Oczyszczanie i agregacja domeny wewnątrzkomórkowej białka prekursorowego amyloidu

Podsumowanie

Opisano metodę wielkoskalowego oczyszczania wewnątrzkomórkowej domeny białka APP (AICD). Opisano również metodologię indukcji agregacji AICD in vitro oraz jej wizualizację za pomocą mikroskopii sił atomowych. Przedstawione metody są przydatne do biochemicznej i strukturalnej charakterystyki AICD oraz badania wpływu chaperonów molekularnych na jej agregację.

Streszczenie

Białko prekursor amyloidu (APP) jest białkiem transbłonowym typu I powiązanym z patogenezą choroby Alzheimera (AD). APP charakteryzuje się dużą domeną zewnątrzkomórkową i krótką domeną cytozolową, zwaną wewnątrzkomórkową domeną APP (AICD). Podczas dojrzewania w szlaku wydzielniczym APP może być cięte przez proteazy zwane α-, β- i γ-sekretazami¹. Sekwencyjne cięcie proteolityczne APP przez β- i γ-sekretazy prowadzi do powstania małego peptydu proteolitycznego, zwanego Aβ, który jest amyloidogenny i stanowi główny składnik blaszek starczych. AICD jest również uwalniana z błony po procesowaniu przez sekretazy i poprzez oddziaływania z Fe65 oraz Tip60 może translokować do jądra komórkowego, aby uczestniczyć w regulacji transkrypcji wielu genów docelowych^2,3. Oddziaływania białko-białko z udziałem AICD mogą wpływać na transport, procesowanie i funkcje komórkowe holo-APP oraz jego fragmentów C-końcowych. Wykazaliśmy niedawno, że AICD może agregować in vitro, a proces ten jest hamowany przez zaangażowaną w AD molekularną chaperoninę ubiquilin-1⁴. Zgodnie z tymi odkryciami, AICD posiada odsłonięte domeny hydrofobowe i jest białkiem wewnętrznie nieuporządkowanym in vitro^5,6, jednak uzyskuje stabilną strukturę drugorzędową po związaniu z Fe65⁷. Zasugerowaliśmy, że ubiquilin-1 zapobiega niewłaściwym oddziaływaniom między- i wewnątrzmolekularnym AICD, zapobiegając agregacji in vitro oraz w nienaruszonych komórkach⁴. Podczas gdy większość badań koncentruje się na roli APP w patogenezie AD, rola AICD w tym procesie nie jest jasna. Wykazano, że ekspresja AICD indukuje apoptozę⁸, moduluje szlaki sygnalizacyjne⁹ i reguluje sygnalizację wapniową¹⁰. Nadekspresja AICD i Fe65 w transgenicznym modelu mysim indukuje patologię przypominającą chorobę Alzheimera¹¹, a niedawno AICD została wykryta w lizatach mózgu metodą western blotting przy zastosowaniu odpowiednich technik odzyskiwania antygenu¹². Aby ułatwić badania strukturalne, biochemiczne i biofizyczne AICD, opracowaliśmy procedurę rekombinacyjnej produkcji dużych ilości wysokiej czystości białka AICD. Ponadto opisujemy metodę indukcji termicznej agregacji AICD in vitro oraz analizę przy użyciu mikroskopii sił atomowych. Opisane metody są przydatne do charakterystyki biochemicznej, biofizycznej i strukturalnej AICD oraz badania wpływu molekularnych chaperonin na agregację AICD.

