Artykuł metodologiczny

Zestaw narzędzi umożliwiających konwersję węglowodorów w środowisku wodnym

DOI:

10.3791/4182

⸱

2 października 2012

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Biotechnology, Delft University of Technology, 2Delft Center for Systems and Control, Delft University of Technology

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zrównoważony, automatycznie regulujący system bakteryjny do remediacji zanieczyszczeń ropą naftową został zaprojektowany przy użyciu standardowych wymiennych części DNA (BioBricks). Zmodyfikowany szczep E. coli został wykorzystany do degradacji alkanów poprzez β-utlenianie w toksycznym środowisku wodnym. Odpowiednie enzymy z różnych gatunków wykazały aktywność degradacji alkanów. Dodatkowo uzyskano zwiększoną tolerancję na n-heksan poprzez wprowadzenie genów bakterii tolerujących alkany.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca przedstawia zestaw narzędzi, który umożliwia konwersję alkanów przez Escherichia coli i przedstawia dowód na zasadę jego zastosowania. Zestaw narzędzi składa się z wielu standardowych wymiennych części (BioBricks)9 dotyczących konwersji alkanów, regulacji ekspresji genów i przetrwania w toksycznych środowiskach bogatych w węglowodory.

U E. coli zaimplementowano trzyetapową ścieżkę degradacji alkanów, aby umożliwić konwersję alkanów średnio- i długołańcuchowych do odpowiednich alkanoli, alkanów i ostatecznie kwasów alkanowych. Te ostatnie były metabolizowane przez natywny szlak β-oksydacyjny. Aby ułatwić utlenianie alkanów średniołańcuchowych (C5-C13) i cykloalkanów (C5-C8), cztery geny (alkB2, rubA3, rubA4i rubB) układu hydroksylazy alkanowej z Gordonia sp. TF68,21 zostały przekształcone w E. coli. Do konwersji długołańcuchowych alkanów (C15-C36) wdrożono genladA z Geobacillus thermodenitrificans. Do wymaganych dalszych etapów procesu degradacji wprowadzono ADH i ALDH (pochodzące z G. thermodenitrificans)10,11. Aktywność mierzono za pomocą testów na komórkach spoczynkowych. Dla każdego etapu utleniania obserwowano aktywność enzymatyczną.

Aby zoptymalizować wydajność procesu, ekspresja była indukowana tylko w warunkach niskiego poziomu glukozy: użyto promotora regulowanego substratem, pCaiF. pCaiF jest obecny w E. coli K12 i reguluje ekspresję genów zaangażowanych w degradację źródeł węgla niezawierających glukozy.

Ostatnia część zestawu narzędzi - ukierunkowana na przeżycie - została zaimplementowana przy użyciu genów tolerancji rozpuszczalników, PhPFDα i β, oba z Pyrococcus horikoshii OT3. Rozpuszczalniki organiczne mogą wywoływać stres komórkowy i zmniejszać przeżywalność poprzez negatywny wpływ na fałdowanie białek. Jako białka opiekuńcze, PhPFDα i β usprawniają proces fałdowania białek, np. w obecności alkanów. Ekspresja tych genów doprowadziła do poprawy tolerancji węglowodorów, o czym świadczy zwiększona szybkość wzrostu (do 50%) w obecności 10% n-heksanu w pożywce.

Podsumowując, wyniki wskazują, że zestaw narzędzi umożliwia E. coli przekształcanie i tolerowanie węglowodorów w środowisku wodnym. W związku z tym stanowi pierwszy krok w kierunku zrównoważonego rozwiązania w zakresie remediacji ropy naftowej przy użyciu podejścia opartego na biologii syntetycznej.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zanieczyszczenie ropą naftową jest jedną z najpoważniejszych przyczyn skażenia środowiska i ma ogromny wpływ na ekosystemy, przedsiębiorstwa i społeczności 3. Potrzebne są na przykład rozwiązania w celu walki z ciągłym zanieczyszczeniem ropą naftową pochodzącą z wód osadowych piasków roponośnych w prowincji Alberta w Kanadzie. Podczas procesu wydobycia ropy naftowej z piasków roponośnych bitum, półstała utleniona forma ropy, jest usuwany przy użyciu technik odzysku termicznego, które zużywają około 3,1 baryłki wody na jedną baryłkę ropy 1. Zanieczyszczona ropą woda technologiczna, pochodząca głównie z lokalnej rzeki, po wydobyciu bitumu jest magazynowana w stawach osadowych. Potrzebny jest bardziej efektywny recykling wody procesowej w celu zmniejszenia zapotrzebowania na pobór wody słodkiej. Aby ułatwić wydobycie bitumu i zapewnić, że zakłady położone w dolnym biegu rzeki spełniają wytyczne dotyczące jakości wody w celu ochrony ekosystemów wodnych, uzdatnianie wody procesowej szybko się rozwija 3.

