Sekwencyjna izolacja kwasów nukleinowych i białek bez użycia energii elektrycznej

Podsumowanie

Opisano narzędzie oraz odczynniki do sekwencyjnej izolacji kwasów nukleinowych, a następnie białek z próbki, bez konieczności użycia energii elektrycznej. Narzędzie składa się z sorbentu umieszczonego w pipecie transferowej, natomiast odczynniki do izolacji opierają się na zasadach ekstrakcji do fazy stałej. Izolowane makrocząsteczki mogą być analizowane za pomocą testów immunologicznych oraz PCR.

Streszczenie

Patogeny tradycyjne i wyłaniające się, takie jak enterohemoragiczna Escherichia coli (EHEC), Yersinia pestis czy choroby prionowe, stanowią istotny problem dla rządów, przemysłu i personelu medycznego na całym świecie. Na przykład EHEC, wraz z Shigella, odpowiadają za śmierć około 325 000 dzieci każdego roku i są szczególnie rozpowszechnione w krajach rozwijających się, gdzie identyfikacja laboratoryjna, powszechna w Stanach Zjednoczonych, jest niedostępna ¹. Opracowanie i rozpowszechnienie niskokosztowych, terenowych narzędzi do diagnostyki w punkcie opieki (point-of-care), wspomagających szybką identyfikację i/lub diagnozę patogenów lub markerów chorób, mogłoby drastycznie zmienić przebieg choroby i rokowania pacjentów. Opracowaliśmy narzędzie do izolacji kwasów nukleinowych i białek z próbki metodą ekstrakcji do fazy stałej (SPE) bez użycia energii elektrycznej i towarzyszącego wyposażenia laboratoryjnego ². Izolowane makrocząsteczki mogą być wykorzystane do diagnostyki zarówno w laboratorium, jak i przy użyciu terenowych platform diagnostycznych w punkcie opieki. Co ważne, metoda ta umożliwia bezpośrednie porównanie danych dotyczących kwasów nukleinowych i białek z niepodzielonej próbki, zapewniając wiarygodność dzięki potwierdzeniu analizy genomowej i proteomicznej.

Nasze narzędzie do izolacji wykorzystuje standard przemysłowy w zakresie izolacji kwasów nukleinowych w fazie stałej, technologię BOOM, która izoluje kwasy nukleinowe z roztworu soli chaotropowych, zazwyczaj izotiocyjanianu guanidyny, poprzez wiązanie z cząstkami lub filtrami na bazie krzemionki ³. Autorska chemia ekstrakcji w fazie stałej opracowana przez CUBRC jest stosowana do oczyszczania białek z roztworów soli chaotropowych, w tym przypadku z odpadów lub frakcji przepływowej powstałej po izolacji kwasów nukleinowych⁴.

Poprzez zamknięcie dobrze scharakteryzowanych procesów chemicznych w małej, niedrogiej i prostej platformie, stworzyliśmy przenośny system do ekstrakcji kwasów nukleinowych i białek, który może być wykorzystywany w różnych warunkach. Wyizolowane kwasy nukleinowe są stabilne i mogą być transportowane do miejsca z dostępem do zasilania w celu przeprowadzenia amplifikacji PCR, natomiast zawartość białek może zostać natychmiast poddana analizie za pomocą przenośnych lub innych testów immunologicznych. Szybka identyfikacja markerów choroby w terenie mogłaby znacząco wpłynąć na rokowania pacjenta poprzez wdrożenie właściwego leczenia na wcześniejszym etapie postępu choroby. Opisane narzędzie i metoda nadają się do zastosowania w przypadku niemal każdego czynnika zakaźnego i oferują użytkownikowi możliwość redundantnej analizy wielu typów makrocząsteczek, przy jednoczesnym zmniejszeniu obciążeń logistycznych.

