Sekwencyjna izolacja kwasów nukleinowych i białek bez użycia energii elektrycznej

Podsumowanie

Opisano narzędzie oraz odczynniki do sekwencyjnej izolacji kwasów nukleinowych, a następnie białek z próbki, bez konieczności użycia energii elektrycznej. Narzędzie składa się z sorbentu umieszczonego w pipecie transferowej, natomiast odczynniki do izolacji opierają się na zasadach ekstrakcji do fazy stałej. Izolowane makrocząsteczki mogą być analizowane za pomocą testów immunologicznych oraz PCR.

Streszczenie

Patogeny tradycyjne i wyłaniające się, takie jak enterohemoragiczna Escherichia coli (EHEC), Yersinia pestis czy choroby prionowe, stanowią istotny problem dla rządów, przemysłu i personelu medycznego na całym świecie. Na przykład EHEC, wraz z Shigella, odpowiadają za śmierć około 325 000 dzieci każdego roku i są szczególnie rozpowszechnione w krajach rozwijających się, gdzie identyfikacja laboratoryjna, powszechna w Stanach Zjednoczonych, jest niedostępna ¹. Opracowanie i rozpowszechnienie niskokosztowych, terenowych narzędzi do diagnostyki w punkcie opieki (point-of-care), wspomagających szybką identyfikację i/lub diagnozę patogenów lub markerów chorób, mogłoby drastycznie zmienić przebieg choroby i rokowania pacjentów. Opracowaliśmy narzędzie do izolacji kwasów nukleinowych i białek z próbki metodą ekstrakcji do fazy stałej (SPE) bez użycia energii elektrycznej i towarzyszącego wyposażenia laboratoryjnego ². Izolowane makrocząsteczki mogą być wykorzystane do diagnostyki zarówno w laboratorium, jak i przy użyciu terenowych platform diagnostycznych w punkcie opieki. Co ważne, metoda ta umożliwia bezpośrednie porównanie danych dotyczących kwasów nukleinowych i białek z niepodzielonej próbki, zapewniając wiarygodność dzięki potwierdzeniu analizy genomowej i proteomicznej.

Nasze narzędzie do izolacji wykorzystuje standard przemysłowy w zakresie izolacji kwasów nukleinowych w fazie stałej, technologię BOOM, która izoluje kwasy nukleinowe z roztworu soli chaotropowych, zazwyczaj izotiocyjanianu guanidyny, poprzez wiązanie z cząstkami lub filtrami na bazie krzemionki ³. Autorska chemia ekstrakcji w fazie stałej opracowana przez CUBRC jest stosowana do oczyszczania białek z roztworów soli chaotropowych, w tym przypadku z odpadów lub frakcji przepływowej powstałej po izolacji kwasów nukleinowych⁴.

Poprzez zamknięcie dobrze scharakteryzowanych procesów chemicznych w małej, niedrogiej i prostej platformie, stworzyliśmy przenośny system do ekstrakcji kwasów nukleinowych i białek, który może być wykorzystywany w różnych warunkach. Wyizolowane kwasy nukleinowe są stabilne i mogą być transportowane do miejsca z dostępem do zasilania w celu przeprowadzenia amplifikacji PCR, natomiast zawartość białek może zostać natychmiast poddana analizie za pomocą przenośnych lub innych testów immunologicznych. Szybka identyfikacja markerów choroby w terenie mogłaby znacząco wpłynąć na rokowania pacjenta poprzez wdrożenie właściwego leczenia na wcześniejszym etapie postępu choroby. Opisane narzędzie i metoda nadają się do zastosowania w przypadku niemal każdego czynnika zakaźnego i oferują użytkownikowi możliwość redundantnej analizy wielu typów makrocząsteczek, przy jednoczesnym zmniejszeniu obciążeń logistycznych.

