Artykuł metodologiczny

Izolacja jąder kardiomiocytów z tkanki pośmiertnej

16.7K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/4205

⸱

10 lipca 2012

 , 
1Strategic Research Center for Stem Cell Biology and Cell Therapy, University of Lund, 2Department of Cardiology Lund University Hospital, University of Lund

W tym artykule

Podsumowanie

Jądra komórek serca są izolowane metodą sedymentacji gęstościowej i znakowane immunologicznie przeciwciałami przeciwko materiałowi pericentriolarnemu 1 (PCM-1) w celu identyfikacji i sortowania jąder kardiomiocytów za pomocą cytometrii przepływowej.

Streszczenie

Identyfikacja jąder kardiomiocytów w skrawkach tkanek stanowiła dotąd wyzwanie, ponieważ większość strategii opiera się wyłącznie na białkach markerowych cytoplazmy1. Rzadkie zdarzenia w miocytach serca, takie jak proliferacja i apoptoza, wymagają dokładnej identyfikacji jąder miocytów serca w celu analizy odnowy komórkowej w stanie homeostazy oraz w warunkach patologicznych2. W niniejszej pracy przedstawiamy metodę izolacji jąder kardiomiocytów z tkanek pobranych po śmierci za pomocą sedymentacji gęstościowej i immunoznakowania przeciwciałami przeciwko białku materiału pericentryjolarnego 1 (PCM-1), a następnie sortowania metodą cytometrii przepływowej. Strategia ta umożliwia wysokoprzepustową analizę i izolację, z zaletą polegającą na równiej skuteczności w przypadku tkanek świeżych oraz zamrożonego materiału archiwalnego. Pozwala to na badanie materiałów zgromadzonych już w biobankach. Technika ta jest stosowalna i została przetestowana u szerokiego spektrum gatunków oraz nadaje się do wielu zastosowań w dalszych etapach analiz, takich jak datowanie węglem-143, analiza cyklu komórkowego4, wizualizacja analogów tymidyny (np. BrdU i IdU)4, a także analiza transkryptomiczna i epigenetyczna.

Protokół

1. Izolacja jąder komórkowych serca

  1. Pokryj probówki do ultrawirówki (Beckman Centrifuge Tubes #363664) 10 ml roztworu pokrywającego 1%BSA/PBS. Zakręć probówki i pozostaw je do rotacji przez 30 min w rotatorze do probówek. Usuń roztwór pokrywający i pozostaw probówki do wyschnięcia na powietrzu (do analizy pojedynczych serc mysich wymagana jest jedna probówka na jedno serce mysie; alternatywnie w jednej probówce można przetworzyć do 5 serc mysich lub 1 g tkanki serca innego gatunku (np. ludzkiego)).
  2. Wszystkie kolejne kroki należy przeprowadzać na lodzie. Wypreparuj lewą komorę ze świeżego lub błyskawicznie zamrożonego serca mysiego za pomocą skalpela. Uwaga: niniejszy protokół jest zoptymalizowany dla serca mysiego, ale może zostać dostosowany również do serca szczura lub człowieka. Alternatywnie użyj do 1 g tkanki serca innego gatunku.
  3. Pokrój preparat skalpelem na małe kostki.
  4. Przenieś fragmenty tkanki do probówki Falcon 50 ml wypełnionej 15 ml buforu lizującego.
  5. Zhomogenizuj tkankę serca za pomocą homogenizatora z głowicą T-25 Ultra-Turrax (IKA) przy 24 000 rpm przez 10 sek.
  6. Rozcieńcz homogenat równą objętością buforu lizującego do 30 ml.
  7. Użyj szklanego douncera (40 ml), aby dalej zhomogenizować tkankę i uwolnić jądra komórkowe. Wykonaj osiem pociągnięć tłokiem o dużym prześwicie.
  8. Przepuść surowy izolat jąder przez nylonowe sitka komórkowe (BD Biosciences) o oczkach 100 μm i 70 μm, kolejno.
  9. Odwiruj surowy izolat jąder w wirówce chłodzącej (4 °C) przy 700 x g przez 10 min.
  10. Ostrożnie usuń naddatek, odwracając probówki, i wytrzyj wnętrze probówki ręcznikiem papierowym. Zachowaj ostrożność, aby nie naruszyć osadu jąder.
  11. Rozpuść surowy izolat jąder w 5 ml buforu sacharozowego, pipetując roztwór kilkakrotnie w górę i w dół. Dodaj kolejne 25 ml buforu sacharozowego do rozpuszczonego osadu.
  12. Dodaj 10 ml świeżo przygotowanego buforu sacharozowego do pokrytej probówki do ultrawirówki (patrz krok 1.1).
  13. Ostrożnie nałóż resuspenderowany osad jąder rozpuszczony w buforze sacharozowym z kroku 1.9 na dodane 10 ml buforu sacharozowego.
  14. Zrównoważ probówki do wirowania przed umieszczeniem ich w rotorze wolnoobrotowym JS13.1, a następnie umieść rotor w wirówce wysokoprędkościowej (Beckman Avanti S-25).
  15. Wiruj próbkę jąder przy 13 000 x g w temperaturze 4 °C przez 60 min.
  16. Po zakończeniu wirowania ostrożnie wyjmij probówki z rotora i usuń naddatek, odwracając probówki i wycierając pozostałe zanieczyszczenia z wnętrza probówek ręcznikiem papierowym.
  17. Rozpuść osad jąder w 1 ml buforu do przechowywania jąder (bufor NSB plus). Uwaga: NSB plus zawiera 1,5 mM sperminy jako stabilizatora DNA.
  18. Przejdź do kroku 2.1: immunobarwienia jąder kardiomiocytów.