Aby usunąć zanieczyszczenia związkami organicznymi, obecnie zachęca się do stosowania technologii bioremediacji wykorzystujących mikroorganizmy. 1. Alkany to najliczniejsza rodzina węglowodorów w ropie naftowej, zawierająca od 5 do 40 atomów węgla na cząsteczkę 7, 21. Wiadomo, że wiele bakterii rozkłada alkany o różnej długości poprzez sekwencyjne utlenianie końcowej grupy metylowej, tworząc najpierw alkohole, następnie aldehydy, a na końcu kwasy tłuszczowe 8. W ramach tego projektu iGEM poddano ekspresji i scharakteryzowano kilka enzymów z różnych organizmów, które zostały udostępnione za pośrednictwem standardu BioBrick i Rejestru Standardowych Części Biologicznych.

Dobrze zbadany system hydroksylazy alkanowej Gordonia sp. TF6 ułatwia początkowy etap utleniania alkanów C5-C 13 wraz z cykloalkanami C5-C 8 przy użyciu minimum czterech składników: alkB2 (1-monooksygenaza alkanowa), rubA3, rubA4 (dwie rubredoksyny) i RubB (reduktaza rubretoksyny) 8, 21. Doniesiono, że utlenianie alkanów długołańcuchowych (w zakresie od C15 do C36) odbywa się za pomocą ladA, monooksygenazy alkanowej flawoproteiny z Geobacillus thermodinitrificans NG-80-2 7, 15, 18, 22. LadA tworzy kompleks katalityczny z mononukleotydem flawinowym (FMN), który wykorzystuje tlen atomowy do utleniania. Powoduje to przekształcenie alkanów w odpowiadający im pierwszorzędowy alkanol. Alkohole są dalej utleniane przez dehydrogenazy alkoholowe i aldehydowe do kwasów tłuszczowych, które łatwo wchodzą na szlak β-utleniania 7, 21. Niezależna od cynku dehydrogenaza alkoholowa z termofilnej bakterii Geobacillus thermoleovorans B23 utlenia średniołańcuchowe alkanale do odpowiednich alkanali, wykorzystując NAD+ jako kofaktor 10. Dehydrogenaza aldehydowa z tej samej bakterii jest w stanie katalizować zależny od NAD + końcowy etap utleniania średniego łańcucha 11.

W celu zmniejszenia kosztów indukcji i utrzymania optymalnej proliferacji systemu bakteryjnego, scharakteryzowano promotor pCaiF z E.coli. Promotor ten może regulować ekspresję składników szlaku degradacji węglowodorów i jest regulowany przez poziomy cAMP-Crp, które z kolei zależą od poziomu glukozy 6. Przy wysokich zewnątrzkomórkowych stężeniach glukozy w środowisku komórkowy poziom cAMP (cykliczny fosforan mononukleotydu adenozyny) był niski dzięki hamowaniu cyklazy adenylowej jako efektu ubocznego transportu glukozy za pośrednictwem PTS. I odwrotnie, podczas ograniczenia (niskie stężenia glukozy) poziom cAMP wzrósł, a Crp związało się z cAMP, tworząc kompleks, cAMP-Crp, który wiązał pCaiF i aktywował transkrypcję dalszych składników 6, 14.

Wildtype E. coli może tolerować tylko umiarkowane stężenia węglowodorów. Aby uzupełnić zestaw narzędzi, należało zająć się kwestią tolerancji na węglowodory. Wiadomo, że kilka bakterii tolerujących rozpuszczalniki organiczne przeżywa w dwufazowych układach wodno-rozpuszczalnikowych 12. Składniki molekularne, o których wiadomo, że zwiększają tolerancję, to białka opiekuńcze, które ułatwiają prawidłowe fałdowanie białek. Wykazano, że system prefoldynowy z Pyrococcus horikoshii OT3, składający się z białek phPFDα i phPFDβ, zwiększa tolerancję węglowodorów 17.

Zestaw narzędzi do konwersji alkanów został skonstruowany zgodnie z zasadą BioBrick, która jest udokumentowana w Rejestrze Standardowych Części Biologicznych 9. BioBricks to plazmidy zawierające specyficzną funkcjonalną wstawkę, która jest otoczona przez 4 predefiniowane miejsca restrykcyjne. Wkłady BioBrick można elastycznie rozbudowywać, co pozwala na budowę systemów biologicznych o nowych funkcjach.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Montaż BioBrick