Protokół

1. Lizacja próbek

1. Próbki powinny być w formie ciekłej. Jeśli próbka jest stała, na przykład żywność lub kał, należy ją zawiesić w medium ciekłym, takim jak woda lub bufor fosforanowy (PBS).
2. W probówce o pojemności 1,5 mL wymieszaj 500 μL próbki z 500 μL 6M tiocyjanianu guanidyny (pH 6,5).
3. Uciśnij gruszkę pipety ekstrakcyjnej, aby wypchnąć z niej powietrze z otoczenia.
4. Powoli zwolnij ucisk gruszki, aby wciągnąć całą 1 mL próbki do pipety ekstrakcyjnej, przepuszczając ją przez materiał sorbentny.
5. Odwróć narzędzie ekstrakcyjne tak, aby kuleczki sorbentu i próbka spłynęły do gruszki.
6. Rozkrusz kuleczki sorbentu wraz z próbką w gruszce, uważając, aby nie wypchnąć próbki z pipety ekstrakcyjnej.

2. Ekstrakcja kwasów nukleinowych (Rysunek 1, Panel A)

1. Odwrócić pipetę ekstrakcyjną (otworem do dołu) i przelać próbkę z powrotem do oryginalnej probówki 1,5 mL.
2. Naciągnąć całą 1 mL próbki do pipety ekstrakcyjnej, przepuszczając ją przez sorbent z umiarkowaną prędkością, dbając o to, aby sorbent pozostał w szyjce pipety ekstrakcyjnej.
3. Wypchnąć całą próbkę do probówki 1,5 mL poprzez naciśnięcie gruszki.
4. Powtórzyć kroki 2.2 i 2.3, przepuszczając próbkę przez sorbent jeszcze cztery razy, tak aby łącznie wykonać 5 przejść.
5. Po piątym przejściu przez sorbent, przenieść całą 1 mL próbki do 4 mL buforu do ekstrakcji białek (w stożkowatej probówce 15 mL), zamknąć probówkę i odstawić do późniejszego użycia.
6. Przemyć wyizolowane kwasy nukleinowe, przepuszczając 1 mL 95% etanolu przez sorbent trzy razy, zwracając etanol do oryginalnej probówki po ostatnim przejściu.
7. Powtórzyć krok 2.6, używając drugiej porcji 1 mL 95% etanolu do płukania.
8. Przyciskać i zwalniać gruszkę przez 5 minut, przepuszczając powietrze otoczenia przez pipetę ekstrakcyjną w celu osuszenia kwasów nukleinowych/łoża sorbentu. Przetrzeć pozostały etanol z końcówki pipety ekstrakcyjnej za pomocą chusteczki Kimwipe.
9. Odzyskać kwasy nukleinowe, przepuszczając 250 μL 10 mM Tris (pH 6.8) przez sorbent pięć razy. Bufor Tris można zastąpić dowolnym innym odpowiednim roztworem wodnym, takim jak PBS. Otrzymany roztwór zawiera wyekstrahowane kwasy nukleinowe.

3. Ekstrakcja białek (Rysunek 1, Panel B)

1. Wymieszać przez odwracanie próbkę z buforem do ekstrakcji białek w probówce z kroku 2.5, a następnie przepuścić około dwa do trzech mililitrów tej 5 mL próbki przez sorbent nowej pipety ekstrakcyjnej.
2. Wytłoczyć całą próbkę do tej samej stożkowej probówki 15 mL, dbając o to, aby sorbent pozostał w szyjce pipety ekstrakcyjnej.
3. Powtórzyć kroki 3.1 i 3.2, przepuszczając próbkę przez sorbent 15 razy.
4. Przepłukać sorbent i związane białko, przepuszczając 1 mL 95% etanolu przez złoże sorbentu trzy razy, wyrzucając etanol do oryginalnej probówki.
5. Powtórzyć krok 3.4, używając drugiej porcji 1 mL 95% etanolu do płukania.
6. Przez 5 minut uciskać i zwalniać gruszkę, przepuszczając powietrze przez pipetę ekstrakcyjną w celu osuszenia złoża białko/sorbent. Przetrzeć pozostałości etanolu z końcówki pipety ekstrakcyjnej za pomocą chusteczki typu kimwipe.
7. Odzyskać białko, przepuszczając 250 μL PBS przez sorbent pięć razy. Bufor PBS można zastąpić dowolnym innym odpowiednim roztworem wodnym, np. 10 mM Tris (pH 6.8). Otrzymany roztwór zawiera zawartość białek z próbki.

Rycina 1.

Rysunek 2.

Rycina 3.

Rycina 4.

Rysunek 5.