Protokół

1. Ekspresja rekombinowanej domeny wewnątrzkomórkowej białka APP (AICD)

1. Przeprowadź transformację szczepu E. coli BL21 ludzkim AICD (pozostałości 649-695 APP, numeracja izoformy neuronalnej) sklonowanego do wektora pGEX-4T-1 (GE Healthcare). Wektor ten spowoduje ekspresję AICD jako części C-końcowej białka fuzyjnego z transferazą S-glutationową (GST). Wektor ten koduje również sekwencję cięcia trombiną, aby ułatwić usunięcie części GST. Szczegóły klonowania AICD do pGEX-4T-1 znajdują się w naszej poprzedniej publikacji⁴.
2. Z pojedynczej kolonii zaszczep 10 ml bulionu LB z ampicyliną (100 μg/ml) i inkubuj przez noc w temperaturze 37 °C przy intensywnym wytrząsaniu.
3. Następnego ranka zaszczep 400 ml LB/ampicyliny w kolbie o pojemności jednego litra za pomocą 5 ml kultury nocnej.
4. Inkubuj w temperaturze 37 °C przy intensywnym wytrząsaniu, aż gęstość optyczna przy 600 nm osiągnie wartość od 0,4 do 0,6. Zazwyczaj zajmuje to od 2 do 2,5 hr.

Na tym etapie warto pobrać małą próbkę (~10 μl), aby monitorować proces oczyszczania za pomocą SDS-PAGE (patrz Rysunek 1A,B). Z każdego kolejnego etapu oczyszczania należy również pobrać małą alikwot do analizy metodą SDS-PAGE.

5. Indukować ekspresję GST-AICD poprzez dodanie 0,4 mM izopropyl-beta-D-tiogalaktopiranozydu (IPTG). Inkubować w temperaturze 37 °C przy intensywnym wytrząsaniu przez 5 hr.
6. Wirować komórki z prędkością 6,000 x g przez 15 min w temperaturze 4 °C. Na tym etapie procedury osad komórkowy można przechowywać w temperaturze -80 °C przez kilka miesięcy.

2. Oczyszczanie GST-AICD

1. Przygotować 50 ml buforu do lizy w następujący sposób: 1 mM ditiotreitol, 1mM kwas etylenoaminotetraoctowy (EDTA), 0,1% Triton-X100, 1 mM fluorurek fenylometylosulfonylowy (PMSF), Complete protease inhibitor cocktail (Roche Applied Science) oraz bufor fosforanowo-solny (PBS). Schłodzić na lodzie.
2. Odmrozić osad bakteryjny (jeśli był wcześniej zamrożony) na lodzie.

Na tym etapie kluczowe jest, aby wszystkie kroki były wykonywane w temperaturze 4 °C w celu ograniczenia proteolizy. Wszystkie probówki, bufory i pozostałe odczynniki powinny być schłodzone. W przypadku użycia prasy francuskiej lub emulsyfikatora do lizy, urządzenia te również powinny być uprzednio schłodzone.

3. Dokładnie resuspenduj osad bakteryjny w 20 ml buforu do lizy. Połączenie mieszania w wirówce typu vortex oraz trituracji pipetą 10 ml na lodzie zapewni całkowitą resuspensję osadu.
4. Przepuść resuspendowane komórki bakteryjne przez emulsyfikator (np. Avestin EmulsiFlex-C3) lub prasę francuską, schłodzone wcześniej do 4 °C, przy ciśnieniu 30,000 psi. Przepuść lizat przez emulsyfikator po raz drugi. Zbierz lizat do schłodzonej wcześniej probówki 50 ml.

Główną zaletą tych dwóch instrumentów jest to, że minimalizują one nagrzewanie próbki. Powszechnie stosowana technika sonikacji generuje znaczną ilość ciepła na końcówce sondy sonikacyjnej, co może prowadzić do agregacji białek rekombinowanych.

5. Odwiruj lizat z prędkością 15,000 x g przez 30 min. Oddziel i przelej nadsącz do schłodzonej wcześniej probówki o pojemności 50 ml.
6. Dodaj 500 μl 50% zawiesiny agarozy z glutationem (Sigma-Aldrich). Inkubuj w rotatorze przez 30 min w temperaturze 4 °C. Podczas rotacji próbki przygotuj świeży bufor elucyjny: 50 mM Tris 7.8, 0.1% Triton-X100, 0.5 mM ditiotreitol, 10 mM zredukowany glutation.

Jedynym krokiem protokołu wykonywanym w temperaturze pokojowej jest etap elucji. W związku z tym bufor do elucji przechowuje się w temperaturze pokojowej. Bufor do elucji należy przygotować bezpośrednio przed użyciem.