  1. BioBricki z Rejestru Standardowych Części Biologicznych są dostarczane przez centralę iGEM. Aby skonstruować nowy BioBrick z istniejących BioBricks, należy przetrawić biocegłę donorową (do 1,0 μg) za pomocą enzymów EcoRI i SpeI w celu umieszczenia części donorowej za częścią akceptorową. Trawienie za pomocą XbaI i PstI w celu umieszczenia części donorowej przed częścią akceptorową. Dodaj trzeci odpowiedni enzym restrykcyjny, który przecina kręgosłup dawcy. Trawienie należy przeprowadzić w łącznej objętości 20-25 ml z odpowiednim buforem, w zależności od dostawcy (stężenie końcowe 1x). Użyj 5 jednostek/μg DNA dla enzymów restrykcyjnych.
  2. Przetraw akceptor BioBrick za pomocą EcoRI i XbaI lub SpeI i PstI.
  3. Inkubować procesy trawienia przez (co najmniej) jedną godzinę w temperaturze 37 °C. Dezaktywować endonukleazy restrykcyjne za pomocą ciepła, inkubować w temperaturze 80 °C przez 10 minut i krótko odwirować.
  4. Zwiąż strawione części BioBrick (dawcę i akceptora) razem. Ponieważ XbaI i SpeI generują kompatybilne końcówki DNA, powstaje mieszane miejsce, którego nie można przeciąć żadnym enzymem restrykcyjnym, co skutkuje nowym "połączonym" BioBrickiem, który otaczają 4 standardowe miejsca restrykcyjne. W mieszaninie ligacyjnej końcowe stężenie DNA wynosi korzystnie ~100 ng/μl. Przeprowadzić reakcję ligacji w całkowitej objętości 10-15 ml z buforem ligacyjnym T4 (stężenie końcowe 1x) i ligazą T4 (1 jednostka/μg DNA).
  5. Mieszaninę do podwiązywania inkubować w temperaturze 16 °C przez co najmniej 3 godziny.
  6. Przeprowadź reakcję przemiany z około połową mieszaniny ligacyjnej.
  7. Upewnij się, że BioBrick jest poprawny za pomocą sekwencjonowania.
  8. Aby skonstruować nowy BioBrick ze zsyntetyzowanego DNA, zmodyfikuj geny do syntezy w celu uzyskania optymalnej ekspresji w E. coli za pomocą narzędzia internetowego JCat (http://www.jcat.de/). Dokonuj dalszych modyfikacji zgodnie z wymaganiami standardu BioBrick. Ta standaryzacja oznacza, że każdy BioBrick składa się z interesującej sekwencji DNA poprzedzonej przedrostkiem, po której następuje sufiks. Prefiks i sufiks to sekwencje, które zawierają predefiniowane miejsca restrykcyjne, których nie ma w pozostałej sekwencji plazmidowej. Te standardowe miejsca ograniczeń umożliwiają elastyczną wymianę i rozbudowę wkładów BioBrick 9. Prefiks i sufiks mają następujące sekwencje:
nazwa kolejność komentarz przedrostek 5' GAATTCGCGGCCGCTTCTAG3'     5' GAATTCGCGGCCGCTTCTAGAG 3' Jeśli następna część jest sekwencją kodowania lub dowolną częścią rozpoczynającą się od "ATG" przyrostek 5' TACTAGCGGCCGCTGCAG 3'  

2. Test komórek spoczynkowych konwersji alkanów, In Vivo

Ten test został przeprowadzony w oparciu o metodę opisaną przez Fujii et al. (2004).

  1. Hodowla komórek E. coli wykazujących ekspresję układu hydroksylazy alkanowej (BBa_K398014) oraz komórek przenoszących pusty wektor (BBa_J13002) w 5 ml pożywki LB z odpowiednimi antybiotykami przez noc.
  2. Przenieść 500 μl nocnej hodowli do 50 ml świeżego LB (z antybiotykiem) i inkubować, aż zmętnienie komórek osiągnie OD (gęstość optyczną) 0,3 przy 600 nm.
  3. Wirować przez 10 minut przy 4 000 obr./min i ponownie zawiesić osad w 5 ml 0,1 M buforu fosforanowego (pH 7,4).
  4. Ponownie odwirować przez 10 minut przy 4,000 obr./min i ponownie zawiesić osad w 5 ml 0,1 M buforu fosforanowego zawierającego sole E2 i 0,66% v/v glicerol (pożywka z niedoborem azotu).
  5. Zmierz zmętnienie komórek (OD600).
  6. Przygotować podwielokrotności mieszaniny komórek po 6 ml w szklanych kolbach o pojemności 25 ml z zamkniętą nakrętką i kontrolach bezkomórkowych (sole E2 + 0,66% v/v glicerolu).
  7. Dodać 100 nmol alkanu do każdej kolby.
  8. Inkubować mieszaniny w temperaturze 37 °C przez 24 godziny (skrócić, gdy uzyskuje się wyższe dawki).
  9. Zmierz OD600 po inkubacji.
  10. Ekstrahować węglowodory w pożywce za pomocą octanu etylu i oznaczać stężenie węglowodorów w hodowli komórkowej metodą chromatografii gazowej (patrz protokół 3).
  11. Obliczyć degradację na jednostkę biomasy, dzieląc całkowitą ilość przeliczonego alkanu przez całkowitą ilość biomasy obecnej w każdej kolbie (przeliczyć OD600 na suchą masę). Dzieląc wynik przez czas trwania doświadczenia, otrzymujemy aktywność degradacji na jednostkę biomasy na jednostkę czasu. Średnia jest pobierana z trzech indywidualnych przejazdów.

