Oczyszczanie i agregacja wewnątrzkomórkowej domeny białka prekursorowego amyloidu

Podsumowanie

Opisano metodę oczyszczania domeny wewnątrzkomórkowej APP (AICD) na dużą skalę. Opisano również metodologię indukowania agregacji i wizualizacji AICD in vitro za pomocą mikroskopii sił atomowych. Opisane metody są przydatne do biochemicznej/strukturalnej charakterystyki AICD i wpływu molekularnych białek opiekuńczych na jego agregację.

Streszczenie

Białko prekursorowe amyloidu (APP) jest białkiem transbłonowym typu I związanym z patogenezą choroby Alzheimera (AD). APP charakteryzuje się dużą domeną zewnątrzkomórkową i krótką domeną cytozolową zwaną domeną wewnątrzkomórkową APP (AICD). Podczas dojrzewania przez szlak wydzielniczy APP może zostać rozszczepiony przez proteazy zwane α, β i γ-sekretazy¹. Sekwencyjne rozszczepienie proteolityczne APP z β i γ-sekretazami prowadzi do produkcji małego peptydu proteolitycznego, określanego jako Aβ, który jest amyloidogenny i stanowi rdzeń blaszek starczych. AICD jest również uwalniany z błony po przetworzeniu sekretazy, a poprzez interakcje z Fe65 i Tip60 może przemieszczać się do jądra, aby uczestniczyć w regulacji transkrypcji wielu docelowych genów^2,3. Interakcje białko-białko z udziałem AICD mogą wpływać na transport, przetwarzanie i funkcje komórkowe holo-APP i jego C-końcowych fragmentów. Niedawno wykazaliśmy, że AICD może agregować in vitro, a proces ten jest hamowany przez związany z AD molekularny opiekuńczy ubiquilin-1⁴. Zgodnie z tymi ustaleniami, AICD ma odsłonięte domeny hydrofobowe i jest wewnętrznie nieuporządkowany in vitro^5,6, jednak uzyskuje stabilną strukturę drugorzędową po związaniu z Fe65⁷. Zaproponowaliśmy, że ubiquilin-1 zapobiega niewłaściwym interakcjom między- i wewnątrzcząsteczkowym AICD, zapobiegając agregacji in vitro i w nienaruszonych komórkach⁴. Podczas gdy większość badań koncentruje się na roli APP w patogenezie choroby Alzheimera, rola AICD w tym procesie nie jest jasna. Wykazano, że ekspresja AICD indukuje apoptozę⁸, moduluje szlaki sygnałowe⁹ i reguluje sygnalizację wapnia¹⁰. Nadmierna ekspresja AICD i Fe65 w transgenicznym modelu myszy indukuje patologię podobną do choroby Alzheimera¹¹, a ostatnio AICD wykryto w lizatach mózgu za pomocą western blotting przy użyciu odpowiednich technik pobierania antygenu¹². Aby ułatwić badania strukturalne, biochemiczne i biofizyczne AICD, opracowaliśmy procedurę wytwarzania rekombinowanych dużych ilości wysoce czystego białka AICD. Dalej opisujemy metodę indukowania agregacji termicznej AICD in vitro i analizy za pomocą mikroskopii sił atomowych. Opisane metody są przydatne do biochemicznej, biofizycznej i strukturalnej charakterystyki AICD oraz wpływu molekularnych białek opiekuńczych na agregację AICD.

