Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Zestaw narzędzi umożliwiających konwersję węglowodorów w środowiskach wodnych

13.7K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/4182

⸱

2 października 2012

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Biotechnology, Delft University of Technology, 2Delft Center for Systems and Control, Delft University of Technology

W tym artykule

Podsumowanie

Zaprojektowano zrównoważony, samoregulujący się system bakteryjny do remediacji zanieczyszczeń ropą naftową, wykorzystując standardowe, wymienne części DNA (BioBricks). Zmodyfikowany szczep E. coli został wykorzystany do degradacji alkanów poprzez β-oksydację w toksycznych środowiskach wodnych. Odpowiednie enzymy pochodzące od różnych gatunków wykazały aktywność degradującą alkany. Ponadto, poprzez wprowadzenie genów z bakterii tolerujących alkany, osiągnięto zwiększoną tolerancję na n-heksan.

Streszczenie

Niniejsza praca proponuje zestaw narzędzi umożliwiający konwersję alkanów przez Escherichia coli oraz przedstawia dowód koncepcji jego zastosowalności. Zestaw składa się z wielu standardowych, wymiennych części (BioBricks)9 odpowiedzialnych za konwersję alkanów, regulację ekspresji genów oraz przeżycie w toksycznych środowiskach bogatych w węglowodory.

W E. coli wdrożono trzystopniową ścieżkę degradacji alkanów, aby umożliwić konwersję alkanów średnio- i długołańcuchowych do odpowiednich alkanoli, alkanali i ostatecznie kwasów alkanowych. Te ostatnie były metabolizowane poprzez rodzimą ścieżkę β-oksydacji. Aby ułatwić utlenianie alkanów średniołańcuchowych (C5-C13) i cykloalkanów (C5-C8), do E. coli wprowadzono cztery geny (alkB2, rubA3, rubA4 oraz rubB) systemu hydroksylazy alkanowej z Gordonia sp. TF68,21. Do konwersji alkanów długołańcuchowych (C15-C36) zastosowano gen ladA z Geobacillus thermodenitrificans. W celu realizacji kolejnych niezbędnych etapów procesu degradacji wprowadzono ADH i ALDH (pochodzące z G. thermodenitrificans)10,11. Aktywność mierzono za pomocą testów z wykorzystaniem spoczynkowych komórek. Obserwowano aktywność enzymatyczną dla każdego etapu utleniania.

Aby zoptymalizować wydajność procesu, ekspresję indukowano wyłącznie w warunkach niskiego stężenia glukozy: zastosowano promotor regulowany przez substrat, pCaiF. pCaiF występuje w E. coli K12 i reguluje ekspresję genów zaangażowanych w degradację nieglukozowych źródeł węgla.

Ostatnia część zestawu narzędzi – ukierunkowana na przeżywalność – została zaimplementowana z wykorzystaniem genów tolerancji na rozpuszczalniki, PhPFDα i β, pochodzących z Pyrococcus horikoshii OT3. Rozpuszczalniki organiczne mogą wywoływać stres komórkowy i obniżać przeżywalność poprzez negatywny wpływ na zwijanie białek. Jako chaperony, PhPFDα i β usprawniają proces fałdowania białek, np. w obecności alkanów. Ekspresja tych genów doprowadziła do poprawy tolerancji na węglowodory, co objawiło się zwiększeniem tempa wzrostu (do 50%) w obecności 10% n-heksanu w pożywce hodowlanej.

Podsumowując, wyniki wskazują, że zestaw narzędzi umożliwia E. coli przetwarzanie i tolerowanie węglowodorów w środowiskach wodnych. W związku z tym stanowi on pierwszy krok w stronę zrównoważonego rozwiązania w zakresie remediacji ropy z wykorzystaniem podejścia biologii syntetycznej.

Wprowadzenie

Zanieczyszczenie ropą naftową jest jedną z najpoważniejszych przyczyn kontaminacji środowiska i w dużym stopniu wpływa na ekosystemy, przedsiębiorstwa oraz społeczności 3. Rozwiązania są na przykład wymagane w celu zwalczania ciągłego zanieczyszczenia ropą pochodzącego z wód odciekowych z piasków bitumicznych w Albercie w Kanadzie. Podczas procesu ekstrakcji ropy z piasków bitumicznych bitum, półstała utleniona forma ropy, jest usuwany przy użyciu technik odzysku termicznego, które zużywają około 3,1 baryłek wody na jedną baryłkę ropy 1. Zanieczyszczona ropą woda procesowa, pochodząca głównie z lokalnej rzeki, jest przechowywana w stawach osadnikowych po ekstrakcji bitumu. Konieczny jest bardziej efektywny recykling wody procesowej w celu zmniejszenia zapotrzebowania na pobór świeżej wody. Aby ułatwić ekstrakcję bitumu i zapewnić, że miejsca położone w dolnym biegu rzek spełniają wytyczne dotyczące jakości wody w celu ochrony ekosystemów wodnych, metody oczyszczania wody procesowej ewoluują w szybkim tempie 3.