3. Test enzymu konwersji alkanów, In Vitro

Ten test został przeprowadzony zasadniczo zgodnie z metodą opisaną przez Li et al. (2008).

  1. Hodowla komórek E. coli wykazujących ekspresję genu ladA (BBa_K398017) oraz komórek przenoszących pusty wektor (BBa_J13002) w 50 ml pożywki LB z odpowiednimi antybiotykami przez noc.
  2. Przenieść 500 μl nocnej hodowli do 50 ml świeżego LB (z antybiotykiem) i inkubować do momentu, gdy zmętnienie komórek osiągnie gęstość optyczną 0,6 przy 600 nm.
  3. Odwirować przez 10 minut przy 4 000 obr./min (4 °C) i ponownie zawiesić osad w 5 ml 50 mM buforu Tris.
  4. Sonicate (Cell disrupter, LA Biosystems) ogniwa w 40% cyklu pracy z kontrolą wyjściową 4, utrzymują roztwór na lodzie przez cały czas trwania.
  5. Powstałą mieszaninę należy odwirowywać przez 5 minut przy 4 000 obr./min w temperaturze 4 °C w celu usunięcia resztek komórek. Przenieść supernatant do świeżej fiolki.
  6. Określić całkowite stężenie białka w ekstraktach komórkowych za pomocą testu Bradforda. Uwaga: Używać szklanych fiolek, aby zapobiec wzrostowi tła i/lub utracie białka.
  7. Przygotować 100 ml mieszaniny zawierającej 0,1% v/v alkanu i 50 mM buforu Tris-HCl.
  8. Podgrzewać mieszaninę w temperaturze 100 °C przez 5 minut. Uwaga: Ten krok należy wykonać tylko w przypadku alkanów o średnio-długich łańcuchach o wysokiej temperaturze wrzenia. (np. C16: 287 °C).
  9. Aby osiągnąć optymalną rozpuszczalność alkanu, należy poddać sonikacji przez 1 minutę, będąc jeszcze ciepłym, aż do uzyskania jednorodnej, lepkiej mieszaniny.
  10. Dodać 1 mM NADH, 1 mM FMN, 1 mM MgSO4 i 0,01 v/v Triton X-100.
  11. Przygotować 6 ml podwielokrotności w kolbach o pojemności 25 ml z zamkniętym wieczkiem.
  12. Dodać odpowiednią ilość ekstraktu komórkowego (w zależności od testów Bradforda, końcowe stężenie 5 mg białka/l). Przygotuj kontrolę bez białka.
  13. Inkubować w temperaturze 60 °C (dla optymalnej aktywności enzymatycznej) przez 24 godziny.
  14. Ekstrahować węglowodory w pożywce za pomocą octanu etylu i oznaczać stężenie węglowodorów w hodowli komórkowej metodą chromatografii gazowej (patrz protokół 3).
  15. Obliczyć degradację na jednostkę biomasy, dzieląc całkowitą ilość przeliczonego alkanu przez całkowitą ilość białka dodanego do każdej kolby (za pomocą krzywej kalibracyjnej Bradforda). Dalsze dzielenie przez czas trwania eksperymentu daje aktywność degradacji na jednostkę białka komórkowego na jednostkę czasu. Średnia jest pobierana z trzech indywidualnych przejazdów.