7. Przelej lizat i zawiesinę do jednorazowej 5-calowej polistyrenowej kolumny chromatograficznej z grubymi filtrami (90-130 μm) (Evergreen Scientific). Przemyj kolumnę 5 razy 3 ml fosforanowego buforu solnego (PBS).
8. Zamknij dół kolumny i dodaj 500 μl buforu elucyjnego o temperaturze pokojowej. Zamknij górę kolumny i obracaj przez 5 min w temperaturze pokojowej. Zbierz eluat do schłodzonej probówki do mikrowirówki o pojemności 1,5 ml. Powtórz elucję jeszcze dwa razy (łącznie 1,5 ml eluatu).
9. Przeprowadź dializę eluatu za pomocą membrany dializacyjnej z progiem odcięcia 10 000 Da (np. kasety dializacyjne Thermo Scientific Slide-A-Lyzer) w 4 litrach fosforanowego buforu solnego przez noc w temperaturze 4 °C. Następnego dnia przeprowadź dializę przeciwko kolejnym 4 litrom fosforanowego buforu solnego w temperaturze 4 °C przez 1 h.
10. Przenieś białko z kasety dializacyjnej i wykonaj test ilościowy białka, aby określić wydajność GST-AICD. Typowe oczyszczanie z 400 ml hodowli daje wydajność >20 mg oczyszczonego białka przy stężeniach 10-20 mg/ml. Rozdziel białko na aliquoty po 200 μl i zamroź w temperaturze -80 °C.

3. Rozszczepienie GST-AICD przez trombinę i oczyszczanie AICD

1. Odmrozić 200 μl oczyszczonego GST-AICD i dodać 20 μl trombiny o stężeniu 1 U/μl. Inkubować przez noc w temperaturze 37 °C.

Jakość i czystość trombiny znacznie różnią się w zależności od producenta i mogą stanowić istotne źródło zanieczyszczeń. Stosujemy trombinę firmy GE Healthcare (patrz tabela odczynników). Po inkubacji przez noc, >95% białka fuzyjnego powinno zostać odcięte (Rysunek 1B).

2. Po całonocnym cięciu trombiną prawdopodobne jest, że część uwolnionego AICD uległa agregacji, przez co roztwór może być mętny. Usuń zagregowany materiał poprzez wirowanie przy 20,000 x g przez 30 min w temperaturze 4 °C. Przenieś nadsącz do schłodzonej wcześniej probówki do mikrowirówki.
3. Dodaj 50 μl 50% zawiesiny glutation-agarozy oraz 50 μl 50% zawiesiny p-aminobenzamidyną-agarozy, aby usunąć odpowiednio GST i trombinę. Inkubuj w rotacji przez 5 min w temperaturze pokojowej.
4. Wiruj krótko, aby osadzić kuleczki agarozy, a następnie przenieś nadsącz do nowej probówki. Usuń GST za pomocą glutation-agarozy jeszcze czterokrotnie. Pojedyncza ekstrakcja p-aminobenzamidyną-agarozą jest wystarczająca do usunięcia 20 U trombiny.
5. Wykonaj oznaczanie ilości białka na 5 μl oczyszczonego AICD. Typowe wydajności z 400 ml hodowli wynoszą 50-100 μg przy stężeniu od 0,2 do 0,5 mg/ml. Wyższe wydajności można uzyskać poprzez cięcie większych objętości GST-AICD.

Oczyszczony AICD należy przygotować bezpośrednio przed charakterystyką biochemiczną/biofizyczną. Niewykorzystany materiał należy zutylizować. Możliwe jest również zagęszczenie AICD poprzez liofilizację próbki i ponowne zawieszenie w mniejszej objętości buforu⁶. Jeśli wykrywanie AICD wymaga transferu (np. po metodzie filter trap lub w teście dot blot), należy przeprowadzić regenerację antygenu na membranie zgodnie z opisem Pimplikara i Suryanarayany¹².

