorescencyjnawykrywanie Cryptosporidiumwykrywanie Giardiapatogeny przenoszone przez wodzag szczanie pr bek

Powiązane artykuły