4. Ekstrakcja i pomiary stężenia węglowodorów octanu etylu

  1. Alkany ekstrahuje się z roztworu wodnego przez dodanie 2,5 ml octanu etylu (rozpuszczalnika niepolarnego) do 6 ml roztworu doświadczalnego. Do rozpuszczalnika dodaje się wzorzec wewnętrzny o stężeniu 0,1 % (v/v). Norma (np. cyklodek) różniła się w zależności od oczekiwanego zasięgu interesujących nas pików.
  2. Opcjonalnie: Dodaj Triton X-100 do mieszaniny wodnej i odwiruj próbki przez 10 minut z prędkością 4 000 obr./min, aby uzyskać odpowiedni system dwufazowy.
  3. Wirować mieszaninę przez 5 sekund (1 500 obr./min) i inkubować w temperaturze pokojowej, aż obie fazy się rozdzielą.
  4. Usunąć maksymalną ilość warstwy organicznej (góra) i wysuszyć rozpuszczalnik za pomocą bezwodnego siarczanu magnezu.
  5. UsunąćMgSO4 przez filtrację (0,2 μm) i przenieść filtrat do fiolek z chromatografem gazowym w celu wykonania pomiarów lub przechowywać w temperaturze -20 °C.
  6. Oznaczyć stężenie metodą chromatografii gazowej przy użyciu kolumny CP-SIL 5CB (długość = 5 m). Wstrzyknąć 10 μl próbki w trybie podziału (1:10, 230 °C). Ustawić przepływ gazu w kolumnie na 1 ml/min (hel). Używany jest następujący program temperatury piekarnika: tempo Temperatura [°C] Czas [min] 0 50 Rozdział 7,5 50 Rozdział 90 Rozdział 1,0 50 Rozdział Rozdział 110 2.0 50 Rozdział 130 szt. 2.0 50 Rozdział Rozdział 145 2.0 50 Rozdział 160 szt. 2.0 50 Rozdział 170 szt. 2.0 50 Rozdział 185 Rozdział 185 2.0 50 Rozdział 210 szt. 2.0 50 Rozdział Z kolei 250 szt. 2.0 50 Rozdział 320 szt. 2.0
  7. Skompletować piki i skorygować stężenia w odniesieniu do wzorca wewnętrznego.

5. Test aktywności dehydrogenazy alkoholowej/aldehydowej

Ten test został przeprowadzony zasadniczo zgodnie z metodą opisaną przez Kato et al. (2010).

  1. Hodowla komórek E. coli wykazujących ekspresję genu ADH (BBa_K398018) lub ALDH (BBa_K398030) oraz komórki niosące pusty wektor (BBa_J13002) w 50 ml pożywki LB z odpowiednimi antybiotykami przez noc.
  2. Przenieść 500 μl nocnej hodowli do 50 ml świeżego LB (z antybiotykiem) i inkubować do momentu, gdy zmętnienie komórek osiągnie gęstość optyczną 0,6 przy 600 nm.
  3. Odwirować 10 minut przy 4 000 obr./min w temperaturze 4 °C i ponownie zawiesić osad w 5 ml 50 mM buforu Tris.
  4. Sonikować roztwór ogniwa w 40% cyklu pracy z kontrolą wydajności 4 (utrzymuj roztwór na lodzie podczas sonikacji).
  5. Powstałą mieszaninę należy odwirowywać przez 5 minut z prędkością 4 000 obr./min w temperaturze 4 °C w celu usunięcia resztek komórek.
  6. Określić całkowite stężenie białka w ekstraktach komórkowych za pomocą testu Bradforda (Uwaga: użyj szklanej fiolki, aby zapobiec wiązaniu białek).
  7. Załaduj 96-dołkową płytkę ze 180 μl 57 mM buforem glicyny zawierającym NAD (stężenie końcowe 1 mM, pH 9,5) do każdej studzienki.
  8. Dodać 5 μl alkoholu (aldehydu) do badania do studzienek. Uwaga: Alkohole o długich łańcuchach należy podgrzać przed rozpoczęciem oznaczania, aby uzyskać płyn. Do każdego alkoholu (aldehydu) należy dodać kontrolę bez substratu (kontrola ujemna). Ponadto należy przygotować ślepą próbę zawierającą mieszaninę buforu i substratu bez ekstraktu komórkowego.
  9. Rozgrzej płytkę czytnika płytek (Tecan Magellan v7.0) przez 15 minut w temperaturze 37 °C, aby umożliwić zrównoważenie systemu.
  10. Dodać odpowiednią ilość ekstraktu komórkowego (w zależności od testów Bradforda, końcowe stężenie 5 mg białka/l). Przygotuj kontrolę bez białka.
  11. Mierzyć produkcję NADH za pomocą spektrofotometru o długości fali 340 nm co 2-3 minuty przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C.
  12. Obliczyć szybkość produkcji NADH na podstawie nachylenia średnicy zewnętrznej (340 nm). Weź pod uwagę długość drogi światła i współczynnik ekstynkcji NADH wynoszący 6220 M-1 cm-1. Podziel szybkość produkcji NADH przez całkowitą ilość białka dodanego w celu wyrażenia aktywności reakcji dehydrogenazy w ekstrakcie komórkowym (U/mg białka pełnokomórkowego). Obliczyć średnią i odchylenie standardowe z trzech niezależnych przebiegów.