2. Immunobarwienie do cytometrii przepływowej

  1. Przygotować kontrolę negatywną do immunobarwienia. Odpipować 20 μl próbki jąder komórkowych i dodać 980 μl buforu NSB plus.
  2. Do próbki jąder komórkowych dodać przeciwciało anty-materiał pericentriolarny 1 (rabbit anti-PCM-1, Atlas Antibodies) w rozcieńczeniu 1:500 w celu immunoznakowania jąder kardiomiocytów. Do kontroli negatywnej, przygotowanej w kroku 2.1, dodać przeciwciało izotypowe w tym samym rozcieńczeniu co przeciwciało anty-PCM-1.
  3. Inkubować kontrolę negatywną oraz próbkę w temperaturze 4 °C przez noc.
  4. Przepłukać kontrolę negatywną i próbkę co najmniej raz buforem NSB plus (wirować probówki w wirówce chłodzącej (4 °C) przy 700 x g przez 10 min. Odlać nadsącz i zawiesić osad jąder w 1 ml buforu NSB plus).
  5. Do kontroli negatywnej oraz próbki dodać fluorescencyjne przeciwciało wtórne anty-królicze (FITC lub APC) w rozcieńczeniu 1:1000.
  6. Inkubować kontrolę negatywną oraz próbkę w temperaturze 4 °C przez 1 h.
  7. Przepłukać kontrolę negatywną i próbkę co najmniej raz buforem NSB plus (wirować probówki w wirówce chłodzącej (4 °C) przy 700 x g przez 10 min. Odlać nadsącz i zawiesić osad jąder w 1 ml buforu NSB plus).
  8. Przejść do analizy i sortowania metodą cytometrii przepływowej.