Protokół

1. Lizy próbek

1. Próbki powinny być w formie ciekłej. Jeśli próbka jest stała, na przykład żywność lub stolec, należy zawiesić ją w medium ciekłym, takim jak woda lub bufor fosforanowy (PBS).
2. W probówce o pojemności 1,5 mL wymieszać 500 μL próbki z 500 μL 6M tiocyjanianu guanidyny (pH 6,5).
3. Ucisnąć gruszkę pipety ekstrakcyjnej, aby wypchnąć powietrze.
4. Powoli zwolnić ucisk gruszki, aby zassać całą 1 mL próbki do pipety ekstrakcyjnej, przepuszczając ją przez materiał sorbentny.
5. Odwrócić urządzenie ekstrakcyjne tak, aby kuleczki sorbentu wraz z próbką spłynęły do gruszki.
6. Rozetrzeć kuleczki sorbentu wraz z próbką wewnątrz gruszki, uważając, aby nie wypchnąć próbki z pipety ekstrakcyjnej.

2. Izolacja kwasów nukleinowych (Rysunek 1, Panel A)

1. Odwrócić pipetę ekstrakcyjną (otworem w dół) i wypchnąć próbkę do oryginalnej probówki 1,5 mL.
2. Wciągnąć całą 1 mL próbki do pipety ekstrakcyjnej, przepuszczając ją przez sorbent z umiarkowaną prędkością, dbając o to, aby sorbent pozostał w szyjce pipety ekstrakcyjnej.
3. Wypchnąć całą próbkę do probówki 1,5 mL poprzez naciśnięcie gruszki.
4. Powtórzyć kroki 2.2 i 2.3, przepuszczając próbkę przez sorbent jeszcze cztery razy, aby łącznie uzyskać 5 przejść.
5. Po piątym przejściu przez sorbent wypchnąć całą 1 mL próbki do 4 mL buforu do ekstrakcji białek (do stożkowej probówki 15 mL), zamknąć probówkę i odstawić do późniejszego użycia.
6. Przemyć wyizolowane kwasy nukleinowe, przepuszczając 1 mL 95% etanolu przez sorbent trzy razy, zwracając etanol do oryginalnej probówki po ostatnim przejściu.
7. Powtórzyć krok 2.6, używając drugiej porcji 1 mL 95% etanolu do płukania.
8. Przez 5 minut naciskać i puszczać gruszkę, przepuszczając powietrze przez pipetę ekstrakcyjną w celu wysuszenia kwasów nukleinowych/złoża sorbentu. Przetrzeć końcówkę pipety ekstrakcyjnej z pozostałości etanolu za pomocą chusteczki Kimwipe.
9. Odzyskać kwasy nukleinowe, przepuszczając 250 μL 10 mM Tris (pH 6,8) przez sorbent pięć razy. Bufor Tris można zastąpić dowolnym innym odpowiednim roztworem wodnym, np. PBS. Otrzymany roztwór zawiera wyekstrahowane kwasy nukleinowe.

3. Ekstrakcja białek (Rysunek 1, Panel B)

1. Wymieszaj próbkę z buforem do ekstrakcji białek z kroku 2.5 poprzez odwracanie probówki, a następnie przepuść około dwa do trzech mililitrów tej 5 mL próbki przez sorbent nowej pipety ekstrakcyjnej.
2. Wytłocz całą próbkę do tej samej stożkowatej probówki 15 mL, dbając o to, aby sorbent pozostał w szyjce pipety ekstrakcyjnej.
3. Powtórz kroki 3.1 i 3.2, przepuszczając próbkę przez sorbent 15 razy.
4. Przemyj sorbent i związane białko, przepuszczając 1 mL 95% etanolu przez złoże sorbentu trzy razy, wyrzucając etanol do oryginalnej probówki.
5. Powtórz krok 3.4, używając drugiej porcji 1 mL 95% etanolu do płukania.
6. Naciskaj i puszczaj gruszkę przez 5 minut, przepuszczając powietrze otoczenia przez pipetę ekstrakcyjną, aby osuszyć złoże białko/sorbent. Wytrzyj pozostałości etanolu z końcówki pipety ekstrakcyjnej za pomocą chusteczki Kimwipe.
7. Odzyskaj białko, przepuszczając 250 μL PBS przez sorbent pięć razy. Bufor PBS można zastąpić jakimkolwiek innym odpowiednim roztworem wodnym, np. 10 mM Tris (pH 6.8). Otrzymany roztwór zawiera zawartość białek z próbki.

Rycina 1.

Rysunek 2.

Rycina 3.

Rycina 4.

Rycina 5.