W celu usuwania zanieczyszczeń związkami organicznymi obecnie promuje się technologie bioremediacji wykorzystujące mikroorganizmy 1. Alkany stanowią najliczniejszą grupę węglowodorów w ropie naftowej, zawierając od 5 do 40 atomów węgla w cząsteczce 7, 21. Znane jest, że wiele bakterii degraduje alkany o różnej długości poprzez sekwencyjne utlenianie końcowej grupy metylowej, tworząc najpierw alkohole, następnie aldehydy, a na koniec kwasy tłuszczowe 8. W ramach niniejszego projektu iGEM wyeksponowano i scharakteryzowano kilka enzymów z różnych organizmów, które udostępniono za pośrednictwem standardu BioBrick oraz Registry of Standard Biological Parts.

Dobrze poznany systemy alkanowej hydroksylazy szczepu Gordonia sp. TF6 umożliwia początkowy etap utleniania alkanów C5-C13 oraz cykloalkanów C5-C8 przy udziale co najmniej czterech komponentów: alkB2 (alkanowej 1-monooksygenazy), rubA3, rubA4 (dwóch rubredoksyn) oraz RubB (reduktazy rubredoksyny) 8, 21. Zgłoszono, że utlenianie alkanów długołańcuchowych (od C15 do C36) jest przeprowadzane przez ladA, flawoproteinową alkanową monooksygenazę z Geobacillus thermodinitrificans NG-80-2 7, 15, 18, 22. LadA tworzy kompleks katalityczny z mononukleotydem flawinowym (FMN), który wykorzystuje tlen atomowy do utleniania. Prowadzi to do konwersji alkanów w odpowiadające im pierwszorzędowe alkanole. Alkohole są następnie utleniane przez dehydrogenazy alkoholowe i aldehydowe do kwasów tłuszczowych, które łatwo wchodzą w szlak β-oksydacji 7, 21. Niezależna od cynku dehydrogenaza alkoholowa z termofilnej bakterii Geobacillus thermoleovorans B23 utlenia średniołańcuchowe alkanole do odpowiednich alkanali, wykorzystując NAD+ jako kofaktor 10. Dehydrogenaza aldehydowa z tej samej bakterii jest w stanie katalizować zależny od NAD+ końcowy etap utleniania średniołańcuchowego 11.

W celu obniżenia kosztów indukcji oraz utrzymania optymalnej proliferacji układu bakteryjnego scharakteryzowano promotor pCaiF z E.coli. Promotor ten może regulować ekspresję komponentów szlaku degradacji węglowodorów i jest regulowany przez poziomy cAMP-Crp, które z kolei zależą od poziomu glukozy 6. Przy wysokich pozakomórkowych stężeniach glukozy w środowisku poziom komórkowego cAMP (cyklicznego monofosforanu adenylozy) był niski w wyniku inhibicji cyklazy adenylowej jako efektu ubocznego transportu glukozy zapośredniczonego przez układ PTS. Odwrotnie, w warunkach ograniczenia (niskich stężeń glukozy) poziom cAMP wzrastał, a Crp wiązało cAMP, tworząc kompleks cAMP-Crp, który wiązał pCaiF i aktywował transkrypcję komponentów położonych poniżej 6, 14.

Dziki szczep E. coli toleruje jedynie umiarkowane stężenia węglowodorów. Aby uzupełnić zestaw narzędzi, należało rozwiązać kwestię tolerancji na węglowodory. Znane jest kilka bakterii tolerujących rozpuszczalniki organiczne, które przeżywają w dwufazowych układach woda-rozpuszczalnik 12. Komponentami molekularnymi znanymi z właściwości zwiększania tolerancji są chaperony, które ułatwiają prawidłowe fałdowanie białek. Wykazano, że system prefoldyny z Pyrococcus horikoshii OT3, składający się z białek phPFDα i phPFDβ, zwiększa tolerancję na węglowodory 17.

Zestaw narzędzi do konwersji alkanów został zbudowany zgodnie z zasadą BioBrick, która jest udokumentowana w Registry of Standard Biological Parts 9. BioBricks to plazmidy zawierające specyficzną funkcjonalną wstawkę, która jest flankowana przez 4 zdefiniowane miejsca restrykcyjne. Wstawki BioBrick mogą być elastycznie rozbudowywane, co umożliwia konstruowanie systemów biologicznych o nowych funkcjach.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Montaż BioBricków