Protokół

1. Ekspresja rekombinowanej domeny wewnątrzkomórkowej APP (AICD)

1. Przekształć szczep E. coli BL21 z ludzkim AICD (reszty 649-695 APP, numeracja izoform neuronalnych) sklonowanym do wektora pGEX-4T-1 (GE Healthcare). Wektor ten będzie wyrażał AICD jako C-końcowe ugrupowanie białka fuzyjnego S-transferazy glutationu (GST). Wektor ten koduje również sekwencję rozszczepienia trombiny, aby ułatwić usunięcie ugrupowania GST. Szczegóły dotyczące klonowania AICD do pGEX-4T-1 można znaleźć w naszej poprzedniej publikacji⁴.
2. Z pojedynczej kolonii zaszczepić 10 ml bulionu LB ampicyliną (100 μg/ml) i inkubować przez noc w temperaturze 37 °C z energicznym wstrząsaniem.
3. Następnego ranka zaszczepić 400 ml LB/ampicyliny w litrowej kolbie z 5 ml nocnej hodowli.
4. Inkubować w temperaturze 37 °C z energicznym wytrząsaniem, aż gęstość optyczna przy długości fali 600 nm osiągnie 0,4-0,6. Zwykle zajmuje to od 2 do 2,5 godziny.

W tym momencie może być pożądane pobranie małej próbki (~10 μl), aby następnie przeprowadzić oczyszczanie za pomocą SDS-PAGE (patrz Rysunek 1A,B). Z każdego kolejnego etapu oczyszczania powinna być również usunięta mała porcja do analizy przez SDS-PAGE.

5. Indukować ekspresję GST-AICD przez dodanie 0,4 mM izopropylo-beta-D-tiogalaktopiranozydu (IPTG). Inkubować w temperaturze 37 °C, energicznie wstrząsając przez 5 godzin.
6. Odwirować komórki w temperaturze 6 000 x g przez 15 minut w temperaturze 4 °C. Na tym etapie procedury osad komórkowy może być przechowywany w temperaturze -80 °C przez kilka miesięcy.

2. Oczyszczanie GST-AICD

1. Przygotować 50 ml buforu do lizy w następujący sposób: 1 mM ditiotreitol, 1 mM kwas etylenodiaminotetraoctowy (EDTA), 0,1% Triton-X100, 1 mM fluorek fenylometylosulfonylu (PMSF), kompletny koktajl inhibitorów proteazy (Roche Applied Science) i sól fizjologiczna buforowana fosforanami. Schłodzić na lodzie.
2. Rozmrozić granulki bakteryjne (jeśli zostały wcześniej zamrożone) na lodzie.

W tym momencie bardzo ważne jest, aby wszystkie kroki były wykonywane w temperaturze 4 °C, aby ograniczyć proteolizę. Wszystkie probówki, i inne odczynniki powinny być wstępnie schłodzone. Jeśli używasz prasy francuskiej lub emulgatora do lizy, należy je również wstępnie schłodzić.

3. Dokładnie zawiesić osad bakteryjny w 20 ml buforu do lizy. Połączenie wirowania i rozcierania za pomocą 10 ml pipety na lodzie zapewni całkowite ponowne zawieszenie osadu.
4. Przepuścić zawieszone komórki bakteryjne przez emulgator (np. Avestin EmulsiFlex-C3) lub francuską komorę ciśnieniową, wstępnie schłodzone do temperatury 4 °C przy ciśnieniu 30 000 psi. Przepuść lizat przez emulgator po raz drugi. Zebrać lizat do wstępnie schłodzonej probówki o pojemności 50 ml.

Główną zaletą tych dwóch instrumentów jest to, że minimalizują nagrzewanie się próbki. Powszechnie stosowana technika sonikacji generuje znaczne ciepło na końcówce sondy sonizacyjnej i może powodować agregację rekombinowanych białek.

5. Odwirować lizat przy stężeniu 15 000 x g przez 30 minut. Oddzielić i przechowywać supernatant w wstępnie schłodzonej probówce o pojemności 50 ml.
6. Dodać 500 μl 50% zawiesiny glutationu-agarozy (Sigma-Aldrich). Obracać przez 30 minut w temperaturze 4 °C. Podczas obracania się próbki należy wykonać świeży bufor elucyjny: 50 mM Tris 7,8, 0,1% Triton-X100, 0,5 mM ditiotreitol, 10 mM zredukowany glutation.

Jedynym krokiem protokołu, który jest wykonywany w temperaturze pokojowej, jest etap elucji. W ten sposób bufor elucyjny jest utrzymywany w temperaturze pokojowej. Bufor elucyjny powinien być przygotowany na świeżo.

