Nowa metoda badań przesiewowych dla ukierunkowanej ewolucji termostabilnych enzymów bakteriolitycznych

Summary

Nowatorska metoda ukierunkowanej ewolucji, specyficzna dla dziedziny inżynierii termostabilności, została opracowana i w konsekwencji zweryfikowana dla enzymów bakteriolitycznych. Po zaledwie jednej rundzie losowej mutagenezy, wyewoluowany enzym bakteriolityczny, PlyC 29C3, wykazał ponad dwukrotnie większą aktywność resztkową w porównaniu z białkiem typu dzikiego po inkubacji w podwyższonej temperaturze.

Abstract

Ukierunkowana ewolucja jest definiowana jako metoda wykorzystania doboru naturalnego w celu zmodyfikowania białek tak, aby uzyskały określone właściwości, które nie są związane z białkiem w naturze. W literaturze można znaleźć wiele przykładów dotyczących zastosowania ukierunkowanej ewolucji w celu skutecznej zmiany specyficzności molekularnej i^katalizy1. Podstawowa zaleta wykorzystania ukierunkowanej ewolucji zamiast bardziej racjonalnych podejść w inżynierii molekularnej odnosi się do ilości i różnorodności wariantów, które można przebadać². Jednym z możliwych zastosowań ewolucji ukierunkowanej jest poprawa stabilności strukturalnej enzymów bakteriolitycznych, takich jak endolizyny. Bakteriofagi kodują i wyrażają endolizyny w celu hydrolizy krytycznego wiązania kowalencyjnego w peptydoglikanie (tj. ścianie komórkowej) bakterii, co powoduje lizę komórek gospodarza i uwolnienie wirionów potomnych. Warto zauważyć, że enzymy te mają zdolność do zewnętrznego wywoływania lizy do wrażliwych bakterii pod nieobecność fagów, a ponadto zostały potwierdzone zarówno in vitro, jak i in vivo pod kątem ich potencjału terapeutycznego^3-5. Przedmiotem naszego ukierunkowanego badania ewolucji jest endolizyna PlyC, która składa się z podjednostek^PlyCA i PlyCB 6. Po oczyszczeniu i dodaniu zewnętrznym holoenzym PlyC lizuje paciorkowce grupy A (GAS), a także inne grupy paciorkowcowe w ciągu kilku sekund, a ponadto został zwalidowany in vivo pod kątem GAS⁷. Co istotne, monitorowanie kinetyki pozostałości enzymu po inkubacji w podwyższonej temperaturze dostarcza wyraźnych dowodów na to, że PlyC gwałtownie traci aktywność lityczną w temperaturze 45 °C, co sugeruje krótki okres trwałości terapeutycznej, co może ograniczać dalszy rozwój tego enzymu. Dalsze badania wykazały, że brak stabilności termicznej obserwuje się tylko dla podjednostki PlyCA, podczas gdy podjednostka PlyCB jest stabilna do ~90 °C (obserwacja niepublikowana). Oprócz PlyC w literaturze istnieje kilka przykładów opisujących termolabilny charakter endolizyn. Na przykład endolizyny Staphylococcus aureus LysK i endolizyny Streptococcus pneumoniae Cpl-1 i Pal tracą aktywność spontanicznie w temperaturze 42 °C, 43,5 °C i 50,2 °C, odpowiednio^8-10. Zgodnie z równaniem Arrheniusa, które wiąże szybkość reakcji chemicznej z temperaturą panującą w danym układzie, wzrost termostabilności będzie korelował ze wzrostem oczekiwanej długości okresu trwałości¹¹. W tym celu wykazano, że ewolucja ukierunkowana jest użytecznym narzędziem do zmiany aktywności termicznej różnych cząsteczek w przyrodzie, ale nigdy ta konkretna technologia nie została skutecznie wykorzystana do badania enzymów bakteriolitycznych. Podobnie, nie istnieją żadne udane doniesienia o postępach w zakresie stabilności strukturalnej tej konkretnej klasy środków przeciwdrobnoustrojowych. W tym filmie stosujemy nowatorską metodologię, która wykorzystuje podatną na błędy polimerazę DNA, a następnie zoptymalizowany proces przesiewowy przy użyciu 96-dołkowej płytki mikromiareczkowej w celu identyfikacji mutacji w podjednostce PlyCA endolizyny paciorkowcowej PlyC, które korelują ze wzrostem stabilności kinetycznej enzymu (Figura 1). Wyniki uzyskane po zaledwie jednej rundzie mutagenezy losowej sugerują, że metodologia generuje warianty PlyC, które zachowują ponad dwukrotnie większą aktywność resztkową w porównaniu z PlyC typu dzikiego (WT) po poddanych działaniu substancji w podwyższonej temperaturze.

