Nowa metoda przesiewowa dla ewolucji sterowanej termostabilnych enzymów bakterio();tycznych

Podsumowanie

Opracowano nową metodę ewolucji kierowanej, specyficzną dla dziedziny inżynierii termostabilności, a następnie zwalidowano ją dla enzymów bakteriolitycznych. Po zaledwie jednej rundzie mutagenezy losowej ewoluowany enzym bakteriolityczny, PlyC 29C3, wykazał ponad dwukrotnie wyższą aktywność resztkową w porównaniu z białkiem typu dzikiego po inkubacji w podwyższonej temperaturze.

Streszczenie

Ewolucja sterowana jest definiowana jako metoda wykorzystywania selekcji naturalnej w celu modyfikacji białek tak, aby nabyły one określone właściwości, których nie wykazują w naturze. W literaturze opisano liczne przykłady zastosowania ewolucji sterowanej w celu skutecznej zmiany swoistości molekularnej i katalizy¹. Główną zaletą stosowania ewolucji sterowanej zamiast podejść bardziej racjonalnych w inżynierii molekularnej jest objętość i różnorodność wariantów, które mogą zostać przesiane². Jednym z możliwych zastosowań ewolucji sterowanej jest poprawa stabilności strukturalnej enzymów bakteriolitycznych, takich jak endolizyny. Bakteriofagi kodują i eksponują endolizyny w celu hydrolizy krytycznego wiązania kowalencyjnego w peptydoglikanie (tj. ścianie komórkowej) bakterii, co prowadzi do lizy komórki gospodarza i uwolnienia wirionów potomnych. Co istotne, enzymy te posiadają zdolność do egzogennego indukowania lizy u podatnych bakterii w obecności samych enzymów bez udziału faga, a ponadto ich potencjał terapeutyczny został potwierdzony zarówno in vitro, jak i in vivo^3-5. Przedmiotem naszego badania nad ewolucją sterowaną jest endolizyna PlyC, która składa się z podjednostek PlyCA i PlyCB⁶. Po oczyszczeniu i podaniu z zewnątrz, holoenzym PlyC lysuje paciorkowce grupy A (GAS) oraz inne grupy paciorkowców w ciągu kilku sekund, a ponadto został potwierdzony in vivo w działaniu przeciwko GAS⁷. Co ważne, monitorowanie kinetyki enzymu resztkowego po inkubacji w podwyższonej temperaturze dostarcza wyraźnych dowodów na to, że PlyC gwałtownie traci aktywność lityczną w temperaturze 45 °C, co sugeruje krótki okres trwałości terapeutycznej, co może ograniczać dalszy rozwój tego enzymu. Dalsze badania wykazują, że brak stabilności termicznej obserwuje się jedynie w przypadku podjednostki PlyCA, podczas gdy podjednostka PlyCB jest stabilna do około 90 °C (obserwacja niepublikowana). Oprócz PlyC w literaturze istnieje kilka przykładów opisujących termolabilną naturę endolizyn. Na przykład endolizyna LysK z Staphylococcus aureus oraz endolizyny Cpl-1 i Pal z Streptococcus pneumoniae tracą aktywność samoistnie w temperaturach odpowiednio 42 °C, 43,5 °C i 50,2 °C^8-10. Zgodnie z równaniem Arrheniusa, które wiąże szybkość reakcji chemicznej z temperaturą panującą w danym układzie, wzrost termostabilności będzie korelował ze zwiększeniem oczekiwanego okresu trwałości¹¹. W tym celu ewolucja sterowana okazała się użytecznym narzędziem do zmiany aktywności termicznej różnych cząsteczek w naturze, jednak ta konkretna technologia nigdy nie została z sukcesem wykorzystana do badania enzymów bakteriolitycznych. Podobnie, całkowicie nie istnieją udokumentowane przypadki skutecznego zwiększenia stabilności strukturalnej tej konkretnej klasy środków przeciwdrobnoustrojowych. W tym filmie stosujemy nowatorską metodologię wykorzystującą podatną na błędy polimerazę DNA, a następnie zoptymalizowany proces przesiewowy z użyciem formatu 96-dołkowej płytki mikrotitracyjnej, aby zidentyfikować mutacje w podjednostce PlyCA strept kokowej endolizyny PlyC, które korelują ze wzrostem kinetycznej stabilności enzymu (Ryc. 1). Wyniki po zaledwie jednej rundzie randomowej mutogenezy sugerują, że zastosowana metodologia generuje warianty PlyC, które zachowują ponad dwukrotnie większą aktywność resztkową w porównaniu do PlyC typu dzikiego (WT) po obróbce w podwyższonej temperaturze.