3. Cytometria przepływowa

  1. Przed rozpoczęciem sortowania metodą cytometrii przepływowej pokryć probówki do zbierania jąder (Falcon 15 ml) 1% roztworem BSA/PBS, zgodnie z opisem w kroku 1.1.
  2. Przefiltrować próbkę oraz kontrolę negatywną przez sito komórkowe o oczkach 30 μm, a następnie w pierwszej kolejności załadować kontrolę negatywną do cytometru przepływowego (BD Influx). Wyznaczyć pierwszą i drugą bramkę w celu odseparowania jąder i singletów (pojedynczych jąder), w oparciu o rozproszenie przednie (FSC), szerokość impulsu rozproszenia przedniego (FS pulse width) oraz rozproszenie boczne (SSC) (Ryc. 2a i b). Dodanie barwnika DNA (DRAQ5 (1:500)) do próbki może pomóc w wstępnej identyfikacji populacji jąder.
  3. Załadować próbkę immunoznakowaną i wyznaczyć trzecią bramkę, aby odizolować jądra kardiomiocytów (PCM-1-dodatnie) od jąder niekardiomiocytów (PCM-1-ujemnych). Rozpocząć sortowanie (Ryc. 2c i d).

Opcjonalnie: W celu analizy zawartości DNA jądrowego (ploidalności) oraz przeprowadzenia analizy cyklu komórkowego należy dodać do jąder odpowiedni barwnik DNA (np. Hoechst 33342 lub DRAQ5) (Rys. 2e).

  1. Po sortowaniu metodą cytometrii przepływowej umieść jądra na lodzie i przeprowadź ponowną analizę w celu określenia czystości sortowania (Ryc. 3a i b).
  2. Odwiruj posortowane jądra w probówkach kolekcjonerskich z prędkością 1500 x g w wirówce chłodzącej przez 15 min.
  3. Rozpuść osad z jąder w buforze odpowiednim dla zastosowania w dalszych etapach analizy.

4. Reprezentatywne wyniki

Morfologię i integralność jąder można ocenić za pomocą barwników DNA i zwizualizować pod mikroskopem (Rys. 1). Poprawność znakowania PCM-1 można ocenić za pomocą mikroskopii epifluorescencyjnej oraz cytometrii przepływowej (Rys. 1 oraz Rys. 2c i d). Populacje PCM-1-dodatnie i PCM-1-ujemne powinny być wyraźnie od siebie oddzielone (Rys. 2c i d). W lewej komorze serca myszy około 30% wszystkich jąder powinno stanowić jądra kardiomiocytów (Rys. 2d). Czystość sortowania można ocenić poprzez ponowną analizę posortowanych jąder (Rys. 3a i b). Obie populacje jąder powinny charakteryzować się czystością sortowania przekraczającą 95%.

Mikroskopia fluorescencyjna, analiza ekspresji białek; jądra komórkowe, markery PCM-1, Nkx2.5, badanie komórkowe.
Rycina 1. PCM-1 identyfikuje jądra kardiomiocytów. Jądra kardiomiocytów (a) barwiono przeciwciałami przeciwko PCM-1 (b) oraz Nkx2.5 (c) w sercu dorosłej myszy. (d) Jądra znakowane PCM-1 są otoczone cytoplazmą kardiomiocytów (ciężkie łańcuchy miozyny (MHC)) i wykazują ekspresję czynnika transkrypcyjnego Nkx2.5, co potwierdza dokładną identyfikację jąder kardiomiocytów za pomocą barwienia PCM-1 (paski skali 20 μm i 10 μm (d, wstawka)). (e) Izolowane jądra komórek serca wizualizowane przy użyciu barwnika DNA DRAQ5. (f i g) Jądra kardiomiocytów znakowane przeciwciałami przeciwko PCM-1 (pasek skali 10 μm). Zwróć uwagę na epinuklearny wzorzec barwienia PCM-1 w jądrach miocytów w przekroju tkankowym oraz w izolowanych jądrach (strzałki).