7. Wlej lizat i zawiesinę do jednorazowej 5-calowej kolumny chromatograficznej polistyrenowej z filtrami zgrubnymi (90-130 μm) (Evergreen Scientific). Przemyć kolumnę 5 razy 3 ml soli fizjologicznej buforowanej fosforanem.
8. Zakryć dno kolumny i dodać 500 μl buforu elucyjnego o temperaturze pokojowej. Przykryj górną część kolumny i obracaj przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Zebrać eluat do schłodzonej probówki o pojemności 1,5 ml do mikrofuge. Powtórzyć elucję jeszcze dwa razy (1,5 ml całkowitego eluatu).
9. Eluat należy dializować w membranie dializacyjnej o masie cząsteczkowej o masie cząsteczkowej 10 000 (np. kasetach dializacyjnych Thermo Scientific Slide-A-Lyzer) w 4 litrach soli fizjologicznej buforowanej fosforanami przez noc w temperaturze 4 °C. Dializować na dodatkowych 4 litrach soli fizjologicznej buforowanej fosforanami w temperaturze 4 °C przez 1 godzinę następnego dnia.
10. Wyjąć białko z kasety dializacyjnej i przeprowadzić test ilościowy białka w celu określenia wydajności GST-AICD. Typowe oczyszczanie z 400 ml kultury daje plony >20 mg oczyszczonego białka w stężeniach 10-20 mg/ml. Podzielić białko na 200 μl podwielokrotności i zamrozić w temperaturze -80 °C.

3. Rozszczepienie trombiny GST-AICD i oczyszczanie AICD

1. Rozmrozić 200 μl oczyszczonego GST-AICD i dodać 20 μl 1 U/μl trombiny. Inkubować przez noc w temperaturze 37 °C.

Jakość i czystość trombiny różni się znacznie w zależności od producenta i może być znaczącym źródłem zanieczyszczeń. Używamy trombiny firmy GE Healthcare (patrz tabela odczynników). Po całonocnej inkubacji >95% białka fuzyjnego powinno zostać rozszczepione (ryc. 1B).

2. Po nocnym rozszczepieniu trombiną jest prawdopodobne, że część uwolnionej AICD uległa agregacji i roztwór może wydawać się mętny. Usunąć zagregowany materiał przez odwirowanie przy 20 000 x g przez 30 minut w temperaturze 4 °C. Usunąć supernatant do wstępnie schłodzonej probówki do mikrodymowania.
3. Dodać 50 μl 50% zawiesiny glutationowo-agarozowej i 50 μl 50% gnojowicy p-aminobenzamidyno-agarozowej, aby usunąć odpowiednio GST i trombinę. Inkubować z rotacją przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
4. Odwirować na krótko w celu osadzenia kulek agarozy i usunąć supernatant do świeżej probówki. Wyciągnij GST jeszcze cztery razy za pomocą glutationu-agarozy. Pojedyncza ekstrakcja agarozą p-aminobenzamidyny jest wystarczająca do usunięcia 20 j. trombiny.
5. Przeprowadzić test ilościowy białka na 5 μl oczyszczonego AICD. Typowe plony z hodowli 400 ml wynoszą 50-100 μg przy stężeniu od 0,2 do 0,5 mg/ml. Wyższe plony są możliwe dzięki rozszczepieniu większych ilości GST-AICD.

Oczyszczony AICD powinien być przygotowany na świeżo do charakterystyki biochemicznej/biofizycznej. Niewykorzystany materiał należy wyrzucić. Możliwe jest również zagęszczenie AICD poprzez liofilizację próbki i ponowne zamieszanie w mniejszej objętości buforu⁶. Jeśli wykrycie AICD wymaga osuszenia (np. po utworzeniu pułapki filtracyjnej lub teście punktowym), należy przeprowadzić pobieranie antygenu z błony zgodnie z opisem Pimplikar i Suryanarayana¹².