Protokół

1. Wyznaczanie optymalnych warunków ogrzewania

W pierwszej kolejności należy doświadczalnie wyznaczyć optymalną temperaturę i czas inkubacji dla etapu ogrzewania w analizie. W przypadku naszego modelu PlyC należy zauważyć, że E. coli współtransformowana genami plyCA i plyCB na oddzielnych plazmidach ekspresyjnych tworzy w pełni funkcjonalny holoenzym PlyC⁶. Przygotowanie 96-dołkowej płytki mikrotitracyjnej, warunki wzrostu komórek oraz późniejsza technika przesiewania metodą replikowania zostały dostosowane na podstawie przykładów opisanych w literaturze^12-16. Czas inkubacji wynoszący 30 min będzie odpowiedni dla tej analizy, ponieważ wyniki poprzednich eksperymentów dotyczących inaktywacji termicznej wskazują na szybką utratę aktywności podczas krótkotrwałej inkubacji w temperaturach przekraczających temperaturę fizjologiczną (obserwacja nieopublikowana). Optymalna temperatura inkubacji dla PlyC została określona w następujących krokach:

1. Przeprowadzić transformację konstruktu ekspresyjnego pBAD24:plyCA (Amp^r) do kompetentnego szczepu E. coli DH5α pBAD33:plyCB (Cm^r).
2. Wysiać transformanty na płytki z agarem Luria-Bertani (LB) z dodatkiem ampicyliny (100 μg/ml) i chloramfenikolu (35 μg/ml). Inkubować płytki przez noc w temperaturze 37 °C.
3. Za pomocą sterylnego wykałaczką zaszczepić poszczególne kolonie do każdego rzędu dołków (Ryc. 2a) w sterylnej, przezroczystej, płaskodنnej płytce mikrotitracyjnej 96-dołkowej z pokrywką, zawierającej 200 μl LB z dodatkiem ampicyliny i chloramfenikolu.
4. Bezpiecznie umieścić płytkę mikrotitracyjną 96-dołkową w inkubatorze z wytrząsaniem w temperaturze 37 °C i hodować bakterie przez noc przy 300 rpm.
5. Wyjąć płytkę mikrotitracyjną 96-dołkową z inkubatora z wytrząsaniem w temperaturze 37 °C i wykonać przesiew (replica plating) na nową płytkę mikrotitracyjną 96-dołkową w następujący sposób:
   1. Dodać 180 μl LB z dodatkiem ampicyliny i chloramfenikolu do każdego dołka płytki przesiewowej.
   2. Przenieść 20 μl bakterii z płytki oryginalnej do odpowiadających im dołków w płytce przesiewowej. Powinno to skutkować początkową wartością OD₆₀₀ na poziomie ~0,5.
6. Bezpiecznie umieścić płytkę przesiewową w inkubatorze z wytrząsaniem w temperaturze 37 °C i inkubować przez 1 h przy 300 rpm, a następnie dodać induktor. W przypadku systemów ekspresyjnych pBAD induktorem jest 0,25% arabinozy. Inne systemy ekspresyjne mogą wymagać innych induktorów. Umieścić płytkę z powrotem w inkubatorze z wytrząsaniem w temperaturze 37 °C i wytrząsać przy 300 rpm przez kolejne 4 h, aby umożliwić ekspresję białka. Poziomy ekspresji zazwyczaj mieszczą się w zakresie 10-20 μg PlyC.