Analiza cytometryczna; wykresy rozrzutu ilustrujące populacje komórek; histogram zawartości DNA.
Rycina 2. Sortowanie cytometryczne jąder kardiomiocytów. (a) Jądra komórek serca są identyfikowane na podstawie rozproszenia światła w przodzie (FSC) i rozproszenia bocznego (SSC). (b) Drugi bramka identyfikuje pojedyncze jądra na podstawie FSC i szerokości impulsu FS5. (c, d) Bramkowanie fluorescencyjne umożliwia oddzielenie jąder kardiomiocytów (PCM-1-dodatnich) od jąder niebędących kardiomiocytami (PCM-1-ujemnych) z tkanki serca. (e) Kardiomiocyty mysie są w większości (>80%) diploidalne (2n), tylko niewielka podgrupa jest tetraploidalna (4n)6. Należy zauważyć, że kardiomiocyty ludzkie zawierają wyższą częstotliwość jąder poliploidalnych (>2n)7,8.

Porównanie wykresów rozproszenia cytometrii przepływowej; PCM-1 vs SSC; schemat analizy populacji komórkowych.
Rycina 3. Analiza czystości wyselekcjonowanych jąder kardiomiocytów i jąder niebędących kardiomiocytami. Ponowna analiza wyselekcjonowanych jąder niebędących kardiomiocytami (a) oraz jąder kardiomiocytów (b). Obie populacje wykazują czystość sortowania przekraczającą 99%.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Dokładna identyfikacja jąder kardiomiocytów jest kluczowa dla analizy procesów regeneracyjnych w mięśniu sercowym2,3. Konwencjonalne techniki izolacji kardiomiocytów z tkanki świeżej opierają się głównie na enzymatycznym trawieniu białek macierzy zewnątrzkomórkowej i późniejszym oczyszczaniu z komórek śródmiąższowych za pomocą wirowania przy niskich prędkościach. Dalsze oczyszczanie żywych kardiomiocytów z embrionalnych komórek macierzystych (ESC) można przeprowadzić poprzez immunoznakowanie markerami powierzc...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Nie zgłoszono żadnych konfliktów interesów.

Podziękowania

Pragniemy podziękować Marcelo Toro za pomoc przy analizie cytometrii przepływowej. Badanie to było wspierane przez Szwedzką Fundację Serca i Płuc (Swedish Heart- and Lung Foundation), program Komisji Europejskiej FP7 „CardioCell”, Szwedzką Radę Badawczą (Swedish Research Council), AFA insurances oraz ALF. O.B. otrzymał wsparcie z Deutsche Forschungsgemeinschaft.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
1. Bufor lizujący
Nazwa odczynnika
0.32 M sacharozy
10 mM Tris-HCl (pH = 8)
5 mM CaCl2
5 mM octanu magnezu
2.0 mM EDTA
0.5 mM EGTA
1 mM DTT
2. Bufor sacharozowy
Nazwa odczynnika
2.1 M sacharozy
10 mM Tris-HCl (pH = 8)
5 mM octanu magnezu
1 mM DTT
3. Bufor do przechowywania jąder (NSB plus)
Nazwa odczynnika
0.44 M sacharozy
10 mM Tris-HCl (pH = 7.2)
70 mM KCl
10 mM MgCl2
1.5 mM sperminy
Królicze IgG izotypowe - klasy ChIP, #ab37415Abcam
Królicze przeciwciało przeciwko PCM-1, #HPA023374Atlas Antibodies
Osiołkowe przeciwciało wtórne, przeciwkrólicze Alexa 488 Fluor, #A-21206 lub równoważne fluorescencyjne przeciwciało wtórneLife Technologies
DRAQ5Biostatus
sitka do komórek 30 μm, 70 μm i 100 μmBD Biosciences
Szklany homogenizator typu douncer (40 ml) i tłuczek "L"VWR (Wheaton Industries Inc.)
Homogenizator T-25 Ultra-TurraxIKA Germany
Narzędzie dyspergujące S25 N-18 GIKA Germany
Wirówka Beckman AvantiBeckman Coulter
Probówki Falcon 15 ml i 50 mlVWR
Probówki do wirówki Beckman #363664Beckman Coulter
Rotor wolnoobrotowy JS13.1Beckman Coulter
Cytometr przepływowy InfluxBeckman Coulter
Rotator do probówekVWR

