Profilowanie zmian w fosforylacji receptorowej kinazy tyrozynowej za pomocą macierzy przeciwciał - REKLAMA

Podsumowanie

Matryce przeciwciał Proteome Profiler są wygodnym i opłacalnym sposobem na badanie zmian w fosforylacji receptorowej kinazy tyrozynowej (RTK) bez przeprowadzania licznych testów immunoprecypitacji (IP). Matryca ARY001 Human RTK pozwala na jakościowy pomiar wielu RTK w jednej próbce za pomocą detekcji chemiluminescencyjnej.

Streszczenie

Dysregulacja ekspresji receptorowej kinazy tyrozynowej (RTK) i fosforylacji jest często związana z rozwojem i przerzutowym rozprzestrzenianiem się komórek rakowych. ^1-3 Znaczne wysiłki skoncentrowano na opracowaniu inhibitorów ukierunkowanych na określone RTK i przerywających nieprawidłowe szlaki sygnałowe związane ze stanami chorobowymi. ^4-7 Celem tego badania było zmierzenie wpływu wybranej liczby inhibitorów na fosforylację RTK. W badaniu tym wykorzystano ludzką matrycę Phospho-RTK, która jest testem immunologicznym typu sandwich opartym na błonie do monitorowania wzrostu lub spadku fosforylacji dla wielu RTK jednocześnie w jednej próbce. W tym teście zarówno ufosforylowane, jak i nieufosforylowane RTK obecne w próbce lizatu są wychwytywane przez dyskretne przeciwciała wydrukowane w dwóch egzemplarzach na membranie nitrocelulozowej wielkości szkiełka mikroskopowego. Po umyciu matryce są inkubowane z peroksydazą anty-fosfo-tyrozynowo-chrzanową (HRP), która składa się z ufosforylowanych RTK wychwyconych na tablicy. Po drugim etapie płukania matryce są inkubowane z odczynnikami chemiluminescencyjnymi. Sygnał generowany w każdym miejscu macierzy jest proporcjonalny do ilości fosfobiałka związanego przez każde przeciwciało wychwytujące. W tych eksperymentach macierze wykorzystano do pomiaru wzrostu fosforylacji po stymulacji ligandem komórek raka piersi MDA-MB-453 lub raka żołądka KATO III, a także do scharakteryzowania spadków fosforylacji związanych z leczeniem komórek inhibitorami selektywnymi w stosunku do członków rodziny ErbB lub FGF R.

Protokół

1. Przygotowanie próbki

1. Zbieraj lizaty z komórek niepoddanych działaniu ligandów lub komórek traktowanych inhibitorem i ligandem, postępując zgodnie z wytycznymi zawartymi w arkuszu danych Human Phospho-RTK array. Bufor do lizy został zoptymalizowany dla tego zestawu. Zastąpienie innych do lizy może mieć wpływ na końcową wydajność macierzy. Aby zapobiec degradacji próbki proteolitycznej, dodaj 10 μg/ml aprotyniny, 10 μg/ml leupeptyny i 10 μg/ml pepstatyny A do objętości buforu do lizy wymaganej dla każdego preparatu lizatu komórkowego świeżego dla każdego użycia.
2. Stężenie lizatu należy mierzyć za pomocą testu kwasu bicinchoninowego (BCA). Stężenie próbki można empirycznie dostosować w celu uzyskania optymalnej czułości i niskiego tła. Jako punkt wyjścia zalecany jest zakres 100-300 μg lizatu.
3. Należy unikać cykli zamrażania/rozmrażania próbek, a dla optymalnej wydajności wymagane jest odpowiednie przechowywanie lizatów. Rozmrozić zamrożone próbki lizatu na lodzie.