Protocol

1. Określanie optymalnych warunków ogrzewania

Po pierwsze, należy eksperymentalnie określić optymalną temperaturę i czas inkubacji do wykorzystania na etapie ogrzewania w teście. W przypadku naszego modelu PlyC ważne jest, aby zauważyć, że wykazano, że E. coli współtransformowana z genami plyCA i plyCB na oddzielnych plazmidach ekspresyjnych tworzy w pełni funkcjonalny holoenzym^{PlyC 6}. Przygotowanie 96-dołkowej płytki mikromiareczkowej, jak również warunki wzrostu komórek i późniejsza technika posiewu repliki zostały zaadaptowane z przykładów podanych w literaturze^12-16. Czas inkubacji wynoszący 30 minut będzie odpowiedni dla tego testu, ponieważ wyniki poprzednich eksperymentów z inaktywacją termiczną dyktują szybką utratę aktywności podczas krótkotrwałej inkubacji w środowiskach przekraczających temperaturę fizjologiczną (obserwacja niepublikowana). Optymalna temperatura inkubacji dla PlyC została wyjaśniona w następujących krokach:

1. Przekształć konstrukt wyrażenia pBAD24:plyCA (Amp^r) w właściwy szczep E. coli DH5α pBAD33:plyCB (Cm^r).
2. Umieścić transformanty na płytce agarowej Luria-Bertani (LB) z dodatkiem ampicyliny (100 μg/ml) i chloramfenikolu (35 μg/ml). Inkubować płytki przez noc w temperaturze 37 °C.
3. Za pomocą sterylnej wykałaczki zaszczepić pojedynczą kolonię w każdym rzędzie studzienek (ryc. 2a) na sterylnej, przezroczystej, płaskodennej 96-dołkowej płytce do mikromiareczkowania z pokrywką, która zawiera 200 μl LB uzupełnionego ampicyliną i chloramfenikolem.
4. Bezpiecznie umieścić 96-dołkową płytkę do mikromiareczkowania w inkubatorze z wytrząsaniem o temperaturze 37 °C i hodować bakterie przez noc z prędkością 300 obr./min.
5. Pobrać 96-dołkową płytkę do mikromiareczkowania z inkubatora do wytrząsania w temperaturze 37 °C i replikę płytki na nową 96-dołkową płytkę do mikromiareczkowania w następujący sposób:
   1. Dodać 180 μl LB uzupełnionego ampicyliną i chloramfenikolem do każdego dołka płytki repliki.
   2. Przenieś 20 μl bakterii z oryginalnej płytki do odpowiednich studzienek w płytce repliki. Powinno to skutkować początkowym OD₆₀₀ wynoszącym ~0,5.
6. Bezpiecznie umieść płytkę repliki na inkubatorze z wytrząsaniem w temperaturze 37 °C i inkubuj płytkę przez 1 godzinę przy 300 obr./min, a następnie dodaj induktor. W przypadku układów ekspresji pBAD induktorem jest 0,25% arabinozy. Inne systemy ekspresji mogą wymagać różnych induktorów. Umieścić płytkę z powrotem w inkubatorze do wytrząsania w temperaturze 37 °C i wytrząsać z prędkością 300 obr./min przez dodatkowe 4 godziny, aby umożliwić ekspresję białka. Poziomy ekspresji zwykle wahają się między 10-20 μg PlyC.
7. Po zakończeniu ekspresji białka należy pobrać replikę płytki i osadzać bakterie, umieszczając 96-dołkową płytkę do mikromiareczkowania w wirówce z chłodzeniem, która zawiera obracający się wirnik kubełkowy, który pasuje do 96-dołkowych płytek do mikromiareczkowania. Wirować z prędkością 3 000 obr./min przez 10 minut w temperaturze pokojowej.
8. Usunąć supernatant pożywki, powoli odwracając płytkę do mikromiareczkowania i delikatnie dekantując pożywkę.
9. Poddać komórki lizie, dodając 50 μl odczynnika do ekstrakcji białek bakteryjnych B-PER II do każdej studzienki. Inkubować płytkę w temperaturze pokojowej przez 20 minut.
10. Zwiększyć objętość w każdym studzience do 120 μl, dodając 70 μl soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) o pH 7,2.
11. Nierozpuszczalne resztki komórkowe należy osadzać, obracając płytkę z prędkością 3 000 obr./min przez 10 minut w temperaturze 4 °C w wirówce z chłodzeniem.
12. Przenieść 110 μl rozpuszczalnego surowego lizatu do odpowiednich dołków 96-dołkowej płytki termocyklera.
13. Przyjmując 30 minut jako z góry określony czas inkubacji, wystawij rozpuszczalne lizaty znajdujące się obecnie w 96-dołkowej płytce termocyklera na działanie szerokiego gradientu temperatury w zakresie 15-20 °C. Należy pamiętać, że celem jest określenie, w jakiej temperaturze dany enzym traci > 95% aktywności katalitycznej.
14. Po inkubacji inkubować 96-dołkową płytkę termocyklera w temperaturze 4 °C przez 5 minut i przenieść 100 μl rozpuszczalnych lizatów z 96-dołkowej płytki termocyklera do odpowiedniego miejsca w końcowej 96-dołkowej płytce mikromiareczkowej.
15. Za pomocą 12-kanałowego multipipetatora dodaj 100 μl szczepu GAS D471 do każdej studzienki. Uwaga, komórki D471 są pierwotnie liofilizowane z kultur nocnych i ponownie zawieszane za pomocą PBS pH 7,2 w celu uzyskania OD₆₀₀ ~ 2,0.
16. Natychmiast umieścić 96-dołkową płytkę w spektrofotometrze mikropłytkowym i monitorować kinetykę enzymu, mierząc OD₆₀₀ co 15 sekund przez 20 minut. Najniższa temperatura inkubacji, która odpowiadała studzienkom, w których nie nastąpiła zmiana gęstości optycznej (ΔOD ≤ 0,1), definiuje się jako temperaturę niedopuszczalną.