  1. BioBricks z Registry of Standard Biological parts są dostarczane przez kwaterę główną iGEM. Aby skonstruować nowy BioBrick z istniejących BioBricks, poddaj BioBrick donora (do 1,0 μg) trawieniu enzymami EcoRI i SpeI, aby umieścić część donora poniżej części akceptora. Poddaj trawieniu enzymami XbaI i PstI, aby umieścić część donora powyżej części akceptora. Dodaj trzeci odpowiedni enzym restrykcyjny, który tnie w szkielecie donora. Przeprowadź trawienia w całkowitej objętości 20-25 ml z odpowiednim buforem, zgodnie z zaleceniami dostawcy (stężenie końcowe 1x). Do enzymów restrykcyjnych użyj 5 jednostek/μg DNA.
  2. Poddaj BioBrick akceptora trawieniu za pomocą EcoRI i XbaI lub SpeI i PstI.
  3. Inkubuj mieszaniny trawienne przez (co najmniej) jedną godzinę w 37 °C. Inaktywuj endonukleazy restrykcyjne termicznie, inkubując w 80 °C przez 10 min, a następnie krótko odwiruj.
  4. Liguj strawione części BioBrick (donora i akceptora). Ponieważ XbaI i SpeI generują kompatybilne końce DNA, powstaje miejsce hybrydowe, którego nie można przeciąć żadnym enzymem restrykcyjnym, co skutkuje nowym „połączonym” BioBrickiem flankowanym przez 4 standardowe miejsca restrykcyjne. W mieszaninie ligacyjnej końcowe stężenie DNA powinno wynosić preferencyjnie ~100 ng/μl. Przeprowadź reakcję ligacji w całkowitej objętości 10-15 ml z buforem ligacyjnym T4 (stężenie końcowe 1x) i ligazą T4 (1 jednostka/μg DNA).
  5. Inkubuj mieszaninę ligacyjną w 16 °C przez co najmniej 3 h.
  6. Przeprowadź reakcję transformacji z około połową mieszaniny ligacyjnej.
  7. Potwierdź poprawność BioBricka za pomocą sekwencjonowania.
  8. Aby skonstruować nowy BioBrick z syntetyzowanego DNA, zmodyfikuj geny do syntezy w celu optymalizacji ekspresji w E. coli za pomocą narzędzia dostępnego na stronie JCat (http://www.jcat.de/). Wprowadź dalsze modyfikacje zgodnie z wymogami standardu BioBrick. Standaryzacja ta oznacza, że każdy BioBrick składa się z sekwencji DNA zainteresowania, poprzedzonej prefiksem i zakończonej sufiksem. Prefiks i sufiks to sekwencje zawierające zdefiniowane miejsca restrykcyjne, które nie występują w pozostałej części sekwencji plazmidu. Te standardowe miejsca restrykcyjne umożliwiają elastyczną wymianę i rozbudowę insertów BioBrick 9. Prefiks i sufiks mają następujące sekwencje:
NazwaSekwencjaKomentarz
Prefiks5' GAATTCGCGGCCGCTTCTAG3' 
 5' GAATTCGCGGCCGCTTCTAGAG 3'Jeśli następująca część jest sekwencją kodującą lub jakąkolwiek częścią rozpoczynającą się od „ATG”
Sufiks5' TACTAGTAGCGGCCGCTGCAG 3' 

2. Analiza konwersji alkanów w spoczynkowych komórkach, In Vivo

Analizę tę przeprowadzono w oparciu o metodę opisaną przez Fujii et al. (2004).

  1. Kulturować komórki E. coli ekspresujące system alkanowej hydroksylazy (BBa_K398014) oraz komórki zawierające pusty wektor (BBa_J13002) w 5 ml pożywki LB z odpowiednimi antybiotykami przez noc.
  2. Przenieść 500 μl nocnej kultury do 50 ml świeżej pożywki LB (z antybiotykiem) i inkubować do momentu, aż mętność komórek osiągnie OD (gęstość optyczną) 0.3 przy 600 nm.
  3. Wirować przez 10 min przy 4,000 rpm i resuspender osad w 5 ml 0.1 M buforu fosforanowego (pH 7.4).
  4. Wirować ponownie przez 10 min przy 4,000 rpm i resuspender osad w 5 ml 0.1 M buforu fosforanowego zawierającego sole E2 i 0.66% v/v glicerolu (pożywka uboga w azot).
  5. Zmierzyć mętność komórek (OD600).
  6. Przygotować alikwoty mieszaniny komórkowej o objętości 6 ml w 25 ml szklanych kolbach z zamkniętymi korkami oraz kontrolki bezkomórkowe (sole E2 + 0.66% v/v glicerolu).
  7. Do każdej kolby dodać 100 nmol alkanu.
  8. Inkubować mieszaniny w temperaturze 37 °C przez 24 hr (skrócić czas w przypadku uzyskania wyższych szybkości degradacji).
  9. Zmierzyć OD600 po inkubacji.
  10. Wyekstrahować węglowodory z pożywek hodowlanych za pomocą octanu etylu i oznaczyć stężenie węglowodorów w kulturze komórkowej za pomocą chromatografii gazowej (patrz protokół 3).
  11. Obliczyć stopień degradacji na jednostkę biomasy, dzieląc całkowitą ilość przekształconego alkanu przez całkowitą biomasę obecną w każdej kolbie (przeliczyć OD600 na suchą masę). Podzielenie wyniku przez czas trwania eksperymentu pozwala uzyskać aktywność degradacji na jednostkę biomasy na jednostkę czasu. Średnią wyznacza się z trzech niezależnych powtórzeń.