2. Test tablicowy

1. Przed użyciem doprowadź wszystkie elementy zestawu do temperatury pokojowej. Aby uniknąć zanieczyszczenia, podczas wykonywania zabiegów należy nosić rękawice.
2. Odpipetować 2,0 ml buforu matrycowego 1 do każdej studzienki 4-dołkowej płytki wieloczaszkowej, która ma być użyta. Bufor tablicowy 1 służy jako bufor blokowy.
3. Za pomocą pęsety z płaską końcówką usuń każdą membranę, która ma być użyta, spomiędzy arkuszy ochronnych i umieść w dołku 4-dołkowego naczynia wielofunkcyjnego. Numer tablicy powinien być skierowany do góry.
4. W kontakcie z Array Buffer 1 niebieski barwnik z plamek zniknie, ale wychwytujące przeciwciała zostaną zachowane w określonych lokalizacjach.
5. Inkubuj przez 1 godzinę na bujanej platformie. Ustaw tacę tak, aby każda tablica kołysała się od końca do końca w swoim dołku. Powierzchnia tablicy powinna być całkowicie zwilżona i pokryta buforem blokowym.
6. Podczas blokowania błon rozcieńczyć żądaną ilość lizatu komórkowego do końcowej objętości 1,5 ml za pomocą Array Buffer 1.
7. Odessać bufor macierzy 1 z dołków 4-dołkowego wielodołkowego talerza i dodać rozcieńczone roztwory lizatu. Umieść pokrywkę na 4-dołkowym naczyniu wielofunkcyjnym.
8. Inkubować przez noc w temperaturze 2-8 °C na platformie bujanej. Można zastosować krótszy czas inkubacji, jeżeli nie jest wymagana optymalna czułość.
9. Ostrożnie usuń każdą membranę z 4-dołkowego naczynia wielomiskowego i umieść w indywidualnych plastikowych pojemnikach z 20 ml 1X Wash Buffer. 4-Well Multi-dish nie może być używany do wykonywania etapów mycia. Opłucz 4-dołkowe naczynie wielofunkcyjne wodą dejonizowaną lub destylowaną i dokładnie wysusz.
10. Umyj każdą membranę 1X Wash Buffer przez 10 minut na wytrząsarce z platformą kołyszącą. Powtórz dwa razy, w sumie 3 prania.
11. Rozcieńczyć bufor detekcyjny anty-fosfo-tyrozyny i peroksydazy chrzanowej (HRP) w 1X Array Buffer 2, używając współczynnika rozcieńczenia na etykiecie fiolki. Odpipetować pipetą 2,0 ml rozcieńczonego roztworu do każdego dołka 4-dołkowego wielodołkowego.
12. Ostrożnie wyjmij każdą membranę z pojemnika do mycia. Pozwolić, aby nadmiar buforu spłynął z membrany i zwrócić membranę do 4-dołkowego naczynia wielodołkowego zawierającego rozcieńczoną anty-fosfo-tyrozynę-HRP. Przykryj studzienki pokrywką.
13. Inkubuj przez 2 godziny w temperaturze pokojowej na bujanej platformie.
14. Umyj każdą tablicę zgodnie z wcześniejszym opisem.
15. Pozostałe kroki wykonaj bez przerwy. Ostrożnie wyjmij każdą membranę z pojemnika do mycia. Poczekaj, aż nadmiar buforu spłynie z membrany, osuszając dolną krawędź na papierze chłonnym. Umieść każdą membranę na plastikowym ochraniaczu z numerem identyfikacyjnym skierowanym do góry.
16. Odpipetować 1 ml przygotowanego odczynnika Chemi Wymieszać równomiernie z każdą membraną. Użycie mniej niż 1 ml Chemi Reagent Mix na membranę może spowodować niepełne pokrycie membrany. Zastąpienie niektórych odczynników chemiluminescencyjnych o wysokiej intensywności odczynnikami Chemi 1 i 2 może spowodować zwiększenie tła lub zmniejszenie sygnału w zależności od odczynnika.
17. Ostrożnie przykryj plastikową osłoną arkusza. Delikatnie wygładź wszelkie pęcherzyki powietrza i upewnij się, że Chemi Reagent Mix jest równomiernie rozprowadzony we wszystkich rogach każdej membrany. Inkubować przez 1 minutę.
18. Umieść ręczniki papierowe na górze i po bokach plastikowej osłony arkusza zawierającej membrany i ostrożnie wyciśnij nadmiar Chemi Reagent Mix.
19. Zdejmij górną plastikową osłonę arkusza i ostrożnie połóż chłonną chusteczkę laboratoryjną na membranach, aby usunąć pozostałą mieszankę odczynników chemicznych.
20. Pozostawiając membrany na dolnej osłonie plastikowego arkusza, przykryj membrany folią, uważając, aby delikatnie wygładzić wszelkie pęcherzyki powietrza. Owiń nadmiar folii wokół tylnej części ochraniacza prześcieradła, tak aby membrany i ochraniacz arkusza były całkowicie owinięte.
21. Umieść membrany numerami identyfikacyjnymi skierowanymi do góry w kasecie z filmem autoradiograficznym, która nie jest używana do wykrywania izotopów promieniotwórczych.
22. Wystaw na działanie filmu Kodak BioMax Light przez 1-10 minut. Zalecana jest wielokrotna ekspozycja. Alternatywnie obrazy można zbierać za pomocą imagera kompatybilnego z chemiluminescencją, takiego jak Carestream Health Image Station 4000MM PRO.