4. Agregacja AICD do mikroskopii sił atomowych (AFM)

1. Świeżo przygotowany AICD rozcieńczyć w roztworze soli fizjologicznej z buforem fosforanowym do stężenia 0,1 mg/ml w końcowej objętości 15 μl. Na tym etapie można dodać różne związki i/lub białka, aby sprawdzić, czy hamują one agregację AICD. Przykładowo, wykazaliśmy w tym teście, że ekvimolarne stężenia ubiquilin-1 zapobiegają agregacji AICD⁴.

Możliwe jest również gromadzenie większych objętości reakcyjnych dla eksperymentów biochemicznych, takich jak testy z pułapką filtrową oraz rozpraszanie światła⁴. Pomyślnie przeprowadziliśmy testy z pułapką filtrową na mieszaninach reakcyjnych o objętości do 400 μl przy rozcieńczeniu AICD do stężeń tak niskich jak 1 μM.

2. Wywołaj agregację termiczną poprzez inkubację próbek w temperaturze 43 °C przy mieszaniu z prędkością 800 rpm w mikserze termicznym Eppendorf Thermomixer przez 48 hr. Temperaturę tę wybrano na podstawie testów chaperonowych badających agregację termiczną modelowego substratu chaperonowego, jakim jest syntaza cytrynianowa^4,13.

Agregacja termiczna jest powszechnie stosowaną metodą indukowania przejścia strukturalnego białka ze stanu natywnego w strukturę nienatywną (zazwyczaj bogatą w harmonijki beta), co prowadzi do tworzenia się agregatów międzycząsteczkowych. Agregację termiczną wykorzystuje się również do badania funkcji chaperonów molekularnych, które osłaniają segmenty hydrofobowe, zapobiegając tworzeniu nieprawidłowych oddziaływań międzycząsteczkowych (a tym samym opóźniając lub zapobiegając agregacji termicznej).

3. Próbkę rozcieńczyć 20-krotnie w wodzie dejonizowanej i nanieść 2 μl na świeżo łupaną mikę. Próbkę suszyć w eksyكاتهorze przez noc. Konieczne będzie empiryczne określenie optymalnego rozcieńczenia do obrazowania, dlatego zasadne byłoby przygotowanie kilku rozcieńczeń w zakresie od 10- do 100-krotnego.
4. Zaggregated AICD zwizualizować za pomocą AFM pracującego w trybie tapping mode¹⁴. Wykorzystane dźwigary to mikroostre dźwigary azotkowe pokryte złotem (MSNL, Bruker) o nominalnym promieniu wierzchołka 2 nm. Typowe amplitudy drgań podczas obrazowania wynoszą 10-20 nm przy częstotliwości rezonansowej dźwigarów (30-50 kHz).

Stwierdzono, że jakość obrazu i kontrast różnych agregatów białkowych zależały od przyłożonej siły oraz czasu trwania eksperymentu. Aby zminimalizować zaburzenia próbki powodowane przez sondę, utrzymywano stosunkowo niską siłę przyłożoną, zachowując stosunek set-point powyżej 95% i ograniczając skanowanie każdej próbki do 5-10 min. Przetwarzanie obrazów przeprowadzono za pomocą oprogramowania WSxM (Nanotec). Standardowe przetwarzanie obrazu obejmowało odejmowanie płaszczyzny i wyrównywanie (flattening). Nasze laboratoria wykorzystują własnej konstrukcji AFM¹⁵ zintegrowany z komercyjnym systemem sterowania mikroskopem sondowym (Nanotec).