Wyniki

Izolacja kwasów nukleinowych: Izolowane kwasy nukleinowe nadają się do amplifikacji metodą PCR i są wolne od zanieczyszczeń białkowych.

Przykład 1: Odzyskane kwasy nukleinowe nadają się do zastosowań opartych na metodzie PCR. Na przykład Rysunek 2 przedstawia amplifikację genów toksyny Shiga związanych z enterohemoragicznym szczepem E. coli O157:H7 EDL-933 (ATCC # 35150) z procedury ekstrakcji kwasów nukleinowych/białek z wykorzystaniem pipety ekstrakcyjnej. Geny toksyny Shiga stx1 i stx2 znajdują się w umiarkowanych bakteriofagach podobnych do lambda oraz w uszkodzonych bakteriofagach w tym oraz innych enterohemoragicznych szczepach E. coli pod kontrolą promotora P_R ^{5 6 7 8}. Aktywacja odpowiedzi SOS w E. coli prowadzi do indukcji profaga i/lub produkcji toksyny ⁹. Wykorzystaliśmy zmodyfikowaną wersję testu multiplex PCR opracowanego przez Feng et al.¹¹ w celu zidentyfikowania genów stx1 i stx2 zarówno w kulturach, jak i w posiewach próbek ścieków. Ścieżki A i B na Rysunku 2 przedstawiają wyniki amplifikacji PCR nieprzetworzonej próbki hodowli (ścieżka A) oraz przetworzonej próbki hodowli (ścieżka B). Wyniki te są praktycznie identyczne, co oznacza brak utraty wierności w przetworzonych lub wyizolowanych kwasach nukleinowych. Następnie przeprowadziliśmy amplifikację surowych ścieków z dodatkiem wzorca (ścieżka D) lub wyizolowanych kwasów nukleinowych ze ścieków z dodatkiem wzorca (ścieżki E i F). Dane te wskazują, że wyizolowane kwasy nukleinowe zapewniły większą amplifikację w porównaniu z nieizolowanymi kwasami nukleinowymi z próbek ścieków z dodatkiem wzorca. Wyciągamy zatem wniosek, że albo inhibitory PCR naturalnie występujące w ściekach zostały usunięte podczas izolacji, albo kwasy nukleinowe uległy zagęszczeniu podczas izolacji. Możliwa jest również kombinacja obu tych hipotez.

Następnie wykorzystano spektroskopię ultrafioletową, aby wykazać, że wyizolowane kwasy nukleinowe były względnie wolne od zanieczyszczeń białkowych. Rysunek 3 przedstawia widma UV dwóch ekstrakcji kwasów nukleinowych z E. coli O157:H7, oznaczonych jako izolacja a i izolacja b, w porównaniu z znormalizowanym widmem kultury bakteryjnej, oznaczonego jako przed izolacją. Widma UV wyizolowanych kwasów nukleinowych przypominają widma czystych kwasów nukleinowych, z obliczonym stosunkiem absorbancji między 260 nm a 280 nm zbliżającym się do 1,8¹⁰. Dane te wskazują, że w frakcji kwasów nukleinowych odzyskanej za pomocą opisanego sposobu znajduje się bardzo mało zanieczyszczeń białkowych.

Izolacja białka: Białko odzyskane w eksperymencie izolacji kwasów nukleinowych/białek wykazuje immunoreaktywność i jest elektroforetycznie identyczne z czystym białkiem.

Przykład 2: Wyizolowaną frakcję białkową naniesiono na paski do testu przepływu bocznego RapidChek E. coli O157 (SDIX, Inc.). Kontrole wykazują pozytywną identyfikację we wszystkich próbkach zawierających E. coli O157, z indukcją STX lub bez niej (Rysunek 4, odpowiednio ścieżki B i C). Dane na Rysunku 4 wykazują również wyniki pozytywne dla tych próbek zawierających E. coli O157, które zostały poddane izolacji kwasów nukleinowych, a następnie białek przy użyciu pipety do ekstrakcji. Dane te pokazują, że wyizolowane białko z każdej próbki jest immunoreaktywne, co wywołuje pozytywną odpowiedź.