3. Analiza danych

1. Sygnały dodatnie widoczne na wywołanej kliszy można szybko zidentyfikować, umieszczając przezroczystą nakładkę na obrazie matrycy i wyrównując ją z parami punktów odniesienia wydrukowanych w tym celu w rogach. Ostemplowany numer identyfikacyjny na tablicy powinien być umieszczony po lewej stronie. Lokalizacja kontroli i wychwytywania przeciwciał jest wymieniona w załączniku do arkusza danych ludzkiej macierzy fosfo-RTK.
2. Gęstości pikseli na wywołanej kliszy można zebrać za pomocą skanera w trybie transmisji, takiego jak Epson Perfection V750 PRO.
3. Utwórz szablon do analizy gęstości pikseli w każdym miejscu matrycy za pomocą odpowiedniego oprogramowania do analizy obrazowania. Kompatybilne programy obejmują oprogramowanie ImageQuant lub ArrayVision firmy GE, oprogramowanie Western Vision z szablonami specyficznymi dla Proteome Profiler Arrays, BioRad Quantity One, Adobe Photoshop, NIH ImageJ i Protein Simple AlphaView.
4. Eksportuj wartości sygnału do pliku arkusza kalkulacyjnego w celu manipulowania w programie, takim jak Microsoft Excel.
5. Określ średni sygnał (gęstość pikseli) pary zduplikowanych plamek reprezentujących każdy RTK.
6. Odejmij uśredniony sygnał tła od każdego miejsca. Jako wartość tła należy użyć sygnału z czystego obszaru tablicy lub punktów kontroli ujemnej.
7. Porównaj odpowiednie sygnały na różnych tablicach, aby określić względną zmianę poziomów fosforylacji RTK między próbkami.

4. Reprezentatywne wyniki

Ten protokół pokazuje, jak można wykorzystać ludzką matrycę Phospho-RTK do badania wpływu stymulacji ligandów i inhibitorów na fosforylację RTK. Na rycinie 1 przedstawiono dane dotyczące komórek MDA-MB-453, które nie były leczone, traktowane 100 ng / ml rhNRG-β1 / HRG-β1 (HRG-β1) przez 5 minut lub wstępnie leczone znanymi inhibitorami z rodziny ErbB^8-11 przed leczeniem HRGβ1. W eksperymentach z inhibitorami komórki inkubowano z 1 μM HDS 029, 200 nM PD 153035 lub 200 nM PD 158780 w SFM przez trzy godziny. Każdą matrycę inkubowano ze 100 μg lizatu. Wzrost fosforylacji obserwuje się w przypadku plam wychwytywania ErbB2, ErbB3 i ErbB4 podczas porównywania komórek nietraktowanych z komórkami MDA-MB-453 traktowanymi HRG-β1. Traktowanie komórek wszystkimi trzema selektywnymi inhibitorami z rodziny ErbB przed inkubacją HRG-β1 spowodowało zmniejszenie fosforylacji ErbB2, ErbB3 i ErbB4.