6. Charakterystyka pCaiF

  1. Hodowla komórek E. coli eksprymujących konstrukt pCaiF-GFP (BBa_K398331) oraz komórek przenoszących sam promotor (BBa_K398326) przez noc w 5 ml LB pożywki z odpowiednimi antybiotykami przez noc.
  2. Zaszczepić 5 ml M9 zawierającego 10 g/l glukozy i antybiotyki 50 μl nocnej kultury i rosnąć przez noc.
  3. Subkultura 50 μl nocnego wzrostu do 5 ml świeżego M9 o stężeniu 10 g/l i inkubować do momentu, gdy zmętnienie komórek osiągnie gęstość optyczną 0,2 przy 600 nm.
  4. Załaduj 96-dołkową płytkę 100 μl świeżej pożywki M9 zawierającej żądaną ilość źródła węgla do badania w każdym dołku. Przeprowadzić trzy doświadczenia w celu oceny statystycznej i dodać odpowiednie kontrole ujemne (E. coli K12 typu dzikiego).
  5. Dodać 5 μl nocnej kultury do pożywki zawierającej studzienki.
  6. Mierzyć krzywą wzrostu (OD600) i fluorescencję GFP (wzbudzenie 485 nm i emisja 520) za pomocą czytnika płytek co 10 minut przez 18 godzin w temperaturze 37 °C przy ciągłym wstrząsaniu.
  7. Obliczyć szybkość wzrostu i zawartość właściwej GFP na podstawie odpowiednich pomiarów i porównać z kontrolą. Obliczyć średnią i odchylenie standardowe z co najmniej trzech niezależnych doświadczeń.

7. Test tolerancji

  1. Hodowla E. coli z ekspresją PhPFDα i genu β (BBa_K398406) przez noc w 5 ml pożywki LB i odpowiednich antybiotyków. E. coli wykazujący ekspresję genu ladA (BBa_K398017) jest używany jako kontrola negatywna.
  2. Subkultura 10 μl nocnego wzrostu na świeże 5 ml LB (z antybiotykiem) i inkubować do momentu, gdy zmętnienie komórek osiągnie gęstość optyczną 0,3 do 0,4 przy 600 nm.
  3. Rozcieńczyć kultury świeżą pożywką, aż do osiągnięcia OD600 0,1.
  4. Załadować 96-dołkową płytkę ze 180 μl pożywki M9 zawierającej odpowiednie antybiotyki i właściwe końcowe stężenie toksycznego związku (np. 0, 4, 8, 10% n-heksanu) w trzech egzemplarzach. Ze względu na to, że mieszaniny alkanów i wody mogą prowadzić do powstania systemów dwufazowych, konieczne jest przeprowadzenie odpowiednich kontroli na płytce (np. różne szczepy i odpowiednie ślepe próby).
  5. Dodać 20 μl kultury (kontrolnej) do studzienek.
  6. Mierzyć stężenie biomasy (OD600) za pomocą czytnika płytek co 10 minut przez 24 godziny w temperaturze 37 °C przy ciągłym wstrząsaniu.
  7. Obliczyć tempo wzrostu na podstawie odpowiednich pomiarów dla różnych stężeń czynnika i porównać z kontrolą ujemną. Obliczyć średnią i odchylenie standardowe z co najmniej trzech niezależnych przebiegów.

8. Mapowanie interakcji homologicznej

  1. Aplikacja HIM została opracowana do wykonywania zapytań o białka na serwerze PostgreSQL z uruchomioną bazą danych STRING (bezpłatną do użytku akademickiego) 20. Aplikacja do mapowania interakcji homologów identyfikuje oddziałujące białka w pierwotnym organizmie gospodarza za pomocą bazy danych STRING. Sekwencje odpowiednich oddziałujących genów są wykorzystywane w wyszukiwaniu BLAST w celu znalezienia genów homologicznych w organizmie docelowym. Cytoscape 4 służy do wizualizacji wyniku mapowania. Narzędzie programowe HIM można pobrać pod adresem: https://github.com/jcnossen/InteractionHomologMapping.
  2. Aby wykonać mapowanie, (1) wprowadź identyfikator BioBrick, a aplikacja automatycznie pobierze dane sekwencji części z Rejestru Standardowych Części Biologicznych 9 lub (2) wprowadź (wklej) dane sekwencji w aplikacji.
  3. Użyj witryny internetowej bazy danych STRING, aby znaleźć identyfikator białka STRING dla wprowadzonej sekwencji aminokwasów.
  4. Białko o wysokiej homologii określa się za pomocą BLAST. Następnie aplikacja wymienia każde znane białko oddziałujące w organizmie źródłowym i wyszukuje homologi w organizmie gospodarza (np. E. coli).
  5. Eksportuj wynikową listę domniemanych interakcji do tekstu lub Cytoscape.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Konwersja alkanów

Aktywność trzech etapów utleniania od alkanu do odpowiedniego kwasu tłuszczowego została oceniona za pomocą testów komórek spoczynkowych i pomiarów aktywności enzymów. Wyniki przedstawiono po zaobserwowaniu reakcji szlaku (1) hydroksylazy alkanowej, (2) dehydrogenazy alkoholowej i (3) dehydrogenazy aldehydowej.
W pierwszym etapie skonstruowano różne plazmidy dla alkanów średnio- i długołańcuchowych. Plazmid