Po przeprowadzeniu szerokiego ekranu temperatury w celu zidentyfikowania temperatury niedopuszczającej, powyższe kroki mogą być powtórzone w węższym zakresie temperatur (5 °-10 °C), aby wyjaśnić dokładną temperaturę niedopuszczalną dla interesującego enzymu. Należy zauważyć, że niedopuszczalna temperatura określona w tym teście może różnić się od temperatury topnienia wyjaśnionej w inny sposób ze względu na różnice w objętości, stężeniu itp.

2. Generowanie biblioteki mutantów

Stworzenie biblioteki mutantów do badania przesiewowego polega na losowym włączaniu mutacji przez podatną na błędy polimerazę DNA z minimalnym odchyleniem nukleotydowym w genie plyCA przy użyciu zestawu do losowej mutagenezy GeneMorph II w następujący sposób:

1. Zaprojektuj startery nukleotydowe o podobnych temperaturach topnienia (T_m) w zakresie 55-72 °C z wybranymi miejscami restrykcji na końcach 5' i 3' genu plyCA.
2. Ponieważ pożądana szybkość mutacji wynosi 2-3 nukleotydy na plyCA (1,4 kb), należy stosować stężenia składników reakcji PCR, a także warunki termocyklera zalecane przez producenta dla niskich częstości mutacji (0-4,5 na kb).
3. Sklonuj zmutagizowane geny plyCA do wektora ekspresyjnego pBAD24.
4. Przekształć konstrukty w tło DH5α pBAD33:plyCB i transformanty płytkowe na płytkach agarowych LB uzupełnione ampicyliną i chloramfenikolem.
5. Dodatkowo przekształć i płytkować DH5α pBAD33:plyCB z wektorem ekspresyjnym pBAD24 zawierającym gen WT plyCA. Kolonie z tej płytki będą służyć jako kontrole podczas przesiewania.

3. 96 dołków Przygotowanie płytki mikromiareczkowej i warunki wzrostu komórek

1. Wypełnić każdą studzienkę 96-dołkowej płytki mikromiareczkowej 200 μl LB uzupełnionego ampicyliną i chloramfenikolem.
2. Postępując zgodnie ze schematem płytki do mikromiareczkowania (rysunek 2b), ostrożnie wybierz pojedynczą kolonię z nocnych płytek agarowych za pomocą wysterylizowanej wykałaczki i zaszczepij bakterie w wyznaczonym dołku 96-dołkowej płytki do mikromiareczkowania. Istotne jest, aby zaszczepić tylko jedną kolonię na studzienkę.
3. Wytrząsnąć bezpiecznie zakotwiczoną 96-dołkową płytkę do mikromiareczkowania z prędkością 300 obr./min przez noc w temperaturze 37 °C.