Na rysunku 2 pokazane są dane dla komórek Kato III, o których wiadomo, że mają nadekspresję RTK FGF R2. W tym zestawie eksperymentów komórki Kato III nie były leczone, traktowane 100 ng / ml rhFGF kwaśnym (FGF) i 1 μg / ml heparyny lub wstępnie traktowane selektywnymi inhibitorami FGF R^12-15 przed leczeniem FGF i heparyną. Inhibitory PD173074, PD 161570 i PD 166285 stosowano w stężeniu 1 μM i inkubowano z komórkami Kato III przez 3 godziny w pożywce wolnej od surowicy. Podczas gdy w nieleczonych komórkach KATO III występuje konstytutywna fosforylacja zarówno EGF R, jak i FGF R2, po leczeniu FGF zaobserwowano wzrost fosforylacji FGF R2. Inkubacja komórek z PD 173074, PD 161570 lub PD 166285 spowodowała zmniejszenie fosforylacji FGF R2 i EGF R. Chociaż wiadomo, że inhibitory te wpływają na fosforylację członków rodziny FGF R, wyniki te pokazują przydatność ludzkiej matrycy Phospho-RTK do monitorowania wpływu, jaki określone stężenie inhibitora może mieć na inne RTK, takie jak w tym przypadku EGF R.

Rysunek 1. Indukcja i hamowanie fosforylacji receptorowej kinazy tyrozynowej w komórkach raka piersi. Pokazane są obrazy macierzy z macierzy Proteome Profiler Human Phospho-RTK i odpowiadające im profile histogramu. Komórki MDA-MB-453 nie były leczone lub leczone inhibitorami RTK, a następnie leczone NRG-β1 / HRG-β1. Macierz wykorzystano do monitorowania wpływu inhibitorów na fosforylację kinazy w komórkach MDA-MB-453. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą postać.

Rysunek 2. Indukcja i hamowanie fosforylacji receptorowej kinazy tyrozynowej w komórkach raka żołądka. Pokazane są obrazy macierzy z macierzy Proteome Profiler Human Phospho-RTK i odpowiadające im profile histogramu. Komórki Kato III nie były leczone lub leczone inhibitorami RTK, a następnie leczono kwasem FGF i heparyną. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą postać.