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zasada BioBrick została wykorzystana do skonstruowania podwozia do degradacji alkanów i uzyskano dowód słuszności zasady dla poszczególnych komponentów zestawu narzędzi. Zaproponowano kilka testów do pomiaru aktywności enzymów szlaku rozkładu alkanów in vivo i in vitro . Zaprezentowana praca z powodzeniem demonstruje szereg metod, które mogą być wykorzystane do określenia aktywności i ekspresji enzymu w organizmie gospodarza E. coli po wdrożeniu odpowiednich BioBricks. Ponadto wykazano, że zasa...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nie stwierdzono konfliktu interesów.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Eksperymenty przedstawione w tym artykule wideo zostały opracowane na potrzeby międzynarodowego konkursu Genetycznie Modyfikowanych Maszyn 9. Autorzy pragną podziękować członkom zespołu iGEM: Luke'owi Bergwerffowi, Pieterowi T.M. van Boheemenowi, Jelmerowi Cnossenowi, Hugo F. Cueto Rojasowi i Ramonowi van der Valkowi za pomoc w badaniach. Dziękujemy Han de Winde, Stefanowi de Kok i Esengülowi Yıldırımowi za pomocne dyskusje i prowadzenie tych badań. Prace te były wspierane przez Wydział Biotechnologii Uniwersytetu Technicznego w Delft, laboratorium bioinformatyczne w Delft, Wydział Bionanonauki Uniwersytetu Technicznego w Delft, Inicjatywę Przywództwa Piasków Roponośnych (OSLI), StuD studentenuitzendbureau, Holenderską Inicjatywę Genomiczną, Kluyver Centre, Nederlandse Biotechnologische Vereniging (Stichting Biotechnology Nederland), DSM, Geneart, Greiner bio-one i Genencor.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
E. coli K12New England BiolabsC2523H
OctanFluka74822
HexadecaneFluka52209
oktanol-1Fluka95446
dodekanol-1Sigma-Aldrich126799
HeksanSigma-Aldrich296090
NADHSigma-AldrichN4505
FMNSigma-AldrichF2253
MgSO4J.T. Baker Casno7487 889
Triton X-100Sigma-AldrichT8787
T4 ligazaNew England BiolabsM0202L
Chromatograf
Rozbijacz komórekLA BiosystemsCD-019
SpektrofotometrAmersham pharmaciaspec 2000
Czytnik płytekTecan Group Ltd.Magellan v7.0
Innova, 44
BioBrickTM K398014: BBa_J23100-BBa_J61100-alkB2-BBa_J61100-rubA3-BBa_J61100-rubA4- BBa_J61100-rubBDelft University of Technology na Wydziale Biotechnologii lub Rejestru Standardowych Części BiologicznychBBa_K398014Alkane Hydroksylaza System
Odporność: Chloramfenikol
BioBrickTM K398027: BBa_R0040-BBa_B0034-ladA Uniwersytet Techniczny w Delft na Wydziale Biotechnologii lub Rejestru Standardowych Części BiologicznychBBa_K398027ladA Generator białek
Odporność: Chloramfenikol
BioBrickTM K398018: BBa_J23100-BBa_J61101-ADH Uniwersytet Techniczny w Delft na Wydziale Biotechnologii lub Rejestrze Standardowych Części BiologicznychBBa_K398018ADH generator
Odporność: Chloramfenikol
BioBrickTM K398030: BBa_R0040-BBa_B0034-ALDH Uniwersytet Techniczny w Delft na Wydziale Biotechnologii lub Rejestrze Standardowych Części BiologicznychBBa_K398030ALDH generator
Odporność: Chloramfenikol
BioBrickTM K398326: pCaiF Delft University of Technology na Wydziale Biotechnologii lub Rejestru Standardowych Części BiologicznychBBa_K398326promotor pCaiF
Odporność: Chloramfenikol
BioBrickTM K398331: pCaiF-BBa_B0032-BBa_I13401Delft University of Technology na Wydziale Biotechnologii lub Rejestrze Standardowych Części BiologicznychBBa_K398331pCaiF urządzenie pomiarowe
Odporność: Chloramfenikol
BioBrickTM K398406: BBa_J23002-BBa_J61107-phPFDα -BBa_J61107- Uniwersytet Techniczny w Delft na Wydziale Biotechnologii lub Rejestrze Standardowych Części BiologicznychBBa_K398406Klasa tolerancji rozpuszczalnika
Odporność: Chloramfenikol
gazowyInkubator