3. Analiza aktywności enzymu konwertującego alkany, in vitro

Analizę tę przeprowadzono w zasadzie zgodnie z metodą opisaną przez Li et al. (2008).

  1. Hodować komórki E. coli wykazujące ekspresję genu ladA (BBa_K398017) oraz komórki z pustym wektorem (BBa_J13002) w 50 ml pożywki LB z odpowiednimi antybiotykami przez noc.
  2. Przenieść 500 μl nocnej hodowli do 50 ml świeżej pożywki LB (z antybiotykiem) i inkubować do momentu, aż mętność komórek osiągnie gęstość optyczną 0,6 przy 600 nm.
  3. Wirować przez 10 min przy 4 000 rpm (4 °C) i resuspendować osad w 5 ml 50 mM buforu Tris.
  4. Poddać komórki sonikacji (rozbijacz komórek, LA Biosystems) przy cyklu pracy 40% i kontroli mocy wyjściowej 4; przez cały czas utrzymywać roztwór w lodzie.
  5. Wirować otrzymaną mieszaninę przez 5 min przy 4 000 rpm w temperaturze 4 °C w celu usunięcia szczątków komórkowych. Przenieść nadsącz do nowej probówki.
  6. Oznaczyć całkowite stężenie białka w ekstraktach komórkowych metodą Bradforda. Uwaga: Należy używać szklanych probówek, aby zapobiec zwiększeniu tła i/lub utracie białka.
  7. Przygotować 100 ml mieszaniny zawierającej 0,1% v/v alkanu i 50 mM bufor Tris-HCl.
  8. Ogrzać mieszaninę do 100 °C przez 5 min. Uwaga: Ten krok należy wykonać wyłącznie w przypadku alkanów średnio- i długołańcuchowych o wysokiej temperaturze wrzenia (np. C16: 287 °C).
  9. Aby uzyskać optymalną rozpuszczalność alkanu, sonikować przez 1 min, gdy mieszanina jest jeszcze ciepła, aż do uzyskania jednorodnej, lepkej zawiesiny.
  10. Dodać 1 mM NADH, 1 mM FMN, 1 mM MgSO4 oraz 0,01 v/v Triton X-100.
  11. Przygotować aliquoty o objętości 6 ml w kolbach o pojemności 25 ml z zamkniętymi korkami.
  12. Dodać odpowiednią ilość ekstraktu komórkowego (zależnie od wyników oznaczeń metodą Bradforda, końcowe stężenie 5 mg białka/l). Przygotować kontrolę bezbiałkową.
  13. Inkubować w 60 °C (dla optymalnej aktywności enzymatycznej) przez 24 h.
  14. Wyekstrahować węglowodory z pożywek hodowlanych za pomocą octanu etylu i oznaczyć stężenie węglowodorów w hodowli komórkowej metodą chromatografii gazowej (patrz protokół 3).
  15. Obliczyć stopień degradacji na jednostkę biomasy, dzieląc całkowitą ilość przekształconego alkanu przez całkowitą ilość białka dodanego do każdej kolby (na podstawie krzywej kalibracyjnej Bradforda). Dalszy podział przez czas trwania eksperymentu pozwala uzyskać aktywność degradacyjną na jednostkę białka komórkowego na jednostkę czasu. Średnią wyznacza się z trzech niezależnych serii pomiarowych.