Wyniki

Izolacja kwasów nukleinowych: Izolowane kwasy nukleinowe nadają się do amplifikacji metodą PCR i są wolne od zanieczyszczeń białkowych.

Przykład 1: Odzyskane kwasy nukleinowe nadają się do zastosowań opartych na metodzie PCR. Na przykład Rysunek 2 przedstawia amplifikację genów toksyny Shiga związanych z enterohemoragicznym szczepem E. coli O157:H7 EDL-933 (ATCC # 35150) z procedury ekstrakcji kwasów nukleinowych i białek z użyciem pipety ekstrakcyjnej. Geny toksyny Shiga stx1 i stx2 znajdują się w umiarkowanych bakteriofagach typu lambda oraz defektywnych bakteriofagach w tym oraz innych enterohemoragicznych szczepach E. coli pod kontrolą promotora P_R ^{5 6 7 8}. Aktywacja odpowiedzi SOS w E. coli prowadzi do indukcji profaga i/lub produkcji toksyny ⁹. Wykorzystaliśmy zmodyfikowaną wersję testu multiplex PCR opracowanego przez Feng et al.¹¹ w celu identyfikacji genów stx1 i stx2 zarówno w kulturach, jak i w wzbogaconych próbkach ścieków. Ścieżki A i B na Rysunku 2 pokazują wyniki amplifikacji PCR nieprzetworzonej próbki kultury (ścieżka A) oraz przetworzonej próbki kultury (ścieżka B). Wyniki te są niemal identyczne, co oznacza brak utraty wierności w przetworzonych lub wyizolowanych kwasach nukleinowych. Następnie przeprowadziliśmy amplifikację wzbogaconych surowych ścieków (ścieżka D) lub wyizolowanych kwasów nukleinowych ze wzbogaconych ścieków (ścieżki E i F). Dane te wskazują, że wyizolowane kwasy nukleinowe dały większą amplifikację w porównaniu z nieizolowanymi kwasami nukleinowymi z wzbogaconych próbek ścieków. Wyciągamy zatem wniosek, że podczas izolacji usunięto inhibitory PCR naturalnie występujące w ściekach lub że kwasy nukleinowe zostały skoncentrowane podczas izolacji. Możliwa jest również kombinacja obu tych hipotez.

Następnie wykorzystano spektroskopię ultrafioletową, aby wykazać, że wyizolowane kwasy nukleinowe były względnie wolne od zanieczyszczeń białkowych. Rysunek 3 przedstawia widma UV dwóch ekstrakcji kwasów nukleinowych z E. coli O157:H7, oznaczonych jako izolacja a i izolacja b, w porównaniu z znormalizowanym widmem kultury bakteryjnej, oznaczonym jako przed izolacją. Widma UV wyizolowanych kwasów nukleinowych przypominają widma czystych kwasów nukleinowych, z obliczonym stosunkiem absorbancji między 260 nm a 280 nm zbliżającym się do 1,8¹⁰. Dane te wykazują, że w frakcji kwasów nukleinowych odzyskanej za pomocą opisanego sposobu znajduje się bardzo mało zanieczyszczeń białkowych.

Izolacja białka: Białko odzyskane w eksperymencie izolacji kwasów nukleinowych/białek jest immunoreaktywne i identyczne pod względem elektroforetycznym z czystym białkiem.

Przykład 2: Wyizolowaną frakcję białek naniesiono na paski do testu przepływu bocznego RapidChek E. coli O157 (SDIX, Inc.). Kontrole wykazują pozytywną identyfikację we wszystkich próbkach zawierających E. coli O157, z indukcją STX lub bez (Rysunek 4, odpowiednio ścieżki B i C). Dane na Rysunku 4 wykazują również wyniki pozytywne dla tych próbek zawierających E. coli O157, które zostały poddane obróbce w celu wyizolowania kwasów nukleinowych, a następnie białek przy użyciu pipety do ekstrakcji. Dane te pokazują, że wyizolowane z każdej próbki białko jest immunoreaktywne, co wywołuje reakcję pozytywną.