7. Po zakończeniu ekspresji białka wyjąć płytkę przesiewową i sfragmentować bakterie, umieszczając płytkę mikrotitracyjną 96-dołkową w wirówce chłodzącej wyposażonej w rotor z koszyczkami dopasowany do płytek mikrotitracyjnych 96-dołkowych. Wirować przy 3 000 rpm przez 10 min w temperaturze pokojowej.
8. Usunąć nadsącz pożywki poprzez powolne odwrócenie płytki mikrotitracyjnej i delikatne zlanie pożywki.
9. Zlizować komórki, dodając 50 μl odczynnika do ekstrakcji białek bakteryjnych B-PER II do każdego dołka. Inkubować płytkę w temperaturze pokojowej przez 20 min.
10. Zwiększyć objętość w każdym dołku do 120 μl, dodając 70 μl soli fizjologicznej buforowanej fosforanowo (PBS) pH 7,2.
11. Odwirować nierozpuszczalne szczątki komórkowe, wirując płytkę przy 3 000 rpm przez 10 min w temperaturze 4 °C w wirówce chłodzącej.
12. Przenieść 110 μl rozpuszczalnego surowego lizatu do odpowiadających dołków płytki do termocyklera 96-dołkowej.
13. Przyjmując 30 min jako ustalony czas inkubacji, poddać rozpuszczalne lizaty znajdujące się w płytce do termocyklera 96-dołkowej działaniu szerokiego gradientu temperatur w zakresie 15-20 °C. Należy zauważyć, że celem jest określenie, w jakiej temperaturze dany enzym traci > 95% aktywności katalitycznej.
14. Po inkubacji chłodzić płytkę do termocyklera 96-dołkową w temperaturze 4 °C przez 5 min i przenieść 100 μl rozpuszczalnych lizatów z płytki do termocyklera do odpowiadających im lokalizacji dołków w końcowej płytce mikrotitracyjnej 96-dołkowej.
15. Za pomocą pipety wielokanałowej 12-kanałowej dodać 100 μl szczepu GAS D471 do każdego dołka. Należy zauważyć, że komórki D471 są pierwotnie liofilizowane z kultur nocnych i resuspenderowane w PBS pH 7,2 w celu uzyskania OD₆₀₀ na poziomie ~2,0.
16. Natychmiast umieścić płytkę 96-dołkową w spektrofotometrze do mikropłytek i monitorować kinetykę enzymatyczną, mierząc OD₆₀₀ co 15 s przez 20 min. Najniższa temperatura inkubacji, która odpowiadała dołkom bez zmiany gęstości optycznej (ΔOD ≤ 0,1), jest definiowana jako temperatura niepermisywna.

Po przeprowadzeniu szerokiego przesiewu temperatury w celu zidentyfikowania temperatury niepermisywnej, powyższe kroki można powtórzyć w węższym zakresie temperatur (5 °-10 °C), aby określić dokładną temperaturę niepermisywną dla badanego enzymu. Należy zauważyć, że temperatura niepermisywna zidentyfikowana w tym badaniu może różnić się od temperatury topnienia określonej innymi metodami ze względu na różnice w objętości, stężeniu itp.

2. Tworzenie biblioteki mutantów

Tworzenie biblioteki mutantów do przesiewania polega na losowym wprowadzaniu mutacji w genie plyCA przy użyciu polimerazy DNA podatnej na błędy o minimalnym odchyleniu nukleotydowym, z wykorzystaniem zestawu GeneMorph II Random Mutagenesis Kit, w następujący sposób:

1. Zaprojektuj startery nukleotydowe o zbliżonych temperaturach topnienia (T_m) w zakresie 55-72 °C z wybranymi miejscami restrykcyjnymi na końcach 5' i 3' genu plyCA.
2. Ponieważ pożądana częstość mutacji wynosi 2-3 nukleotydy na plyCA (1.4 kb), należy zastosować stężenia składników reakcji PCR oraz warunki termocyklera zalecane przez producenta dla niskich częstotliwości mutacji (0-4.5 na kb).
3. Sklonuj zmutowane geny plyCA do wektora ekspresyjnego pBAD24.
4. Przetransformuj konstrukty do szczepu DH5α pBAD33:plyCB i wysiej transformanty na płytki z agarem LB uzupełnionym o ampicylinę i chloramfenikol.
5. Dodatkowo przetransformuj i wysiej szczep DH5α pBAD33:plyCB z wektorem ekspresyjnym pBAD24 zawierającym gen plyCA typu dzikiego (WT). Kolonie z tej płytki będą służyć jako kontrole podczas przesiewania.

3. Przygotowanie 96-dołkowej płytki mikrotitracyjnej i warunki wzrostu komórek

1. Napełnić każde wgłębienie płytki mikrotitracyjnej 96-dołkowej 200 μl pożywki LB uzupełnionej o ampicylinę i chloramfenikol.
2. Zgodnie ze schematem płytki mikrotitracyjnej (Rycina 2b), ostrożnie pobrać pojedynczą kolonię z agarowych płytek inkubowanych przez noc za pomocą wysterylizowanego wykałaczką i zaszczepić bakterie w wyznaczonym wgłębieniu płytki mikrotitracyjnej 96-dołkowej. Należy upewnić się, że w każdym wgłębieniu zaszczepiono tylko jedną kolonię.
3. Inkubować mocno zamocowaną płytkę mikrotitracyjną 96-dołkową przez noc w temperaturze 37 °C przy wytrząsaniu z prędkością 300 rpm.

4. Prowadzenie posiewów powtórnych, indukcja ekspresji białka i przygotowanie lizatu

1. Należy wykonać kroki 1.5-1.11 z sekcji zatytułowanej „Determining the optimal heating conditions” z jedną modyfikacją. Po zakończeniu etapu wysiewu replikacyjnego oryginalną płytkę należy przechowywać w temperaturze 4 °C.
2. Po kroku 1.11 należy przenieść 110 μl rozpuszczalnego lizatu surowego do odpowiednich dołków płytki do termocyklera 96-dołkowej, z wyjątkiem dołków kontroli pozytywnej A1-D1. W przypadku lizatów kontroli pozytywnej (i.e. lizatów niepoddanych ogrzewaniu), należy przenieść 100 μl lizatów do odpowiednich dołków w nowej 96-dołkowej płytce mikrotitracyjnej, która będzie służyć jako końcowa płytka analityczna dla eksperymentu, a następnie przechowywać je na lodzie.