Przeprowadzono amplifikację PCR (zgodnie z opisem w Przykładzie 1) próbek białek, aby wykazać, że wyizolowana frakcja białkowa była wolna od zanieczyszczeń kwasami nukleinowymi. Wyniki tych eksperymentów w elektroforezie żelowej były we wszystkich przypadkach negatywne. W związku z tym stwierdzamy, że zawartość białek w próbce została oddzielona od zanieczyszczających kwasów nukleinowych. Wyniki te, razem z opisanymi dla etapu izolacji kwasów nukleinowych, pokazują, że kwasy nukleinowe oraz białka są izolowane w osobnych etapach frakcjonowania.

Przykład 3: Wyizolowane białko nadaje się do elektroforezy ¹⁰. Rysunek 5 przedstawia żel akrylamidowy 8% barwiony Coomassie, na który naniesiono BSA (Rysunek 5, ścieżki A i C) oraz BSA wyizolowane z 6M izotiocyjanianu guanydyny przy użyciu pipety ekstrakcyjnej i powiązanego protokołu. Mobilność elektroforetyczna wyizolowanego białka jest identyczna jak w przypadku próbek kontrolnych. Wyciągamy zatem wniosek, że proces ekstrakcji nie zmienia struktury kowalencyjnej wyizolowanego białka.

Rycina 1, panel A: Przedstawienie typowej procedury ekstrakcji kwasów nukleinowych. Próbkę miesza się z 6M tiocyjanianem guanidyny w probówce z próbką i przepuszcza przez sorbent pięć razy. Po ostatnim przejściu próbkę dodaje się do buforu do ekstrakcji białek. Sorbent i związane kwasy nukleinowe przemywa się dwukrotnie etanolem. Następnie próbkę suszy się na powietrzu i eluuje z sorbentu.

Rycina 1, panel B: Przedstawienie typowej procedury ekstrakcji białek. Próbkę zmieszaną z buforem do izolacji białek z etapu 1, Rycina 1, panel A, przepuszcza się przez sorbent drugiej pipety ekstrakcyjnej 15 razy. Pozostała część procedury jest identyczna z protokołem ekstrakcji kwasów nukleinowych.

Rysunek 2: Negatyw żelu agarozowego barwionego bromkiem etydyny. Przeprowadzono eksperyment z multipleksową amplifikacją genów toksyny shiga 1 i 2 z wykorzystaniem próbek hodowlanych (ścieżki A i B) lub próbek ścieków surowych wzbogaconych o E. coli O157:H7 (ścieżki D, E i F). Próbki dodano bezpośrednio do probówki z reakcją PCR (ścieżki A i D) lub przetworzono w procesie izolacji, a wyekstrahowane kwasy nukleinowe dodano do probówki z reakcją PCR (próbki B, E i F). Protokół PCR jest modyfikacją metody opisanej przez Feng et al¹¹. Nasza modyfikacja objęła jedynie fragmenty amplifikowane przez pary starterów stx1 (dolny prążek) i stx2 (górny prążek), z pominięciem wszystkich pozostałych par starterów. Ścieżka C to marker 1Kb od BioRad.

Rysunek 3: Wyniki spektroskopii UV kwasów nukleinowych E. coli O157:H7 wyizolowanych przy użyciu opisanej pipety do ekstrakcji. Wyizolowane kwasy nukleinowe są oznaczone jako izolacja a i izolacja b. Przebadano również widmo UV próbki przed ekstrakcją kwasów nukleinowych, oznaczone jako przed izolacją. Widma uzyskano za pomocą spektrofotometru Hitachi U3010 oraz powiązanego pakietu oprogramowania.

Rycina 4: Zdjęcie kolorowe pasków testowych RapidChek. Zawartość białek w próbkach użytych w Rycina 2 została wyizolowana za pomocą pipety ekstrakcyjnej i przetestowana pod kątem immunoreaktywności za pomocą analizy przepływu bocznego. Ścieżki A-C to kontrole nieprzetworzone, czyli hodowla komórkowa została dodana do paska testowego bez ekstrakcji kwasów nukleinowych lub białek. Ścieżka A to E. coli BL21 DE3 pLysS jako kontrola negatywna; ścieżki B i C przedstawiają E. coli O157:H7 nieleczoną (B) lub traktowaną mitomycyną C przez 4 godziny (C). Ścieżki od D do H przedstawiają wyniki dodania ekstraktu białkowego do pasków testowych przepływu bocznego. Ścieżki D i E zostały przebadane przy użyciu ekstraktu białkowego z E. coli BL21 DE3 pLysS odpowiednio bez (D) lub z traktowaniem mitomycyną C (E) jako kontrole negatywne. Ścieżki F-H przedstawiają wyniki przy użyciu ekstraktu białkowego z E. coli O157:H7. Białko ekstrahowano z hodowli nieleczonych (F), lub traktowanych mitomycyną C przez 2 godziny (G) lub 4 godziny (H). Wyniki dodatnie dają podwójną czerwoną linię.