4. Posiewanie replik, indukcja ekspresji białek i przygotowanie lizatu

1. Wykonaj kroki 1.5-1.11 z rozdziału zatytułowanego "Określanie optymalnych warunków grzewczych" z jedną modyfikacją. Oryginalną płytkę należy przechowywać w temperaturze 4 °C po zakończeniu etapu powlekania repliki.
2. Po etapie 1.11 przenieść 110 μl rozpuszczalnego lizatu surowego do odpowiednich studzienek 96-dołkowej płytki termocyklera, z wyjątkiem studzienek kontroli dodatniej A1-D1. W odniesieniu do lizatów kontroli dodatniej (tj. lizatów, które nie są podgrzewane), należy przenieść 100 μl lizatów do odpowiednich studzienek na nowej 96-dołkowej płytce do mikromiareczkowania, która posłuży jako końcowa płytka do oznaczania do doświadczenia i będzie przechowywana na lodzie.

5. Obróbka cieplna rozpuszczalnego lizatu

1. Podgrzewać kontrolę ujemną i zmutowane rozpuszczalne lizaty obecnie zamknięte w 96-dołkowej płytce termocyklera w termocyklerze przez 30 minut w zoptymalizowanej temperaturze inkubacji niedopuszczającej ustalonej w kroku 1.
2. Po inkubacji w temperaturze niedopuszczającej się inkubacji inkubować 96-dołkową płytkę termocyklera w temperaturze 4 °C przez 5 minut.
3. Przenieść 100 μl rozpuszczalnych lizatów z 96-dołkowej płytki termocyklera do ich identycznych miejsc w końcowym 96-dołkowym mikromiareczkowym posążku zawierającym już rozpuszczalne lizaty w kontroli dodatniej.
4. Za pomocą 12-kanałowego multipipetatora dodaj 100 μl szczepu GAS D471 do każdej studzienki. Natychmiast umieścić płytkę w spektrofotometrze do mikropłytek.
5. Monitoruj kinetykę enzymu, mierząc OD₆₀₀ co 15 sekund przez 20 minut.
   1. Wariant PlyC z zaawansowanym zachowaniem termicznym jest definiowany jako konstrukcja, która może zmniejszyć pierwotną gęstość optyczną o 50 procent w czasie krótszym niż 900 sekund w temperaturze niedopuszczalnej. Ponadto kontrole dodatnie (tj. nieogrzewane, WT PlyC) muszą wykazywać aktywność katalityczną WT (t_1/2 ≤ 100 s), a kontrole ujemne (tj. podgrzane, WT PlyC) powinny być pozbawione aktywności.
6. Po zidentyfikowaniu wariantu PlyC z zaawansowanym zachowaniem termicznym należy pobrać oryginalną płytkę przechowywaną w temperaturze 4 °C i zaszczepić bakterie z indywidualnego dołka specyficznego dla badanego mutanta do świeżej pożywki LB uzupełnionej ampicyliną i chloramfenikolem. Hodować inokulum przez noc w temperaturze 37 °C.
7. Wyodrębnij i oczyść plazmidowe DNA z hodowli, a następnie prześlij do sekwencjonowania w celu zidentyfikowania mutacji nukleotydów, które sugerują ulepszone zachowanie termiczne PlyCA. Dodatkowo uzupełnij niewielką porcję z nocnej hodowli 10% glicerolem i przechowuj w temperaturze -80 °C do dalszego wykorzystania.

Results

Na zakończenie pierwszej rundy mutagenezy losowej, ponad 6,000 mutantów PlyC zostało przebadanych i w sumie zidentyfikowano, wybrano i zsekwencjonowano 35 mutantów o potencjalnie zwiększonym zachowaniu termicznym. Analiza genomiczna, podsumowana w tabeli I, sugeruje, że spośród 35 kandydatów, 7 konstruktów zawierało sekwencje WT PlyCA na poziomie translacji, odpowiadające fałszywie dodatnim wynikom zidentyfikowanym w teście. Spośród pozostałych 28 kandydatów, zakres mutacji wynosił od 1 do 6 mutacji nukleotydowych ze średnią częstością mutacji 2,75 nukleotydów na gen plyCA, co mieściło się w zakresie mutacji nukleotydowych 2-3, do których dążyliśmy. Na poziomie translacyjnym ten konkretny zakres i częstotliwość mutacji nukleotydów dał zakres mutacji aminokwasów od 1 do 5 aminokwasów, ze średnią szybkością mutacji 1,9 mutacji aminokwasów na polipeptyd PlyCA.