4. Ekstrakcja węglowodorów octanem etylu i pomiary stężenia

  1. Alkany ekstrahuje się z roztworu wodnego poprzez dodanie 2,5 ml octanu etylu (rozpuszczalnika apolarnego) do 6 ml roztworu badawczego. Do rozpuszczalnika dodaje się standard wewnętrzny w stężeniu 0,1 % (v/v). Standard (np. cyklodekan) był dobierany w zależności od oczekiwanego zakresu pików analizowanych substancji.
  2. Opcjonalnie: Do mieszaniny wodnej należy dodać Triton X-100 i wirować próbki przez 10 min przy 4 000 rpm, aby uzyskać właściwy układ dwufazowy.
  3. Mieszaninę miesza się w wstrząsarku vortex przez 5 s (1 500 rpm) i inkubuje w temperaturze pokojowej do czasu rozdzielenia się dwóch faz.
  4. Należy pobrać maksymalną ilość warstwy organicznej (górnej) i osuszyć rozpuszczalnik za pomocą bezwodnego siarczanu magnezu.
  5. MgSO4 usuwa się poprzez filtrację (0,2 μm), a filtrat przenosi do fiolek do chromatografu gazowego w celu przeprowadzenia pomiarów lub przechowuje w temperaturze -20 °C.
  6. Stężenie określa się metodą chromatografii gazowej przy użyciu kolumny CP-SIL 5CB (długość = 5 m). Należy wstrzyknąć 10 μl próbki w trybie split (1:10, 230 °C). Przepływ gazu nośnego w kolumnie ustawia się na 1 ml/min (hel). Stosuje się następujący program temperatury pieca:
    SzybkośćTemperatura [°C]Czas [min]
    0507,5
    50901,0
    501102,0
    501302,0
    501452,0
    501602,0
    501702,0
    501852,0
    502102,0
    502502,0
    503202,0
  7. Należy zintegrować piki i skorygować stężenia względem standardu wewnętrznego.

5. Analiza aktywności dehydrogenazy alkoholowej/aldehydowej

Analizę tę przeprowadzono w zasadzie zgodnie z metodą opisaną przez Kato et al. (2010).

  1. Hodować komórki E. coli eksponujące gen ADH (BBa_K398018) lub ALDH (BBa_K398030) oraz komórki zawierające pusty wektor (BBa_J13002) w 50 ml pożywki LB z odpowiednimi antybiotykami przez noc.
  2. Przenieść 500 μl nocnej hodowli do 50 ml świeżej pożywki LB (z antybiotykiem) i inkubować do momentu, aż mętność komórek osiągnie gęstość optyczną 0,6 przy 600 nm.
  3. Wirować przez 10 min przy 4,000 rpm w temperaturze 4 °C, a następnie resuspender osad w 5 ml buforu Tris 50 mM.
  4. Poddać roztwór komórkowy sonikacji przy cyklu pracy 40% i sterowaniu wyjściowym 4 (podczas sonikacji utrzymywać roztwór w lodzie).
  5. Wirować otrzymaną mieszaninę przez 5 min przy 4,000 rpm w temperaturze 4 °C w celu usunięcia szczątków komórkowych.
  6. Oznaczyć całkowite stężenie białka w ekstraktach komórkowych za pomocą metody Bradforda (Uwaga: należy użyć szklanej fiolki, aby zapobiec wiązaniu białek).
  7. Napełnić płytkę 96-dołkową, wlewając do każdego dołka 180 μl buforu glicynowego 57 mM zawierającego NAD (stężenie końcowe 1 mM, pH 9,5).
  8. Do dołków dodać 5 μl badanego alkoholu (aldehydu). Uwaga: Alkohole długołańcuchowe należy podgrzać przed rozpoczęciem testu, aby uzyskać postać ciekłą. Dla każdego alkoholu (aldehydu) należy dodać kontrolę bez substratu (kontrola negatywna). Dodatkowo przygotować próbę ślepą zawierającą mieszaninę buforu i substratu bez ekstraktu komórkowego.
  9. Podgrzać płytkę czytnika płytek (Tecan Magellan v7.0) przez 15 min w 37 °C w celu wyrównania temperatury systemu.
  10. Dodać odpowiednią ilość ekstraktu komórkowego (zależnie od wyników metody Bradforda, stężenie końcowe 5 mg białka/l). Przygotować kontrolę bez białka.
  11. Pomiar produkcji NADH przeprowadzić za pomocą spektrofotometru przy długości fali 340 nm co 2-3 min przez 1 h w temperaturze 37 °C.
  12. Obliczyć szybkość produkcji NADH na podstawie nachylenia krzywej OD (340 nm). Uwzględnić długość drogi optycznej oraz współczynnik ekstynkcji NADH wynoszący 6220 M-1cm-1. Podzielić szybkość produkcji NADH przez całkowitą ilość dodanego białka, aby wyrazić aktywność reakcji dehydrogenazy w ekstrakcie komórkowym (U/mg białka całokomórkowego). Obliczyć średnią i odchylenie standardowe z trzech niezależnych serii pomiarowych.