5. Obróbka termiczna rozpuszczalnego lizatu

1. Podgrzać lizaty rozpuszczalne kontroli negatywnej oraz mutantów, znajdujące się obecnie w 96-dołkowej płytce do termocyklera, w termocyklerze przez 30 min w optymalnej niedopuszczalnej temperaturze inkubacji wyznaczonej w kroku 1.
2. Po inkubacji w niedopuszczalnej temperaturze, inkubować 96-dołkową płytkę do termocyklera w temperaturze 4 °C przez 5 min.
3. Przenieść 100 μl lizatów rozpuszczalnych z 96-dołkowej płytki do termocyklera do odpowiadających im dołków w końcowej 96-dołkowej płytce mikrotitracyjnej, która zawiera już lizaty rozpuszczalne kontroli pozytywnej.
4. Za pomocą pipety wielokanałowej 12-kanałowej dodać 100 μl szczepu GAS D471 do każdego dołka. Natychmiast umieścić płytkę w spektrofotometrze do mikropłytek.
5. Monitorować kinetykę enzymatyczną, mierząc OD₆₀₀ co 15 sec przez 20 min.
   1. Wariant PlyC o usprawnionym zachowaniu termicznym definiuje się jako konstrukt, który potrafi obniżyć pierwotną gęstość optyczną o 50 procent w czasie krótszym niż 900 sec w niedopuszczalnej temperaturze. Dodatkowo kontrole pozytywne (t.j. niepodgrzane, WT PlyC) muszą wykazywać aktywność katalityczną typu WT (t_1/2 ≤ 100 sec), a kontrole negatywne (t.j. podgrzane, WT PlyC) powinny być pozbawione aktywności.
6. Po zidentyfikowaniu wariantu PlyC o usprawnionym zachowaniu termicznym, pobrać oryginalną płytkę przechowywaną w 4 °C i zaszczepić bakterie z konkretnego dołka przypisanego do interesującego mutanta do świeżej pożywki LB uzupełnionej o ampicylinę i chloramfenikol. Hodować szczepionkę przez noc w 37 °C.
7. Wyekstrahować i oczyścić plazmidowe DNA z hodowli, a następnie przekazać do sekwencjonowania w celu zidentyfikowania mutacji nukleotydowych, które nadają PlyCA usprawnione zachowanie termiczne. Dodatkowo, niewielką porcję z hodowli nocnej uzupełnić 10% glicerolem i przechowywać w -80 °C do dalszego wykorzystania.

Wyniki

Po zakończeniu pierwszej rundy randomowej mutagenezy przesiewowo przebadano ponad 6 000 mutantów PlyC, z czego zidentyfikowano, wyselekcjonowano i zsekwencjonowano łącznie 35 mutantów o potencjalnie poprawionej stabilności termicznej. Analiza genomiczna, przedstawiona w Table I, sugeruje, że spośród 35 kandydatów 7 konstruktów posiadało sekwencje WT PlyCA na poziomie translacji, co odpowiada wynikom fałszywie dodatnim w przeprowadzonej analizie. W pozostałych 28 kandydatach liczba mutacji mieściła się w przedziale od 1 do 6 mutacji nukleotydowych, przy średniej częstości mutacji wynoszącej 2,75 nukleotydu na gen plyCA, co mieściło się w założonym zakresie 2–3 mutacji nukleotydowych. Na poziomie translacji ten konkretny zakres i częstotliwość mutacji nukleotydowych przełożyły się na zmianę od 1 do 5 aminokwasów, przy średniej częstości 1,9 mutacji aminokwasowej na polipeptyd PlyCA.

Z 28 kandydatów posiadających co najmniej jedną mutację aminokwasową, cztery z tych konstruktów mutantów wybrano losowo do dalszej charakterystyki, aby potwierdzić, że rozbudowany proces przesiewowy metodologii ewolucji kierowanej funkcjonował prawidłowo. Mutanty enzymów PlyC oczyszczono do homogeniczności > 95% na podstawie analizy SDS-PAGE, zgodnie z wcześniejszymi opisami^6-7. Kinetykę enzymatyczną PlyC typu WT oraz każdego z czterech mutantów PlyC określono przy równych stężeniach molowych po inkubacji oczyszczonych enzymów w różnych podwyższonych temperaturach. Aktywność monitorowano po dodaniu D471 GAS, mierząc gęstość optyczną przy 600 nm co 15 s przez 20 min. Aktywność zdefiniowano jako resztkową prędkość maksymalną enzymu po inkubacji termicznej. Spośród czterech kandydatów wybranych losowo do dalszej charakterystyki, mutant 29C3 wykazał najbardziej poprawione właściwości termiczne. Właściwości termiczne PlyC typu WT i 29C3 badano w różnych temperaturach podczas inkubacji i pomiaru aktywności w PBS pH 7.2 przy stężeniach odpowiednio 80 nM i 40 nM. Eksperymenty z inkubacją w 45-50 °C (Rycina 3) przeprowadzono w termocyklerze, w którym próbki inkubowano w cienkościennej płytce do termocyklera z 96 dołkami w całkowitej objętości 120 μl. Eksperymenty z inkubacją w 35 °C, 40 °C i 45 °C (Rycina 4 i 5) przeprowadzono w bloku grzewczym, w którym próbki inkubowano w probówkach do mikrowirówki o pojemności 1.5 ml w całkowitej objętości 1.3 ml. Wszystkie eksperymenty przeprowadzono w trzech powtórzeniach.