Spośród 28 kandydatów z co najmniej jedną mutacją aminokwasu, cztery z tych zmutowanych konstruktów zostały losowo wybrane do dalszej charakterystyki, aby potwierdzić, że szeroko zakrojony proces przesiewowy metodologii ukierunkowanej ewolucji rzeczywiście funkcjonuje prawidłowo. Zmutowane enzymy PlyC oczyszczono do > 95% jednorodności w oparciu o analizę SDS-PAGE, jak opisano wcześniej^6-7. Kinetykę enzymów WT PlyC i każdego z czterech mutantów PlyC scharakteryzowano przy równych stężeniach molowych po inkubacji oczyszczonych enzymów w różnych podwyższonych temperaturach. Aktywność monitorowano po dodaniu D471 GAS, mierząc gęstość optyczną przy 600 nm co 15 sekund przez 20 minut. Aktywność zdefiniowano jako maksymalną prędkość resztkową enzymu po inkubacji cieplnej. Spośród czterech kandydatów losowo wybranych do dalszej charakterystyki, mutant 29C3 wykazywał najbardziej ulepszone zachowanie termiczne. Zachowanie termiczne WT PlyC i 29C3 badano w różnych temperaturach podczas inkubacji i oznaczania aktywności w PBS pH 7,2 przy stężeniach odpowiednio 80 nM i 40 nM. Eksperymenty inkubacyjne w temperaturze 45-50 °C (ryc. 3) przeprowadzono w termocyklerze, w którym próbki inkubowano w cienkościennej 96-dołkowej płytce termocyklera o łącznej objętości 120 μl. Doświadczenia inkubacji w temperaturze 35 °C, 40 °C i 45 °C (ryc. 4 i 5) przeprowadzono w bloku grzewczym, w którym próbki inkubowano w probówce mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml w całkowitej objętości 1,3 ml. Wszystkie eksperymenty przeprowadzono w trzech egzemplarzach.

WT PlyC i 29C3 nie wykazały znaczącej różnicy w stabilności kinetycznej w temperaturze pokojowej (25 °C), jak pokazano na pierwszym zestawie słupków na rysunku 3. Jednak po krótkotrwałej inkubacji przez 30 minut w temperaturach w zakresie 45-50 °C, aktywność 29C3 była znacznie większa niż aktywność specyficzna dla konstruktu WT w każdym punkcie temperatury. Na przykład WT PlyC wykazał 44% spadek aktywności w temperaturze 45,2 °C, podczas gdy 29C3 wykazał tylko 2% spadek aktywności w tej samej temperaturze.

Długoterminowe badania inkubacyjne porównujące resztkową aktywność zarówno WT PlyC, jak i 29C3 zostały dodatkowo przeprowadzone w temperaturze 35 °C i 40 °C, obejmując pomiar pozostałej aktywności w punktach czasowych 24 i 48 godzin. W temperaturze 35 °C 29C3 wykazywał o 41% i 176% wyższą aktywność niż WT PlyC w 24 i 48 godzinnych punktach inkubacji odpowiednio (rysunek 4a). W temperaturze 40 °C 29C3 wykazywał o 28% i 107% wyższą aktywność niż WT PlyC w 24 i 48 godzinnych punktach inkubacji odpowiednio (ryc. 4b).

Aktywność resztkowa WT PlyC i 29C3 była również monitorowana co 20 minut przez łącznie 3 godziny w temperaturze 45 °C. WT PlyC była w stanie utrzymać tylko 21% aktywności po 3 godzinach inkubacji w tej temperaturze, podczas gdy 29C3 była w stanie zachować 46% aktywności. Okres półtrwania (t_1/2) dla WT PlyC i 29C3 wynosił odpowiednio 67 i 147 minut, co sugeruje, że 29C3 ma 2,2-krotny wzrost stabilności kinetycznej w temperaturze 45 °C (ryc. 5).

Łączna liczba kandydatów w rundzie 1 35 Rozdział Kandydaci z sekwencją WT PlyCA 7 Kandydaci z mutacją aminokwasów ≥1 28 — Średni wskaźnik mutacji nukleotydów (nt/plyCA) Godzina 2,75 — Zakres mutacji nukleotydów (nt) 1-6 — Średni wskaźnik mutacji aminokwasów (AA/PlyCA) Pytanie 1.9 — Zakres mutacji aminokwasów (AA) 1-5

Tabela 1. Analiza genomiczna puli kandydatów.