Referencje

1. Henriksson, ML, Edin, S., Dahlin, AM, Oldenborg, PA, Oberg, A., Van Guelpen, B., Rutegard, J., Stenling, R., & Palmqvist, R. Komórki raka jelita grubego aktywują sąsiednie fibroblasty, powodując sygnalizację FGF1 / FGFR3 i zwiększoną inwazję. Am. J. Pathol. 178, 1387-1394 (2011).
2. Morishita, A., Gong, J., Nomura, T., Yoshida, H., Izuishi, K., Suzuki, Y., Kushida, Y., Haba, R., D'Armiento, J., & Masaki, T. Zastosowanie macierzy białkowej do identyfikacji docelowych receptorowych kinaz tyrozynowych w leczeniu ludzkiego raka jelita grubego. Int. J. Oncol. 37, 829-835 (2010).
3. Agaram, N.P., Laquaglia, M.P., Ustun, B., Guo, T., Wong, G.C., Socci, N.D., Maki, R.G., DeMatteo, R.P., Besmer, P., & Antonescu, C. R. Charakterystyka molekularna guzów podścieliskowych przewodu pokarmowego u dzieci. Clin. Rak Res. 14, 3204-3215 (2008).
4. Stommel, J.M., Kimmelman, A.C., Ying, H., Nabioullin, R., Ponugoti, A.H., Wiedemeyer, R., Stegh, A.H., Bradner, J.E., Ligon, K.L., Brennan, C., Chin, L., & DePinho, R.A. Koaktywacja receptorowych kinaz tyrozynowych wpływa na odpowiedź komórek nowotworowych na terapie celowane. Nauka. 318, 287-290 (2007).
5. Agarwal, S., Zerillo, C., Kolmakova, J., Christensen, J.G., Harris, L.N., Rimm, D.L., DiGiovanna, M.P., & Stern, D.F. Związek konstytutywnie aktywowanego receptora czynnika wzrostu hepatocytów (Met) z opornością na podwójny inhibitor EGFR / Her2 w komórkach niedrobnokomórkowego raka płuc. Br. J. Rak. 100, 941-949 (2009).
6. Dewaele, B.M., Floris, G., Finalet-Ferreiro, J., Fletcher, C.D., Coindre, J.M., Guillou, L., Hogendoorn, P.C., Wozniak, A., Vanspauwen, V., Schoffski, P., Marynen, P., Vandenbergh, P., Sciot, R., & Debiec-Rychter, M. Koaktywowane PDGFRA i EGFR są potencjalnymi celami terapeutycznymi w mięsaku błony wewnętrznej. Rak Res. 70, 7304-7314 (2010).
7. Yoon, Y.K., Kim, H.P., Han, S.W., Hur, H.S., Oh, D.Y., Im, S.A., Bang, Y.J., & Kim, T.Y. Połączenie EGFR i inhibitora MEK1/2 wykazuje synergistyczne działanie poprzez hamowanie zależnej od EGFR / HER3 aktywacji AKT w ludzkich komórkach raka żołądka. Mol. Rak Ther. 8, 2526-2536 (2009).
8. Fry, DW, Nelson, JM, Slintak, V., Keller, PR, Rewcastle, GW, Denny, WA, Zhou, H., & Bridges, AJ Biochemiczne i antyproliferacyjne właściwości 4-[Ar(alk)ylamino]pirydopirymidyn, nowej klasy chemicznej silnego i specyficznego inhibitora kinazy tyrozynowej receptora naskórkowego czynnika wzrostu. Biochemia. Pharmacol. 54, 877-887 (1997).
9. Bos, M., Mendelsohn, J., Kim, Y.M., Albanell, J., Fry, DW, & Baselga, J. PD153035, inhibitor kinazy tyrozynowej, zapobiega aktywacji receptora naskórkowego czynnika wzrostu i hamuje wzrost komórek rakowych w sposób zależny od liczby receptorów. Clin. Rak Res. 3, 2099-2106 (1997).
10. Stoll, S.W., Kansra, S., Peshick, S., Fry, DW, Leopold, WR, Wiesen, JF, Sibilia, M., Zhang, T., Werb, Z., Derynck, R., Wagner, E.F., & Elder, J.T. Zróżnicowane wykorzystanie i lokalizacja kinaz tyrozynowych receptora ErbB w skórze w porównaniu do normalnych i złośliwych keratynocytów. Nowotwor. 3, 339-350 (2001).
11. Klutchko, S.R., Zhou, H., Winters, R.T., Tran, T.P., Bridges, A.J., Althau, I.W., Amato, D.M., Elliott, W.L., Meade, M.A., Roberts, B.J., Fry, D.W., Gonzales, A.J., Harvey, P.J., Nelson, J.M., Sherwood, V., Han, H.K., Pace, G., Smaill, J.B., Denny, W.A., & Showalter, H.D. Inhibitory kinazy tyrozyny. 19. 6-alknyamidy 4-anilinochinazoliny i 4-anilinopirydo[3,4-d]pirymidyny jako nieodwracalne inhibitory receptorów kinazy tyrozynowej z rodziny ErbB. J. Med. Chem. 49, 1475-1485 (2006).
12. Kunii, K., Davis, L., Gorenstein, J., Hatch, H., Yashiro, M., Di Bacco, A., Elbi, C., & Lutterbach, B. Linie komórkowe raka żołądka z amplifikacją FGFR2 wymagają sygnalizacji FGFR2 i Erbb3 dla wzrostu i przeżycia. Rak Res.68, 2340-2348 (2008).
13. Zhou, W., Hur, W. McDermott, U., Dutt, A., Xian, W., Ficarro, S.B., Zhang, J., Sharma, S.V., Brugge, J., Meyerson, M., Settleman, J. & Gray, N.S. Podejście oparte na strukturze do tworzenia kowalencyjnych inhibitorów FGFR. Chem. Biol. 17, 285-295 (2010).
14. Batley, B.L., Doherty, AM, Hamby, J.M., Lu, GH, Keller, P., Dahring, T.K., Hwang, O., Crickard, K., & Panek R.L. Hamowanie aktywności kinazy tyrozynowej receptora FGF-1 przez PD 161570, nowy inhibitor kinazy białkowo-tyrozynowej. Życie Sci. 62, 143-150 (1998).
15. Panek, R.L, Lu G.H., Klutchko, S.R., Batley, B.L., Darhing, T.K., Hamby, J.M., Hallak, H., Doherty, AM, & Keiser, J.A. Farmakologiczna charakterystyka in vitro PD 166285, nowego nanomolowego silnego i szeroko aktywnego inhibitora białkowej kinazy tyrozynowej. J. Pharmacol. Exp. Ther. 283, 1433-1444 (1997).