6. Charakterystyka pCaiF

  1. Hodować przez noc w 5 ml pożywki LB z odpowiednimi antybiotykami komórki E. coli wykazujące ekspresję konstruktu pCaiF-GFP (BBa_K398331) oraz komórki zawierające sam promotor (BBa_K398326).
  2. Zaszczepić 5 ml pożywki M9 zawierającej 10 g/l glukozy i antybiotyki za pomocą 50 μl nocnej kultury i inkubować przez noc.
  3. Przeszczepić 50 μl nocnej kultury do 5 ml świeżej pożywki M9 z 10 g/l glukozy i inkubować do momentu, aż mętność komórek osiągnie gęstość optyczną 0,2 przy 600 nm.
  4. Napełnić płytkę 96-dołkową, wlewając do każdego dołka 100 μl świeżej pożywki M9 zawierającej pożądaną ilość źródła węgla do testów. W celu oceny statystycznej przeprowadzić doświadczenia w trzech powtórzeniach i dodać odpowiednie kontrole negatywne (dziki typ E. coli K12).
  5. Dodać 5 μl nocnej kultury do dołków z pożywką.
  6. Pomiar krzywej wzrostu (OD600) oraz fluorescencji GFP (pobudzenie 485 nm i emisja 520 nm) przeprowadzić za pomocą czytnika płytek co 10 min przez 18 hr w temperaturze 37 °C przy stałym wstrząsaniu.
  7. Obliczyć tempo wzrostu i specyficzną zawartość GFP na podstawie odpowiednich pomiarów i porównać z kontrolą. Obliczyć średnią oraz odchylenie standardowe dla co najmniej trzech niezależnych eksperymentów.

7. Test tolerancji

  1. Hodowlę E. coli eksponującą geny PhPFDα i β (BBa_K398406) prowadzić przez noc w 5 ml pożywki LB z odpowiednimi antybiotykami. Jako kontrolę negatywną wykorzystać E. coli eksponującą gen ladA (BBa_K398017).
  2. Przeszczepić 10 μl nocnej hodowli do świeżych 5 ml pożywki LB (z antybiotykiem) i inkubować do momentu, aż mętność komórek osiągnie gęstość optyczną od 0,3 do 0,4 przy 600 nm.
  3. Rozcieńczyć hodowle świeżą pożywką do osiągnięcia OD600 na poziomie 0,1.
  4. Do płytki 96-dołkowej nanieść w trzech powtórzeniach po 180 μl pożywki M9 zawierającej odpowiednie antybiotyki oraz właściwe stężenie końcowe związku toksycznego (np. 0, 4, 8, 10% n-heksanu). Ponieważ mieszaniny alkan-woda mogą prowadzić do powstania układów dwufazowych, niezbędne jest zastosowanie na płytce odpowiednich kontroli (np. różnych szczepów i odpowiednich prób ślepych).
  5. Do dołków dodać 20 μl hodowli (kontrolnej).
  6. Pomiar stężenia biomasy (OD600) przeprowadzać za pomocą czytnika płytek co 10 min przez 24 hr w temperaturze 37 °C przy stałym wstrząsaniu.
  7. Na podstawie uzyskanych pomiarów obliczyć szybkości wzrostu dla różnych stężeń czynnika i porównać je z kontrolą negatywną. Obliczyć średnią i odchylenie standardowe z co najmniej trzech niezależnych serii pomiarowych.

8. Mapowanie interakcji homologów

  1. Aplikacja HIM została opracowana do wykonywania zapytań o białka na serwerze PostgreSQL obsługującym bazę danych STRING (bezpłatną do użytku akademickiego) 20. Aplikacja do mapowania oddziaływań homologów identyfikuje oddziałujące białka w oryginalnym organizmie gospodarza przy użyciu bazy danych STRING. Sekwencje odpowiednich oddziałujących genów są wykorzystywane w wyszukiwaniu BLAST w celu znalezienia genów homologicznych w organizmie docelowym. Cytoscape 4 służy do wizualizacji wyniku mapowania. Narzędzie programowe HIM można pobrać ze strony: https://github.com/jcnossen/InteractionHomologMapping.
  2. Aby przeprowadzić mapowanie, (1) wprowadź identyfikator BioBrick, a aplikacja automatycznie pobierze dane sekwencji części z Registry of Standard Biological Parts 9, lub (2) wprowadź (wklej) dane sekwencji w aplikacji.
  3. Skorzystaj ze strony bazy danych STRING, aby znaleźć identyfikator białka STRING dla wprowadzonej sekwencji aminokwasowej.
  4. Białko o wysokiej homologii jest określane za pomocą BLAST. Następnie aplikacja wyświetla listę każdego znanego oddziałującego białka w organizmie źródłowym i wyszukuje homologi w organizmie gospodarza (np. E. coli).
  5. Wyeksportuj wynikową listę domniemanych oddziaływań do pliku tekstowego lub programu Cytoscape.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Konwersja alkanów

Aktywność trzech etapów utleniania alkanu do odpowiedniego kwasu tłuszczowego oceniono za pomocą testów z komórkami w stanie spoczynku oraz pomiarów aktywności enzymatycznej. Wyniki przedstawiono zgodnie z przebiegiem reakcji szlaku: (1) hydroksylazy alkanowa, (2) dehydrogenazy alkoholowej i (3) dehydrogenazy aldehydowej.
W pierwszym kroku skonstruowano różne plazmidy dla alkanów średnio- i długołańcuchowych. Plazmid

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Zasada BioBrick została wykorzystana do skonstruowania chassis służącego do degradacji alkanów, a dla pojedynczych komponentów zestawu narzędzi uzyskano dowód koncepcji. Zaproponowano kilka testów w celu pomiaru aktywności in vivo i in vitro enzymów szlaku degradacji alkanów. Przedstawiona praca z sukcesem demonstruje szereg metod, które mogą być wykorzystane do określenia aktywności enzymatycznej i ekspresji w organizmie gospodarza E. coli po implementacji odpowiednich BioBricków. Ponadto wyka...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Nie zadeklarowano żadnych konfliktów interesów.