Rysunek 1. Metodologia testu ewolucji ukierunkowanej. W ewolucji ukierunkowanej zaczyna się od enzymu wiodącego, którym w pierwszej rundzie byłby WT PlyC. Biblioteka mutantów PlyC zawierających losowe, bezstronne mutacje nukleotydowe w genie plyCA jest następnie konstruowana przez podatną na błędy polimerazę DNA, klonowana do wektora ekspresyjnego pBAD24 i przekształcana w szczep E. coli DH5α już zawierający pBAD33:p lyCB. Poszczególne transformanty są inokulowane do ich własnej, specyficznej studzienki na 96-dołkowej płytce mikromiareczkowej. Dzięki szeroko zakrojonemu procesowi przesiewowemu poszczególne mutanty PlyC, które są aktywne katalitycznie po inkubacji w niedopuszczalnej temperaturze, są klasyfikowane jako mutanty o zwiększonej stabilności kinetycznej. Konstrukt wykazujący najbardziej zaawansowane zachowanie termiczne stanie się w konsekwencji enzymem wiodącym dla następnej rundy mutagenezy losowej. Ogólnie rzecz biorąc, istnieją trzy pełne rundy losowej mutagenezy, po których następuje tasowanie DNA, w wyniku czego powstaje cząsteczka bakteriolityczna o wyewoluowanym zachowaniu termicznym. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą postać.

Rysunek 2. 96-dołkowe szablony płytek mikromiareczkowych do testu ewolucji ukierunkowanej. Schemat płytki do mikromiareczkowania podczas określania optymalnych warunków ogrzewania (rysunek 2a) polega na zaszczepieniu pojedynczego rodzicielskiego klonu WT PlyC w każdym rzędzie płytki do mikromiareczkowania. Schemat płytki mikromiareczkowej podczas badania przesiewowego mutantów (ryc. 2b) polega na zaszczepieniu każdej studzienki w kolumnie 1 unikalnym rodzicielskim klonem WT PlyC, a także zaszczepieniu każdej studzienki w kolumnach 2-12 odrębnym zmutowanym klonem PlyC. Studzienki A1-D1 są przeznaczone do pozytywnej kontroli rodzicielskiej, która składa się z konstruktów WT PlyC nie narażonych na inkubację w niedozwolonej temperaturze. Studnie E1-H1 są przeznaczone do negatywnej kontroli rodzicielskiej, która składa się z konstruktów WT PlyC, które są wystawione na inkubację w niedozwolonej temperaturze.

Rysunek 3. Analiza kinetyczna aktywności resztkowej porównująca WT PlyC i 29C3. Enzymy oczyszczono do jednorodności i inkubowano przez 30 minut w termocyklerze przy równych stężeniach molowych w temperaturze pokojowej lub w gradieniu temperatury w zakresie 45-50 °C. Aktywność enzymatyczna koreluje z maksymalną prędkością wyświetlaną po inkubacji w określonej temperaturze. Z wyjątkiem 25 °C i 47,7 °C, zmiana aktywności między WT i 29C3 w każdej temperaturze korelowała z wartością p < 0,05. Wszystkie dane są podawane jako średnia ±SEM z trzech niezależnych eksperymentów.

Rysunek 4. Analiza kinetyczna aktywności resztkowej porównująca WT PlyC z 29C3 w temperaturze 35 °C i 40 °C. Równe stężenia molowe oczyszczonego WT PlyC i 29C3 inkubowano w bloku grzewczym w temperaturze 35 °C (rysunek 4a) lub 40 °C (rysunek 4b). Resztkową aktywność enzymu mierzono w 24 i 48 godzinnych punktach czasowych. Aktywność wyświetlana przez każdą konstrukcję została znormalizowana do maksymalnej prędkości wyświetlanej w punkcie czasu zero. Zmienność aktywności między WT i 29C3 w każdej temperaturze i punkcie czasowym korelowała z wartością p < 0,05. Wszystkie dane są podawane jako średnia ±SEM z trzech niezależnych eksperymentów.

Rysunek 5. Analiza kinetyczna aktywności resztkowej porównująca WT PlyC z 29C3 w temperaturze 45 °C. Równe stężenia molowe oczyszczonego WT PlyC i 29C3 inkubowano w bloku grzewczym w temperaturze 45°C, a resztkową aktywność enzymatyczną mierzono co 20 minut przez 3 godziny. Aktywność wyświetlana przez każdą konstrukcję została znormalizowana do maksymalnej prędkości wyświetlanej w punkcie czasu zero. Z wyjątkiem punktów danych po 20 minutach, różnica w aktywności między WT a 29C3 w każdym punkcie czasowym korelowała z wartością p < 0,05. Wszystkie dane są podawane jako średnia ±SEM z trzech niezależnych eksperymentów.