5. Reprezentatywne wyniki

Ekspresja i względne wzbogacenie GST-AICD przedstawione są na Rysunku 1A. Po lizie większość białka fuzyjnego znajduje się w frakcji rozpuszczalnej, w związku z czym ekstrakcja z ciałek inkluzyjnych nie jest wymagana. Materiał eluowany z kolumny z agarozą glutationową jest czysty w >95%. W preparacie pokazanym na Rysunku 1 stężenie białka eluowanego z kolumny wynosiło 14,5 mg/ml, a wydajność wyniosła 22 mg (z kultury początkowej o objętości 400 ml). Nocne trawienie 200 μl tego preparatu przy użyciu 20 U trombiny doprowadziło do niemal 100% rozszczepienia białka fuzyjnego (Rysunek 1B). Ilość użytej trombiny jest na tyle niska, że nie jest ona wykrywalna w barwieniu błękitem Coomassie (patrz ścieżka „Cleaved”, Rysunek 1B). Usunięcie trombiny i GST spowodowało pewną utratę materiału, jednak był on czysty w >90%, a wydajność w tym preparacie wyniosła 70 μg AICD przy stężeniu 0,35 mg/ml. Rysunek 1C przedstawia schemat agregacji AICD i późniejszej analizy. Agregaty AICD obrazowane za pomocą AFM mają zazwyczaj kształt sferoidalny/amorficzny, a ich rozmiar mieści się w przedziale od 50 do 100 nm (Rysunek 1D,F). Materiał zagregowany nie jest wykrywalny, gdy do reakcji agregacji dodano ekimolarną ilość chaperonu ubikwiliny-1 (Rysunek 1E)⁴.

Rycina 1. Oczyszczanie i agregacja AICD. A) Barwienie Coomassie blue próbek pobranych na każdym etapie procesu oczyszczania. W przypadku próbek nieindukowanych i indukowanych na żelu naniesiono 20 μl całkowitej masy bakterii. Dla frakcji nadsączu na żelu naniesiono 5 μl lizatu (z całkowitej objętości 20 ml). W przypadku frakcji osadu, osad zawieszono ponownie w 20 ml buforu do lizy, a 5 μl tego materiału poddano sonikacji w kąpieli ultradźwiękowej przez 30 min w 4 °C przed naniesieniem na żel. Dla frakcji przepływowej na żelu naniesiono 5 μl. Wskazano ilości eluatu naniesione na żel. B) Żel barwiony Coomassie blue dla nieciętego i ciętego GST-AICD (2 μl) oraz 1 i 5 μl oczyszczonego AICD. C) Schemat blokowy oczyszczania, agregacji i analizy AICD. D, E) Reprezentatywny obraz AFM termicznie zagregowanego AICD wobec braku (D) i obecności (E) chaperonu molekularnego ubikwiliny-1. F) Histogram rozkładu wielkości agregatów AICD.

Dyskusja

W niniejszym protokole przedstawiliśmy procedurę otrzymywania AICD o wysokiej czystości do analiz strukturalnych, biofizycznych i biochemicznych. Procedura ta nie wymaga zaawansowanego sprzętu chromatograficznego, dzięki czemu jest dostępna dla większości laboratoriów. Inne grupy oczyszczały AICD^5-7,16, w tym GST-AICD^17-19, na potrzeby analiz biochemicznych i strukturalnych. Wadami poprzednich protokołów były słaba rozpuszczalność AICD¹⁶, nieidealna czystość¹⁷ oraz konieczność ...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
pGEX-4T-1	GE Healthcare	28-9545-49
Trombina	GE Healthcare	27-0846-01
Ampicylina	Fisher Scientific	BP1760
Odczynnik do oznaczania białek metodą Bradforda	Bio-Rad	500-0002
Błękit Coomassie	Bio-Rad	161-0786
IPTG (izopropyl-beta-D-tiogalaktopiranozyd)	Sigma-Aldrich	I6758
Agaroza z glutationem	Sigma-Aldrich	G4510
Agaroza z p-aminobenzamidyną	Sigma-Aldrich	A7155
Kompletny koktajl inhibitorów proteaz	Roche	11836170001
Kasety do dializy Slide-A-Lyzer	Thermo Scientific	66380
Kolumny chromatograficzne	Evergreen Scientific	208-3367-050
Emulgator	Avestin, Inc	EmulsiFlex-C3	Wysoce zalecany
Eppendorf Thermomixer	Eppendorf	022670107
Dyski mikowe	Ted Pella	50-12
Zanurzenia AFM	Bruker	MSNL-10
Oprogramowanie WSxM	Nanotec	N/A	Bezpłatne pobieranie