Dyskusja

Human Phospho-RTK jest ekonomiczną i szybką alternatywą dla tradycyjnych metod, takich jak immunoprecypitacja (IP) Western do badań przesiewowych zmian w fosforylacji RTK. Stosując tę metodę, względne poziomy 42 fosfo-RTK badano jednocześnie przy użyciu pojedynczej próbki lizatu komórkowego MDA-MB-453 lub Kato III. Ponadto ten test macierzowy wymagał 2,5 godziny czasu praktycznego, co sprawia, że ta metoda jest znacznie bardziej efektywna czasowo niż wykonywanie wielu IP-westernów. Dzięki zastosowaniu metody detekcji chemiluminescencyjnej nie był wymagany żaden specjalistyczny sprzęt poza tym, który jest zwykle używany do zbierania danych zachodnich. Matryce są czułe i mogą być używane do porównywania zmian w fosforylacji spowodowanych zarówno traktowaniem ligandem, jak i inhibitorem. Metoda ta pozwala również na ocenę selektywności inhibitorów w stosunku do RTK niebędących celem. Dodatnie trafienia mogą być dalej oceniane za pomocą testu ilościowego, takiego jak ELISA.

Aby skutecznie wykorzystać macierze do badań przesiewowych pod kątem zmian w fosforylacji, należy postępować zgodnie z kilkoma kluczowymi wytycznymi eksperymentalnymi. Po pierwsze, eksperymenty powinny obejmować odpowiednie próbki kontrolne. Na przykład w tych eksperymentach mierzono wpływ inhibitorów na lizaty MDA-MB-453 lub Kato III na próbkach lizatu przygotowanych tego samego dnia. Tylko dane z matrycy, które są zbierane w tym samym eksperymencie, powinny być analizowane w celu zminimalizowania zmian w sygnale spowodowanych różnicami w obchodzeniu się z próbką, czasie inkubacji, technice pipetowania lub technice mycia. Porównywanie intensywności sygnału między dwoma analitami na tej samej membranie nie jest zalecane, ponieważ przeciwciała wychwytujące nie zostały wybrane tak, aby miały równoległe powinowactwo.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Zestaw do pomiaru ludzkiego fosfo-RTK	R& D Sytems	ARY001
Aprotynina	Sigma	A6279
Leupeptin	Tocris	1167
Pepstatyna A	Tocris	1190
			MDA-MB-453
Kato IIIRekombinowany ludzki NRG1-beta 1/HRG1-beta 1 Domena EGF	R& D Systems	396-HB-050
Rekombinowany ludzki FGF kwaśny (aa 16-155)	R& D Systems	232-FA-025
Heparin	Sigma	H4784
HDS 029	Tocris	2646
PD 153035	Tocris	1037
PD 158780	Tocris	2615
PD 173074	Tocris	3044
PD 161570	Tocris	3724
PD 166285	Test BCA Tocris	3785
	Pierce	23225
Sól fizjologiczna z buforem fosforanowym (PBS)
Pipety i końcówki
Rękawiczki
Woda
Pęseta z płaską końcówką Platforma
bujana Wytrząsarka
Mikrowirówka
Pojemniki plastikowe o pojemności 50 ml			Do mycia matryc
Plastikowa przezroczysta osłona
Folia
Chłonne chusteczki laboratoryjne
Ręczniki			papierowe
Kaseta
Wywoływacz
Kodak BioMax Light Film	Carestream Health	178 8207
Wywoływacz
Image Station 4000MM PRO	Carestream Health		Imager chemiluminescencyjny kompatybilny z kolekcją danych zachodnich może być używany zamiast filmu i filmu wywoływacz.
Skaner Epson Perfection Epson		V750 PRO	Skaner płaski z adapterem przezroczystości z możliwością trybu transmisji
Oprogramowanie do analizy obrazu	GE, WesternVision, BioRad, Adobe, NIH, Protein Simple itp		ImageQuant, ArrayVision, Western Vision, Quantity One, Photoshop, ImageJ, AlphaView lub inny kompatybilny program
Microsoft Excel
Komputer z możliwością uruchomienia oprogramowania do analizy obrazu i programu Microsoft Excel.

Komórki Komórki do pipetdejonizowana lub destylowanaarkuszaautoradiografiifilmówfilmowy