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Allen, E. W. Process water treatment in Canada's oil sands industry: I: Target pollutants and treatment objectives. J. Environ. Eng. Sci. 7, 123-138 (2008).
  2. Alon, U. An Introduction to Systems Biology: Design Principles of Biological Circuits. , CRC Press. (2007).
  3. Center, O. P. Understanding Oil Spills and Oil Spill Response. , (1999).
  4. Cytoscape. An Open Source Platform for Complex Network Analysis and Visualization [Internet]. , Available from: http://www.cytoscape.org (2012).
  5. Non-Invasive Biomass Monitor with Wide Linear Range [Internet]. , Available from: http://www.buglab.com/docs/OnLineODMeasurement.pdf (2012).
  6. Eichler, K., Buchet, A., Lemke, R., Kleber, H. P., Mandrand-Berthelot, M. A. Identification and characterization of the caiF gene encoding a potential transcriptional activator of carnitine metabolism in Escherichia coli. J. Bacteriol. 178, 1248-1257 (1995).
  7. Feng, L., Wang, W., Cheng, J., Ren, Y., Zhao, G., Gao, C., Tang, Y., Liu, X., Han, W., Peng, X., et al. Genome and proteome of long-chain alkane degrading Geobacillus thermodenitrificans NG80-2 isolated from a deep-subsurface oil reservoir. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104 (13), 5602-5607 (2007).
  8. Fujii, T., Narikawa, T., Takeda, K., Kato, J. Biotransformation of various alkanes using the Escherichia coli expressing an alkane hydroxylase system from Gordonia sp. TF6. Biosci. Biotechnol. Biochem. 68 (10), 2171-2177 (2004).
  9. iGEM. Registry of Standard Biological Parts [Internet]. , Available from: http://partsregistry.org/Main_Page (2012).
  10. Kato, T., Miyanaga, A., Haruki, M., Imanaka, T., Morikawa, M., Gene Kanaya, S. cloning of an alcohol dehydrogenase from thermophilic alkane-degrading Bacillus thermoleovorans B23. J. Biosci. Bioeng. 91 (1), 100-102 (2001).
  11. Kato, T., Miyanaga, A., Kanaya, S., Morikawa, M. Gene cloning and characterization of an aldehyde dehydrogenase from long-chain alkane-degrading Geobacillus thermoleovorans B23. Extremophiles. 14, 33-39 (2010).
  12. Kieboom, J., De Bont, J. aM. Bacterial Stress Responses. , ASM Press. Washington, D.C. (2000).
  13. Kotte, O., Zaugg, J. B., Heinemann, M. Bacterial adaptation through distributed sensing of metabolic fluxes. Mol Syst Biol. 6, 355(2010).
  14. Kremling, A., Bettenbrock, K., Gilles, E. D. Analysis of global control of Escherichia coli carbohydrate uptake. BMC Syst. Biol. 1, (2007).
  15. Li, L., Liu, X., Yang, W., Xu, F., Wang, W., Feng, L., Bartlam, M., Wang, L., Rao, Z. Crystal structure of long-chain alkane monooxygenase (LadA) in complex with coenzyme FMN: unveiling the long-chain alkane hydroxylase. J. Mol. Biol. 376 (2), 453-465 (2008).
  16. Lin, H. Y., Mathiszik, B., Xu, B., Enfors, S. O., Neubauer, P. Determination of the maximum specific uptake capacities for glucose and oxygen in glucose-limited fed-batch cultivations of Escherichia coli. Biotechnol. Bioeng. 73 (5), 347-357 (2001).
  17. Okochi, M., Kanie, K., Kurimoto, M., Yohda, M., Honda, H. Overexpression of prefoldin from the hyperthermophilic archaeum Pyrococcus horikoshii OT3 endowed Escherichia coli with organic solvent tolerance. Appl. Microbiol. Biotechnol. 79 (3), 443-449 (2008).
  18. Rehm, H. J., Reiff, I. Mechanisms and occurrence of microbial oxidation of long-chain alkanes. Adv. Biochem. Eng. / Biotechnol. 19, 175-215 (1981).
  19. Rojo, F. Degradation of alkanes by bacteria. Environ. Microbiol. 11 (10), 2477-2490 (2009).
  20. STRING 9.0 Known and Predicted Protein-Protein Interactions [Internet]. , Available from: http://string-db.org/newstring_cgi/show_download_page.pl (2012).
  21. Van Beilen, J. B., Panke, S., Lucchini, S., Franchini, A. G., Rothlisberger, M., Witholt, B. Analysis of Pseudomonas putida alkane-degradation gene clusters and flanking insertion sequences: evolution and regulation of the alk genes. Microbiology. 147, 1621-1630 (2001).
  22. Wang, L., Tang, Y., Wang, S., Liu, R. L., Liu, M. Z., Zhang, Y., Liang, F. L., Feng, L. Isolation and characterization of a novel thermophilic Bacillus strain degrading long-chain n-alkanes. Extremophiles. 10 (4), 347-356 (2006).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Degradacja alkan wEscherichia colisystem BioBricksregulacja ekspresji gen wtolerancja na rozpuszczalnikitesty z kom rkami spoczynkowymipromotor regulowany przez substrattolerancja na w glowodorybiologia syntetyczna

Powiązane artykuły