4. Agregacja AICD dla mikroskopii sił atomowych (AFM)

1. Rozcieńczyć świeżo przygotowany AICD w roztworze soli fizjologicznej buforowanej fosforanami do stężenia 0,1 mg/ml w końcowej objętości 15 μl. W tym momencie można dodać różne związki i/lub białka w celu określenia, czy hamują one agregację AICD. Na przykład wykazaliśmy, że równomolowe stężenia ubiquiliny-1 zapobiegają agregacji AICD w tym teście⁴.

Możliwe jest również agregowanie większych objętości reakcji dla eksperymentów biochemicznych, takich jak testy pułapek filtracyjnych i rozpraszanie światła⁴. Odnieśliśmy sukces wykonując testy pułapek filtracyjnych na mieszaninach reakcyjnych o wielkości do 400 μl z AICD rozcieńczonym do stężeń tak niskich jak 1 μM.

2. Wywołać agregację termiczną poprzez inkubację próbek w temperaturze 43 °C z wytrząsaniem przy 800 obr./min w mieszalniku Eppendorf Thermomixer przez 48 godzin. Temperatura ta została wybrana na podstawie testów opiekuńczych, które badają agregację termiczną modelowego substratu białka opiekuńczego, cytrynianu syntazy^4,13.

agregacja termiczna jest powszechnie używaną metodą do wywoływania strukturalnego przejścia białka ze struktury natywnej do nienatywnej (która zwykle jest bogata w arkusze beta), co skutkuje powstawaniem agregatów międzycząsteczkowych. Agregacja termiczna jest również wykorzystywana do badania funkcji molekularnych białek opiekuńczych, które osłaniają segmenty hydrofobowe przed powstawaniem niewłaściwych oddziaływań międzycząsteczkowych (a tym samym opóźniają lub uniemożliwiają agregację termiczną).

3. Rozcieńczyć próbkę 20-krotnie w wodzie dejonizowanej i nanieść 2 μl na świeżo rozdrobnioną mikę. Wysuszyć próbkę w eksykatorze przez noc. Konieczne będzie empiryczne określenie optymalnego rozcieńczenia do obrazowania, a zatem rozsądne byłoby rozważne zastosowanie kilku rozcieńczeń w zakresie od 10 do 100 razy.
4. Wizualizacja zagregowanej AICD za pomocą AFM działającego w trybie stukania¹⁴. Zastosowane wsporniki to pokryte złotem mikroostre dźwignie azotkowe (MSNL, Bruker) o nominalnym promieniu końcówki 2 nm. Typowe amplitudy stukania podczas obrazowania wynoszą 10-20 nm przy częstotliwości rezonansowej wsporników (30-50 kHz).

Stwierdziliśmy, że jakość obrazu i kontrast różnych agregatów białkowych zależą od przyłożonej siły i czasu trwania eksperymentu. Aby zminimalizować zakłócenia próbki przez końcówkę, utrzymaliśmy przyłożoną siłę na stosunkowo niskim poziomie, utrzymując stosunek wartości zadanych powyżej 95% i ograniczając skanowanie każdej próbki do 5-10 minut. Przetwarzanie obrazu zostało wykonane za pomocą oprogramowania WSxM (Nanotec). Standardowe przetwarzanie obrazu polegało na odejmowaniu i spłaszczaniu płaszczyzny. Nasze laboratoria korzystają z "domowej konstrukcji" AFM¹⁵ połączonego z komercyjnym systemem sterowania mikroskopem z sondą skanującą (Nanotec).