Bibliografia

  1. Ang, K. L. Limitations of conventional approaches to identify myocyte nuclei in histologic sections of the heart. American journal of physiology. Cell physiology. , 298-1603 (2010).
  2. Bergmann, O. Identification of cardiomyocyte nuclei and assessment of ploidy for the analysis of cell turnover. Experimental cell research. 327, 188-194 (2011).
  3. Bergmann, O. Evidence for Cardiomyocyte Renewal in Humans. Science. 324, 98-102 (1126).
  4. Walsh, S. Cardiomyocyte cell cycle control and growth estimation. Cardiovascular Research. , 1-31 (2010).
  5. Spalding, K., Bhardwaj, R. D., Buchholz, B., Druid, H., Frisén, J. Retrospective birth dating of cells in humans. Cell. 122, 133-143 (2005).
  6. Adler, C. P., Friedburg, H., Herget, G. W., Neuburger, M., Schwalb, H. Variability of cardiomyocyte DNA content, ploidy level and nuclear number in mammalian hearts. Virchows Arch. 429, 159-164 (1996).
  7. Herget, G. W., Neuburger, M., Plagwitz, R., Adler, C. P. DNA content, ploidy level and number of nuclei in the human heart after myocardial infarction. Cardiovascular Research. 36, 45-51 (1997).
  8. Adler, C. P., Friedburg, H. Myocardial DNA content. ploidy level and cell number in geriatric hearts: postmortem examinations of human myocardium in old age. Mol. Cell Cardiol. 18, 3953-39 (1986).
  9. Dubois, N. C. SIRPA is a specific cell-surface marker for isolating cardiomyocytes derived from human pluripotent stem cells. Nature. 29, 1011-1018 (2011).
  10. Hattori, F. Nongenetic method for purifying stem cell-derived cardiomyocytes. Nature Methods. 7, 61-66 (2010).
  11. Fransioli, J. Evolution of the c-kit-Positive Cell Response to Pathological Challenge in the Myocardium. Stem Cells. 26, 1315-1324 (2008).
  12. Elliott, D. A. NKX2-5(eGFP/w) hESCs for isolation of human cardiac progenitors and cardiomyocytes. Nature Methods. 8, 1037-1040 (2011).
  13. Laflamme, M. A. Evidence for Cardiomyocyte Repopulation by Extracardiac Progenitors in Transplanted Human Hearts. Circulation Research. 90, 634-640 (2002).
  14. Srsen, V., Fant, X., Heald, R., Rabouille, C., Merdes, A. Centrosome proteins form an insoluble perinuclear matrix during muscle cell differentiation. BMC cell biology. 10, 28(2009).
  15. Spoelgen, R. A novel flow cytometry-based technique to measure adult neurogenesis in the brain. Journal of neurochemistry. 119, 165-175 (2011).
  16. Soonpaa, M. H., Kim, K. K., Pajak, L., Franklin, M., Field, L. J. Cardiomyocyte DNA synthesis and binucleation during murine development. The American journal of physiology. 271, H2183-H2189 (1996).
  17. Olivetti, G. Aging, cardiac hypertrophy and ischemic cardiomyopathy do not affect the proportion of mononucleated and multinucleated myocytes in the human heart. J Mol Cell Cardiol. 28, 1463-1477 (1996).
  18. Okada, S. Flow cytometric sorting of neuronal and glial nuclei from central nervous system tissue. Journal of cellular physiology. 226, 552-558 (2011).
  19. Matevossian, A., Akbarian, S. Neuronal Nuclei Isolation from Human Postmortem Brain Tissue. J. Vis. Exp. (20), e914(2008).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Izolacja j der kardiomiocyt wsedymentacja g sto ciowaimmunoznakowanie PCM 1sortowanie przep ywoweoczyszczanie j derprotok ultrawirowaniabufor do przechowywania j derfluorescencyjne przeciwcia o wt rneanaliza zawarto ci DNA

Powiązane artykuły