W celu wykazania, że wyizolowana frakcja białkowa była wolna od zanieczyszczeń kwasami nukleinowymi, przeprowadzono amplifikację PCR (zgodnie z opisem w Przykładzie 1) próbek białek. Wyniki tych eksperymentów w elektroforezie żelowej były we wszystkich przypadkach negatywne. Stąd wyciągamy wniosek, że zawartość białkowa próbki została oddzielona od zanieczyszczających kwasów nukleinowych. Wyniki te, w połączeniu z tymi opisanymi dla etapu izolacji kwasów nukleinowych, wykazują, że kwasy nukleinowe i białka są izolowane w oddzielnych etapach frakcjonowania.

Przykład 3: Wyizolowane białko nadaje się do elektroforezy ¹⁰. Rysunek 5 przedstawia żel z 8% akryloamidem barwiony Coomassie, na który naniesiono BSA (Rysunek 5, ścieżki A i C) oraz BSA wyizolowane z 6M izotiocyjanianu guanidyny przy użyciu pipety ekstrakcyjnej i powiązanego protokołu. Mobilność elektroforetyczna wyizolowanego białka jest identyczna jak w próbkach kontrolnych. Wyciągamy zatem wniosek, że proces ekstrakcji nie zmienia struktury kowalencyjnej wyizolowanego białka.

Rysunek 1, Panel A: Przedstawienie typowej procedury ekstrakcji kwasów nukleinowych. Próbkę miesza się z 6M tiocyjanianem guanidyny w probówce z próbką i przepuszcza przez sorbent pięć razy. Po ostatnim przejściu próbkę dodaje się do buforu do ekstrakcji białek. Sorbent i związane kwasy nukleinowe przemywa się dwukrotnie etanolem. Następnie próbkę suszy się na powietrzu i eluje z sorbentu.

Rycina 1, Panel B: Przedstawienie typowej procedury ekstrakcji białek. Próbka zmieszana z buforem do izolacji białek z kroku 1, Rycina 1, panel A, jest przepuszczana przez sorbent drugiej pipety ekstrakcyjnej 15 razy. Pozostała część procedury jest identyczna z protokołem ekstrakcji kwasów nukleinowych.

Rysunek 2: Negatyw obrazu żelu agarozowego barwionego bromkiem etydyny. Przeprowadzono eksperyment multipleksowej amplifikacji genów toksyny Shiga 1 i 2 z wykorzystaniem próbek hodowlanych (ścieżki A i B) lub próbek surowych ścieków wzbogaconych E. coli O157:H7 (ścieżki D, E i F). Próbki dodano bezpośrednio do probówki z reakcją PCR (ścieżki A i D) lub przetworzono za pomocą procesu izolacji, a wyekstrahowane kwasy nukleinowe dodano do probówki z reakcją PCR (próbki B, E i F). Protokół PCR jest modyfikacją opisanego przez Feng et al¹¹. Nasza modyfikacja ukierunkowała analizę wyłącznie na fragmenty amplifikowane przez pary starterów do stx1 (dolny prążek) i stx2 (górny prążek), pomijając wszystkie pozostałe pary starterów. Ścieżka C to marker 1Kb firmy BioRad.

Rycina 3: Wyniki spektroskopii UV kwasów nukleinowych E. coli O157:H7 wyizolowanych przy użyciu opisanej pipety do ekstrakcji. Wyizolowane kwasy nukleinowe są oznaczone jako izolacja a oraz izolacja b. Przed ekstrakcją kwasów nukleinowych przebadano również widmo UV próbki, które oznaczono jako przed izolacją. Widma uzyskano za pomocą spektrofotometru Hitachi U3010 i powiązanego pakietu oprogramowania.

Rycina 4: Zdjęcie kolorowe pasków testowych RapidChek. Zawartość białek w próbkach użytych w Rycinnie 2 została wyizolowana za pomocą pipety do ekstrakcji i przebadana pod kątem immunoreaktywności za pomocą testu przepływu bocznego. Ścieżki A-C to kontrole nieprzetworzone, t. j. do paska testowego dodano hodowlę komórkową bez ekstrakcji kwasów nukleinowych lub białek. Ścieżka A to E. coli BL21 DE3 pLysS jako kontrola negatywna, ścieżki B i C przedstawiają E. coli O157:H7 nieleczoną (B) lub leczoną mitomycyną C przez 4 godziny (C). Ścieżki od D do H przedstawiają wyniki dodania ekstraktu białkowego do pasków testu przepływu bocznego. W ścieżkach D i E zastosowano ekstrakt białkowy z E. coli BL21 DE3 pLysS odpowiednio bez (D) lub z zastosowaniem mitomycyny C (E) jako kontrole negatywne. Ścieżki F-H przedstawiają wyniki zastosowania ekstraktu białkowego z E. coli O157:H7. Białko wyekstrahowano z kultur nieleczonych (F) oraz z kultur leczonych mitomycyną C przez 2 godziny (G) lub 4 godziny (H). Wyniki pozytywne objawiają się w postaci podwójnej czerwonej linii.