Rysunek 5: Zdjęcie żelu SDS-PAGE barwionego Coomassie. BSA wyizolowano z roztworu przy użyciu pipety ekstrakcyjnej zgodnie z opisanymi protokołami. Ścieżki A i C to ścieżki kontrolne o stężeniach odpowiednio 250 μg/mL i 500 μg/mL. Ścieżki B i D przedstawiają odzyskaną BSA z roztworów zawierających takie same stężenia jak ich odpowiednie kontrole.

Dyskusja

Narzędzie, odczynniki oraz protokół opisane w niniejszym raporcie stanowią pierwszy znany przykład systemu ekstrakcji wielu makrocząsteczek niewymagającego dostępu do energii elektrycznej, który może być wykorzystywany w aplikacjach terenowych typu point-of-care. Oba rodzaje makrocząsteczek mogą być stosowane w wielu diagnostycznych lub analitycznych urządzeniach do dalszej analizy. Na przykład wyizolowane kwasy nukleinowe posiadają jakość umożliwiającą przeprowadzenie PCR (Rycina 2 i 3), natomiast komponent białkowy próbki wykazuje reaktywność immunologiczną (Rycina 4). Wykorzystanie tego systemu ekstrakcji w trudnych warunkach lub w regionach świata o ograniczonych zasobach mogłoby drastycznie zmniejszyć obciążenie chorobami populacji tam zamieszkujących. System ten mógłby również wspomóc programy nadzoru nad chorobami na całym świecie, zapewniając niezawodną, a jednocześnie szybką i kosztowo efektywną metodę przetwarzania próbek w trudnych warunkach lub w lokalizacjach oddalonych.

Ważnym aspektem opisanej powyżej metody ekstrakcji jest możliwość jej modyfikacji przez użytkownika. Na przykład w przypadkach, gdy objętość próbki jest większa lub mniejsza niż początkowe 500 μLs (krok 1.2), użytkownik może odpowiednio dostosować objętości odczynników. Oznacza to, że stosunek objętości odczynników do objętości próbki powinien pozostać stały, podczas gdy objętości bezwzględne mogą ulec zmianie. Ponadto, liczba przejść przez sorbent może zostać dostosowana według uznania użytkownika. Na przykład w przypadku zastosowania większej objętości próbki, wielokrotne przepuszczanie próbki przez sorbent (częściej niż wskazano w krokach 2.4 i 3.3) zwiększy prawdopodobieństwo kontaktu danego typu makrocząsteczek (kwasów nukleinowych lub białek) z sorbentem. Zwiększenie liczby przejść powinno podnieść wydajność wychwytu, aż do momentu osiągnięcia nasycenia sorbentu.

Stwierdziliśmy, że narzędzie do ekstrakcji oraz powiązane z nim odczynniki chemiczne posiadają pewne ograniczenia, z których najistotniejszym jest niska wydajność chemii ekstrakcji białek w odzyskiwaniu białek silnie glikozylowanych. W przypadku, gdy diagnostyka w dalszych etapach jest skierowana na białko glikozylowane, system ten może nie być optymalny do identyfikacji. Ponadto wciąż określane są górne i dolne granice wydajności ekstrakcji kwasów nukleinowych oraz białek, a obecnie trwają prace optymalizacyjne w celu maksymalizacji wydajności odzyskiwania. Dalszy rozwój narzędzia pozwoli na wyeliminowanie tych luk w wiedzy.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Tiocyjanian guanydyny	TEKnova, Inc.	G4000
etanol	Pharmco-AAPER	11ACS200
2-propanol	Sigma-Aldrich	109827-1L
BSA	Sigma-Aldrich	A-4503