Podziękowania

Eksperymenty przedstawione w niniejszym artykule wideo zostały opracowane na potrzeby międzynarodowego konkursu Genetically Engineered Machine 9. Autorzy chcieliby podziękować członkom zespołu iGEM: Luke'owi Bergwerffowi, Pieterowi T.M. van Boheemenowi, Jelmerowi Cnossenowi, Hugo F. Cueto Rojasowi oraz Ramonowi van der Valkowi za pomoc w badaniach. Dziękujemy Hanowi de Windzie, Stefanowi de Kokowi i Esengül Yıldırım za pomocne dyskusje i udostępnienie zaplecza badawczego. Praca ta była wspierana przez Wydział Biotechnologii Uniwersytetu TU Delft, Laboratorium Bioinformatyki w Delft, Wydział Bionan nauki TU Delft, Oil Sands Leadership Initiative (OSLI), StuD studentenuitzendbureau, Netherlands Genomics Initiative, Kluyver Centre, Nederlandse Biotechnologische Vereniging (Stichting Biotechnology Nederland), DSM, Geneart, Greiner bio-one oraz Genencor.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
E. coli K12New England BiolabsC2523H
OktanFluka74822
HeksadekanFluka52209
1-oktanolFluka95446
1-dodekanolSigma-Aldrich126799
HeksanSigma-Aldrich296090
NADHSigma-AldrichN4505
FMNSigma-AldrichF2253
MgSO4J.T. Baker Casno7487 889
Triton X-100Sigma-AldrichT8787
ligaza T4New England BiolabsM0202L
Chromatograf gazowy
Homogenizator komórekLA BiosystemsCD-019
SpektrofotometrAmersham Pharmaciaspec 2000
Czytnik płytekTecan Group Ltd.Magellan v7.0
Inkubator Innova, 44
BioBrickTM K398014: BBa_J23100-BBa_J61100-alkB2-BBa_J61100-rubA3-BBa_J61100-rubA4- BBa_J61100-rubBUniwersytet Technologiczny w Delft na wydziale Biotechnologii lub Registry of Standard Biological PartsBBa_K398014Systemy hydroksylazy alkanowej
Oporność: chlorampfenikol
BioBrickTM K398027: BBa_R0040-BBa_B0034-ladA Uniwersytet Technologiczny w Delfcie na wydziale Biotechnologii lub Rejestr Standardowych Części BiologicznychBBa_K398027Generator białka ladA
Oporność: Chloramphenicol
BioBrickTM K398018: BBa_J23100-BBa_J61101-ADH Uniwersytet Technologiczny w Delft na wydziale Biotechnologii lub Registry of Standard Biological PartsBBa_K398018generator ADH
Oporność: chloramfenikol
BioBrickTM K398030: BBa_R0040-BBa_B0034-ALDH Uniwersytet Technologiczny w Delft na wydziale Biotechnologii lub Registry of Standard Biological PartsBBa_K398030ALDH generator
Oporność: chloramfenikol
BioBrickTM K398326: pCaiF Uniwersytet Technologiczny w Delft na wydziale Biotechnologii lub Rejestr Standardowych Części BiologicznychBBa_K398326promotor pCaiF
Oporność: chloramphenikol
BioBrickTM K398331: pCaiF-BBa_B0032-BBa_I13401Uniwersytet Technologiczny w Delft na wydziale Biotechnologii lub Registry of Standard Biological PartsBBa_K398331urządzenie do pomiaru pCaiF
Oporność: chloramfenikol
BioBrickTM K398406: BBa_J23002-BBa_J61107-phPFDα-BBa_J61107- Uniwersytet Technologiczny w Delft na wydziale Biotechnologii lub Registry of Standard Biological PartsBBa_K398406Klastry tolerancji na rozpuszczalniki
Oporność: chloramfenikol