Discussion

Protokół ten, przedstawiony na rysunku 1, przedstawia metodologię 96-dołkowej płytki mikromiareczkowej, która pozwala na wykorzystanie ukierunkowanej ewolucji w celu zwiększenia termostabilności dowolnego enzymu bakteriolitycznego. Poprzez zastosowanie podatnej na błędy polimerazy DNA można wprowadzić losowe mutacje, które zwiększają ogólną stabilność kinetyczną translowanej cząsteczki bakteriolitycznej będącej przedmiotem zainteresowania, co jest zwykle spowodowane reorganizacjami molekularnymi polegającymi na zwiększaniu oddziaływań elektrostatycznych, mostkowych dwusiarczkowych i hydrofobowych, które generują lepsze upakowanie molekularne, ulepszone modyfikacje sieci ładunków powierzchniowych lub wzmocnienie wyższego stanu oligomeryzacji^17-18. Po wprowadzeniu mutacji nukleotydowych zastosowano obszerną procedurę przesiewową w celu zidentyfikowania mutacji, które są korzystne termicznie. Przedstawione tutaj reprezentatywne wyniki opierały się na jednej rundzie mutagenezy losowej. W rzeczywistości zasugerowano, że co najmniej trzy kolejne rundy mutagenezy losowej, z których każda wykorzystuje najmocniejszego mutanta jako enzym wiodący, po których następuje tasowanie DNA, są odpowiednie dla tego typu badań nad zachowaniem termicznym ukierunkowanej ewolucji².

Ważne jest, aby zrozumieć, że chociaż protokół ten identyfikuje mutacje, które zwiększają stabilność kinetyczną, warianty te niekoniecznie mają zwiększoną termostabilność. Cząsteczka jest uważana za termostabilną, gdy ma zdolność zachowywania swojej struktury w wysokiej temperaturze. Jednak w przedstawionym teście aktywność resztkowa zmutowanych lizatów nie jest badana w tej samej temperaturze, w której początkowo inkubowano je na etapie obróbki cieplnej, a zatem można selekcjonować mutacje, które sprzyjają ponownemu fałdowaniu, a nie zwiększonej termostabilności¹⁹. Podczas gdy ekstrapolujemy zachowanie termiczne jako wskaźnik stabilności termicznej, prawdziwa stabilność termiczna musi być mierzona empirycznie za pomocą metod biofizycznych, takich jak dichroizm kołowy (CD), różnicowa kalorymetria skaningowa (DSC) i różnicowa fluorymetria skaningowa (DSF). Wstępne dane z eksperymentów CD i DSF sugerują, że kilku kandydatów zidentyfikowanych na podstawie przedstawionej metodologii rzeczywiście wykazuje zaawansowaną termostabilność (dane nie pokazane).

Chociaż przedstawiona tutaj metodologia jest specyficzna dla implementacji zwiększonego zachowania termicznego do PlyC, ta sama metodologia może być dodatkowo zastosowana do zwiększenia aktywności termicznej innych enzymów bakteriolitycznych z niewielkimi zmianami zmiennych, takich jak, szybkość mutacji, warunki ogrzewania i systemy ekspresji. Jedna krytyczna zmienna związana z tym testem odnosi się do szybkości mutacji nukleotydów podatnej na błędy polimerazy DNA. Zdecydowaliśmy się użyć podatnej na błędy polimerazy DNA Mutazyme II w naszym teście ukierunkowanej ewolucji ze względu na dowody eksperymentalne sugerujące, że ten konkretny enzym wykazuje najmniejsze odchylenie w odniesieniu do tego, które nukleotydy są losowo włączane do interesującego genu w porównaniu z innymi technikami mutagenezy losowej, takimi jak stosowanie hydroksyloaminy, mutatorowych szczepów E. coli i innych podatnych na błędy poliermazów DNA²⁰. Ogólnie rzecz biorąc, niższe wskaźniki mutacji są bardziej pożądane z dwóch powodów. Po pierwsze, inżynieria termostabilności białek zazwyczaj składa się ze stosunkowo niewielu podstawień aminokwasów. Wysokie tempo mutacji może powodować dramatyczne zmiany strukturalne w poszczególnych cząsteczkach, które mogą ostatecznie skutkować nieprawidłowym fałdowaniem strukturalnym i rozbieżnościami funkcjonalnymi. Na przykład włączenie reszt glicyny i proliny może zakłócić drugorzędowe struktury alfa helisowe²¹. Po drugie, wysokie tempo mutacji nukleotydów zwiększa szanse na włączenie przedwczesnych kodonów stop, co skutkuje obciętymi cząsteczkami, które są biologicznie nieaktywne. Ogólnie rzecz biorąc, preferowane są niższe wskaźniki mutacji, ponieważ niższe wskaźniki błędów powodują akumulację mutacji adaptacyjnych, podczas gdy wyższe wskaźniki mutacji generują mutacje neutralne lub szkodliwe²².