5. Reprezentatywne wyniki

Wyrażenie i względne wzbogacenie GST-AICD pokazano na rysunku 1A. Po lizie większość białka fuzyjnego jest obecna we frakcji rozpuszczalnej, dlatego ekstrakcja z ciał inkluzyjnych nie jest wymagana. Materiał eluowany z kolumny agarozowej glutationu ma czystość >95%. W preparacie pokazanym na rysunku 1 stężenie białka eluowanego z kolumny wynosiło 14,5 mg/ml, a wydajność wynosiła 22 mg (z kultury wyjściowej 400 ml). Rozszczepienie 200 μl tego preparatu w ciągu nocy z 20 j. trombiny spowodowało prawie 100% rozszczepienie białka fuzyjnego (ryc. 1B). Ilość użytej trombiny jest na tyle niska, że nie jest wykrywalna przez niebieskie zabarwienie Coomassie (patrz pas "Rozszczepiony", ryc. 1B). Usunięcie trombiny i GST spowodowało pewne straty materiału, jednak był on czysty w >90%, a wydajność w tym preparacie wynosiła 70 μg AICD przy stężeniu 0,35 mg/ml. Rysunek 1C przedstawia schemat blokowy agregacji AICD i późniejszej analizy. Agregaty AICD obrazowane przez AFM są zazwyczaj sferoidalne/amorficzne i mają rozmiary od 50 do 100 nm (Rysunek 1D, F). Zagregowany materiał nie jest wykrywalny, gdy równomolowa ilość białka opiekuńczego ubikwiliny-1 jest dodawana do reakcji agregacji (ryc. 1E)⁴.

Rysunek 1. Oczyszczanie i agregacja AICD. A) Barwienie na niebiesko Coomassie próbek pobranych na każdym etapie procesu oczyszczania. W przypadku próbek nieindukowanych i indukowanych na żelu przeprowadzono 20 μl bakterii ogółem. Dla frakcji supernatantu na żel nałożono 5 μl lizatu (z całkowitej objętości 20 ml). W przypadku frakcji osadu, osad zawieszono ponownie w 20 ml buforu do lizy, a 5 μl tego materiału poddano sonikacji w łaźni wodnej przez 30 minut w temperaturze 4 °C przed załadowaniem do żelu. W celu uzyskania przepływu na żelu nałożono 5 μl. Wskazane są ilości eluatu załadowane do żelu. B) Coomassie barwiony na niebiesko żel z nierozszczepionym i rozszczepionym GST-AICD (2 μl) oraz 1 i 5 μl oczyszczonego AICD. C) Schemat blokowy oczyszczania, agregacji i analizy AICD. D,E) Reprezentatywny obraz AFM zagregowanego termicznie AICD pod nieobecność (D) i obecności (E) molekularnego białka opiekuńczego ubikwiliny-1. F) Histogram rozkładu wielkości agregatów AICD.

Dyskusja

W tym protokole przedstawiliśmy procedurę otrzymywania AICD o wysokiej czystości do analiz strukturalnych, biofizycznych i biochemicznych. Procedura ta nie wymaga zaawansowanego sprzętu chromatograficznego i dlatego jest dostępna dla większości laboratoriów. Inne grupy oczyściły AICD^5-7,16, w tym GST-AICD^17-19, do analiz biochemicznych/strukturalnych. Wady w stosunku do poprzednich protokołów obejmują słabą rozpuszczalność AICD¹⁶, czystość mniejszą od ideału¹⁷ oraz wymóg wykluc...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
pGEX-4T-1	GE Healthcare	28-9545-49
Trombina	GE Healthcare	27-0846-01
Ampicillin	Fisher Scientific	BP1760
Odczynnik do oznaczania białek Bradford	Bio-Rad	500-0002
Coomassie blue	Bio-Rad	161-0786
IPTG ( izopropyl-beta-D tiogalaktopiranozyd)	Sigma-Aldrich	I6758
Glutation-agaroza	Sigma-Aldrich	G4510
p-aminobenzamidyno-agaroza	Sigma-Aldrich	A7155
Kompletny koktajl inhibitorów proteazy
Slide-A-Lyzer	Thermo Scientific	66380
Kolumny chromatograficzne	Evergreen Scientific	208-3367-050
Emulgator	Avestin, Inc	EmulsiFlex-C3	Gorąco polecam
Eppendorf Thermomixer	Eppendorf	022670107
Mica Disks	Ted Pella	50-12
AFM Wsporniki	Bruker	MSNL-10
WSxM oprogramowanie	Nanotec	Nie dotyczy Bezpłatne	pobieranie