Bibliografia

  1. Allen, E. W. Process water treatment in Canada's oil sands industry: I: Target pollutants and treatment objectives. J. Environ. Eng. Sci. 7, 123-138 (2008).
  2. Alon, U. An Introduction to Systems Biology: Design Principles of Biological Circuits. , CRC Press. (2007).
  3. Center, O. P. Understanding Oil Spills and Oil Spill Response. , (1999).
  4. Cytoscape. An Open Source Platform for Complex Network Analysis and Visualization [Internet]. , Available from: http://www.cytoscape.org (2012).
  5. Non-Invasive Biomass Monitor with Wide Linear Range [Internet]. , Available from: http://www.buglab.com/docs/OnLineODMeasurement.pdf (2012).
  6. Eichler, K., Buchet, A., Lemke, R., Kleber, H. P., Mandrand-Berthelot, M. A. Identification and characterization of the caiF gene encoding a potential transcriptional activator of carnitine metabolism in Escherichia coli. J. Bacteriol. 178, 1248-1257 (1995).
  7. Feng, L., Wang, W., Cheng, J., Ren, Y., Zhao, G., Gao, C., Tang, Y., Liu, X., Han, W., Peng, X., et al. Genome and proteome of long-chain alkane degrading Geobacillus thermodenitrificans NG80-2 isolated from a deep-subsurface oil reservoir. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104 (13), 5602-5607 (2007).
  8. Fujii, T., Narikawa, T., Takeda, K., Kato, J. Biotransformation of various alkanes using the Escherichia coli expressing an alkane hydroxylase system from Gordonia sp. TF6. Biosci. Biotechnol. Biochem. 68 (10), 2171-2177 (2004).
  9. iGEM. Registry of Standard Biological Parts [Internet]. , Available from: http://partsregistry.org/Main_Page (2012).
  10. Kato, T., Miyanaga, A., Haruki, M., Imanaka, T., Morikawa, M., Gene Kanaya, S. cloning of an alcohol dehydrogenase from thermophilic alkane-degrading Bacillus thermoleovorans B23. J. Biosci. Bioeng. 91 (1), 100-102 (2001).
  11. Kato, T., Miyanaga, A., Kanaya, S., Morikawa, M. Gene cloning and characterization of an aldehyde dehydrogenase from long-chain alkane-degrading Geobacillus thermoleovorans B23. Extremophiles. 14, 33-39 (2010).
  12. Kieboom, J., De Bont, J. aM. Bacterial Stress Responses. , ASM Press. Washington, D.C. (2000).
  13. Kotte, O., Zaugg, J. B., Heinemann, M. Bacterial adaptation through distributed sensing of metabolic fluxes. Mol Syst Biol. 6, 355(2010).
  14. Kremling, A., Bettenbrock, K., Gilles, E. D. Analysis of global control of Escherichia coli carbohydrate uptake. BMC Syst. Biol. 1, (2007).
  15. Li, L., Liu, X., Yang, W., Xu, F., Wang, W., Feng, L., Bartlam, M., Wang, L., Rao, Z. Crystal structure of long-chain alkane monooxygenase (LadA) in complex with coenzyme FMN: unveiling the long-chain alkane hydroxylase. J. Mol. Biol. 376 (2), 453-465 (2008).
  16. Lin, H. Y., Mathiszik, B., Xu, B., Enfors, S. O., Neubauer, P. Determination of the maximum specific uptake capacities for glucose and oxygen in glucose-limited fed-batch cultivations of Escherichia coli. Biotechnol. Bioeng. 73 (5), 347-357 (2001).
  17. Okochi, M., Kanie, K., Kurimoto, M., Yohda, M., Honda, H. Overexpression of prefoldin from the hyperthermophilic archaeum Pyrococcus horikoshii OT3 endowed Escherichia coli with organic solvent tolerance. Appl. Microbiol. Biotechnol. 79 (3), 443-449 (2008).
  18. Rehm, H. J., Reiff, I. Mechanisms and occurrence of microbial oxidation of long-chain alkanes. Adv. Biochem. Eng. / Biotechnol. 19, 175-215 (1981).
  19. Rojo, F. Degradation of alkanes by bacteria. Environ. Microbiol. 11 (10), 2477-2490 (2009).
  20. STRING 9.0 Known and Predicted Protein-Protein Interactions [Internet]. , Available from: http://string-db.org/newstring_cgi/show_download_page.pl (2012).
  21. Van Beilen, J. B., Panke, S., Lucchini, S., Franchini, A. G., Rothlisberger, M., Witholt, B. Analysis of Pseudomonas putida alkane-degradation gene clusters and flanking insertion sequences: evolution and regulation of the alk genes. Microbiology. 147, 1621-1630 (2001).
  22. Wang, L., Tang, Y., Wang, S., Liu, R. L., Liu, M. Z., Zhang, Y., Liang, F. L., Feng, L. Isolation and characterization of a novel thermophilic Bacillus strain degrading long-chain n-alkanes. Extremophiles. 10 (4), 347-356 (2006).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Degradacja alkan wEscherichia colisystem BioBricksregulacja ekspresji gen wtolerancja na rozpuszczalnikitesty z kom rkami spoczynkowymipromotor regulowany przez substrattolerancja na w glowodorybiologia syntetyczna
Zestaw narzędzi umożliwiających konwersję węglowodorów w środowiskach wodnych
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.