Jądra komórek serca są izolowane metodą sedymentacji gęstościowej i znakowane immunologicznie przeciwciałami przeciwko materiałowi pericentriolarnemu 1 (PCM-1) w celu identyfikacji i sortowania jąder kardiomiocytów za pomocą cytometrii przepływowej.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Izolacja jąder kardiomiocytów z tkanki pośmiertnej
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Identyfikacja jąder kardiomiocytów w skrawkach tkanek stanowiła dotąd wyzwanie, ponieważ większość strategii opiera się wyłącznie na białkach markerowych cytoplazmy1. Rzadkie zdarzenia w miocytach serca, takie jak proliferacja i apoptoza, wymagają dokładnej identyfikacji jąder miocytów serca w celu analizy odnowy komórkowej w stanie homeostazy oraz w warunkach patologicznych2. W niniejszej pracy przedstawiamy metodę izolacji jąder kardiomiocytów z tkanek pobranych po śmierci za pomocą sedymentacji gęstościowej i immunoznakowania przeciwciałami przeciwko białku materiału pericentryjolarnego 1 (PCM-1), a następnie sortowania metodą cytometrii przepływowej. Strategia ta umożliwia wysokoprzepustową analizę i izolację, z zaletą polegającą na równiej skuteczności w przypadku tkanek świeżych oraz zamrożonego materiału archiwalnego. Pozwala to na badanie materiałów zgromadzonych już w biobankach. Technika ta jest stosowalna i została przetestowana u szerokiego spektrum gatunków oraz nadaje się do wielu zastosowań w dalszych etapach analiz, takich jak datowanie węglem-143, analiza cyklu komórkowego4, wizualizacja analogów tymidyny (np. BrdU i IdU)4, a także analiza transkryptomiczna i epigenetyczna.
Protokół
1. Izolacja jąder komórkowych serca
- Pokryj probówki do ultrawirówki (Beckman Centrifuge Tubes #363664) 10 ml roztworu pokrywającego 1%BSA/PBS. Zakręć probówki i pozostaw je do rotacji przez 30 min w rotatorze do probówek. Usuń roztwór pokrywający i pozostaw probówki do wyschnięcia na powietrzu (do analizy pojedynczych serc mysich wymagana jest jedna probówka na jedno serce mysie; alternatywnie w jednej probówce można przetworzyć do 5 serc mysich lub 1 g tkanki serca innego gatunku (np. ludzkiego)).
- Wszystkie kolejne kroki należy przeprowadzać na lodzie. Wypreparuj lewą komorę ze świeżego lub błyskawicznie zamrożonego serca mysiego za pomocą skalp....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Dokładna identyfikacja jąder kardiomiocytów jest kluczowa dla analizy procesów regeneracyjnych w mięśniu sercowym2,3. Konwencjonalne techniki izolacji kardiomiocytów z tkanki świeżej opierają się głównie na enzymatycznym trawieniu białek macierzy zewnątrzkomórkowej i późniejszym oczyszczaniu z komórek śródmiąższowych za pomocą wirowania przy niskich prędkościach. Dalsze oczyszczanie żywych kardiomiocytów z embrionalnych komórek macierzystych (ESC) można przeprowadzić poprzez immunoznakowanie markerami powierzc.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Nie zgłoszono żadnych konfliktów interesów.
Podziękowania
Pragniemy podziękować Marcelo Toro za pomoc przy analizie cytometrii przepływowej. Badanie to było wspierane przez Szwedzką Fundację Serca i Płuc (Swedish Heart- and Lung Foundation), program Komisji Europejskiej FP7 „CardioCell”, Szwedzką Radę Badawczą (Swedish Research Council), AFA insurances oraz ALF. O.B. otrzymał wsparcie z Deutsche Forschungsgemeinschaft.
....Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| 1. Bufor lizujący | |||
| Nazwa odczynnika | |||
| 0.32 M sacharozy | |||
| 10 mM Tris-HCl (pH = 8) | |||
| 5 mM CaCl2 | |||
| 5 mM octanu magnezu | |||
| 2.0 mM EDTA | |||
| 0.5 mM EGTA | |||
| 1 mM DTT | |||
| 2. Bufor sacharozowy | |||
| Nazwa odczynnika | |||
| 2.1 M sacharozy | |||
| 10 mM Tris-HCl (pH = 8) | |||
| 5 mM octanu magnezu | |||
| 1 mM DTT | |||
| 3. Bufor do przechowywania jąder (NSB plus) | |||
| Nazwa odczynnika | |||
| 0.44 M sacharozy | |||
| 10 mM Tris-HCl (pH = 7.2) | |||
| 70 mM KCl | |||
| 10 mM MgCl2 | |||
| 1.5 mM sperminy | |||
| Królicze IgG izotypowe - klasy ChIP, #ab37415 | Abcam | ||
| Królicze przeciwciało przeciwko PCM-1, #HPA023374 | Atlas Antibodies | ||
| Osiołkowe przeciwciało wtórne, przeciwkrólicze Alexa 488 Fluor, #A-21206 lub równoważne fluorescencyjne przeciwciało wtórne | Life Technologies | ||
| DRAQ5 | Biostatus | ||
| sitka do komórek 30 μm, 70 μm i 100 μm | BD Biosciences | ||
| Szklany homogenizator typu douncer (40 ml) i tłuczek "L" | VWR (Wheaton Industries Inc.) | ||
| Homogenizator T-25 Ultra-Turrax | IKA Germany | ||
| Narzędzie dyspergujące S25 N-18 G | IKA Germany | ||
| Wirówka Beckman Avanti | Beckman Coulter | ||
| Probówki Falcon 15 ml i 50 ml | VWR | ||
| Probówki do wirówki Beckman #363664 | Beckman Coulter | ||
| Rotor wolnoobrotowy JS13.1 | Beckman Coulter | ||
| Cytometr przepływowy Influx | Beckman Coulter | ||
| Rotator do probówek | VWR |
Bibliografia
- Ang, K. L. Limitations of conventional approaches to identify myocyte nuclei in histologic sections of the heart. American journal of physiology. Cell physiology. , 298-1603 (2010).
- Bergmann, O.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