Rysunek 5: Fotografia żelu SDS-PAGE barwionego Coomassie. BSA wyizolowano z roztworu przy użyciu pipety do ekstrakcji zgodnie z opisanymi protokołami. Ścieżki A i C to ścieżki kontrolne o stężeniach odpowiednio 250 μg/mL i 500 μg/mL. Ścieżki B i D przedstawiają odzyskaną BSA z roztworów o stężeniach takich samych jak w odpowiadających im kontrolach.

Dyskusja

Narzędzie, odczynniki oraz protokół opisane w niniejszym raporcie stanowią pierwszy znany przykład systemu ekstrakcji wielu makrocząsteczek niewymagającego dostępu do energii elektrycznej, który może być wykorzystywany w aplikacjach terenowych typu point-of-care. Oba rodzaje makrocząsteczek mogą być stosowane w wielu diagnostycznych lub analitycznych urządzeniach do dalszej analizy. Na przykład wyizolowane kwasy nukleinowe posiadają jakość umożliwiającą przeprowadzenie PCR (Rycina 2 i 3), natomiast komponent białkowy próbki wykazuje reaktywność immunologiczną (Rycina 4). Wykorzystanie tego systemu ekstrakcji w trudnych warunkach lub w regionach świata o ograniczonych zasobach mogłoby drastycznie zmniejszyć obciążenie chorobami populacji tam zamieszkujących. System ten mógłby również wspomóc programy nadzoru nad chorobami na całym świecie, zapewniając niezawodną, a jednocześnie szybką i kosztowo efektywną metodę przetwarzania próbek w trudnych warunkach lub w lokalizacjach oddalonych.

Ważnym aspektem opisanej powyżej metody ekstrakcji jest możliwość jej modyfikacji przez użytkownika. Na przykład w przypadkach, gdy objętość próbki jest większa lub mniejsza niż początkowe 500 μLs (krok 1.2), użytkownik może odpowiednio dostosować objętości odczynników. Oznacza to, że stosunek objętości odczynników do objętości próbki powinien pozostać stały, podczas gdy objętości bezwzględne mogą ulec zmianie. Ponadto, liczba przejść przez sorbent może zostać dostosowana według uznania użytkownika. Na przykład w przypadku zastosowania większej objętości próbki, wielokrotne przepuszczanie próbki przez sorbent (częściej niż wskazano w krokach 2.4 i 3.3) zwiększy prawdopodobieństwo kontaktu danego typu makrocząsteczek (kwasów nukleinowych lub białek) z sorbentem. Zwiększenie liczby przejść powinno podnieść wydajność wychwytu, aż do momentu osiągnięcia nasycenia sorbentu.

Stwierdziliśmy, że narzędzie do ekstrakcji oraz powiązane z nim odczynniki chemiczne posiadają pewne ograniczenia, z których najistotniejszym jest niska wydajność chemii ekstrakcji białek w odzyskiwaniu białek silnie glikozylowanych. W przypadku, gdy diagnostyka w dalszych etapach jest skierowana na białko glikozylowane, system ten może nie być optymalny do identyfikacji. Ponadto wciąż określane są górne i dolne granice wydajności ekstrakcji kwasów nukleinowych oraz białek, a obecnie trwają prace optymalizacyjne w celu maksymalizacji wydajności odzyskiwania. Dalszy rozwój narzędzia pozwoli na wyeliminowanie tych luk w wiedzy.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Tiocyjanian guanydyny	TEKnova, Inc.	G4000
etanol	Pharmco-AAPER	11ACS200
2-propanol	Sigma-Aldrich	109827-1L
BSA	Sigma-Aldrich	A-4503