Dla każdej rundy mutagenezy losowej kolejną krytyczną zmienną, którą należy zoptymalizować, jest temperatura inkubacji stosowana podczas procesu przesiewowego. Wybór eksperymentalnej temperatury niedopuszczającej jest stosunkowo trudny. Początkowo użyliśmy temperatury inkubacji, która była o 10 °C wyższa niż niedopuszczalna temperatura PlyC, jednak po przebadaniu 3000 mutantów nie byliśmy w stanie zidentyfikować żadnych korzystnych mutacji. Mając na uwadze, że metodologie ewolucji ukierunkowanej polegają na sekwencyjnym identyfikowaniu korzystnych podstawień aminokwasów, które mają działanie addytywne, ustalono, że podczas procesu przesiewowego należy stosować mniej rygorystyczną temperaturę, nawet jeśli zwiększa to ryzyko generowania wyników fałszywie dodatnich. W związku z tym użyliśmy temperatury inkubacji, która była tylko kilka stopni wyższa od temperatury niedopuszczalnej i ponownie przebadaliśmy wybranych kandydatów, aby wykluczyć wyniki fałszywie dodatnie.

Zdecydowaliśmy się zastosować temperaturę inkubacji, która nie była zbyt umiarkowana (≤ 1 °C wyższa niż najniższa temperatura niedopuszczająca) i odwrotnie, nie była zbyt surowa (≥ 5 °C wyższa niż najniższa temperatura niedopuszczalna). Idealna temperatura, którą zdecydowaliśmy się zastosować w tym konkretnym teście, była umiarkowanie wyższa o 2 °C niż eksperymentalnie określona temperatura niedopuszczalna. Wybór temperatury, która jest zbyt łagodna, spowoduje znacznie wyższy wskaźnik fałszywie dodatniej identyfikacji niż ~20%, które zaobserwowaliśmy (Tabela I) przy użyciu umiarkowanej temperatury inkubacji. Co więcej, użycie zbyt surowej temperatury inkubacji może ostatecznie skutkować niemożnością identyfikacji mutantów o znacznie ulepszonym zachowaniu termicznym. Na przykład zastosowanie temperatury inkubacji wynoszącej ≥ 5 °C skutkowałoby niemożnością zidentyfikowania obiecującego mutanta 29C3, jak również większości innych kandydatów wybranych podczas pierwszej rundy badań przesiewowych.

Podsumowując, przedstawiamy protokół inżynierii enzymów bakteriolitycznych w celu uzyskania zwiększonej stabilności kinetycznej. Co więcej, ten sam test, bez etapów ogrzewania, może być wykorzystany do badań przesiewowych w kierunku mutacji zwiększających aktywność katalityczną. Zwiększenie zarówno aktywności katalitycznej, jak i termostabilności jest ważną przeszkodą rozwojową, przed którą stoi każdy enzym terapeutyczny. Chociaż szczegóły tego protokołu są specyficzne dla endolizyny PlyC, metodologię można dostosować do dowolnego enzymu bakteriolitycznego z zaledwie kilkoma zmianami. Przedstawiliśmy wstępne wyniki tylko z pierwszej rundy mutagenezy, które potwierdzają tę funkcjonalność testu, co skutkuje implementacją i identyfikacją mutacji, które generują wzrost termostabilności molekularnej o znacznej wielkości.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
B-PER II Odczynnik do ekstrakcji białek bakteryjnych	Thermo Scientific	78260
GeneMorph II Zestaw do mutagenezy losowej	Agilent Technologies	200500
Przezroczysta 96-dołkowa, płaskodenna płytka do mikromiareczkowania z pokrywką	BD Vacutainer Labware Medical	353072
96 Płytki PCR bez spódnicy	Fisher Scientific	14-230-232
Wirnik wahadłowy	Eppendorf	A-2-DWP
Ampicylina Sól sodowa	Fisher Scientific	BP1760
Chloramfenikol	Fisher Scientific	BP904
Arabinoza	Fisher Scientific	BP2504
pBAD24 Wektor ekspresji	ATCC	87399
pBAD33 Wektor wyrażenia	ATCC	87402