WT PlyC oraz 29C3 nie wykazały istotnych różnic w stabilności kinetycznej w temperaturze pokojowej (25 °C), co przedstawiono na pierwszym zestawie słupków na Rysunku 3. Jednak po krótkotrwałej inkubacji przez 30 min w temperaturach od 45-50 °C, aktywność 29C3 była znacznie większa niż aktywność specyficzna dla konstrukcji WT w każdym punkcie temperaturowym. Przykładowo, WT PlyC wykazało 44% utraty aktywności w 45,2 °C, podczas gdy 29C3 wykazało jedynie 2% utraty aktywności w tej samej temperaturze.

Dodatkowo przeprowadzono badania długotrwałej inkubacji w 35 °C i 40 °C w celu porównania aktywności resztkowej WT PlyC oraz 29C3, mierząc ją w punktach czasowych 24 i 48 hr. W temperaturze 35 °C wariant 29C3 wykazał aktywność odpowiednio o 41% i 176% wyższą niż WT PlyC po 24 i 48 hr inkubacji (Rysunek 4a). W temperaturze 40 °C wariant 29C3 wykazał aktywność odpowiednio o 28% i 107% wyższą niż WT PlyC po 24 i 48 hr inkubacji (Rysunek 4b).

Pozostałą aktywność WT PlyC oraz 29C3 monitorowano również co 20 min przez łącznie 3 hr w temperaturze 45 °C. WT PlyC zachowała jedynie 21% aktywności po 3 hr inkubacji w tej temperaturze, podczas gdy 29C3 zachowała 46% aktywności. Okres półtrwania (t_1/2) dla WT PlyC i 29C3 wynosił odpowiednio 67 i 147 min, co sugeruje, że 29C3 wykazuje 2,2-krotny wzrost stabilności kinetycznej w 45 °C (Rycina 5).

Całkowita liczba kandydatów w 1. rundzie	35
Kandydaci z sekwencją WT PlyCA	7
Kandydaci z ≥1 mutacją aminokwasową	28
— Średnia częstość mutacji nukleotydowych (nt/plyCA)	2.75
— Zakres mutacji nukleotydowych (nt)	1-6
— Średnia częstość mutacji aminokwasowych (AA/PlyCA)	1.9
— Zakres mutacji aminokwasowych (AA)	1-5

Tabela 1. Analiza genomiczna puli kandydatów.

Rysunek 1. Metodologia analizy ewolucji kierowanej. W ewolucji kierowanej rozpoczyna się od enzymu wiodącego, którym w pierwszej rundzie byłaby PlyC typu WT. Następnie, za pomocą polimerazy DNA podatnej na błędy, tworzy się bibliotekę mutantów PlyC zawierającą losowe, nieukierunkowane mutacje nukleotydowe w genie plyCA, które są klonowane do wektora ekspresyjnego pBAD24 i transformowane do szczepu E. coli DH5α zawierającego już pBAD33:plyCB. Poszczególne transformanty są szczepione w oddzielnych dołkach 96-dołkowej płytki mikrotitracyjnej. W drodze rozbudowanego procesu przesiewania, poszczególne mutanty PlyC, które wykazują aktywność katalityczną po inkubacji w temperaturze niedopuszczalnej, są klasyfikowane jako mutanty o zwiększonej stabilności kinetycznej. Konstrukt wykazujący najbardziej zaawansowane właściwości termiczne staje się w konsekwencji enzymem wiodącym dla kolejnej rundy losowej mutagenezy. Łącznie przeprowadzono trzy pełne rundy losowej mutagenezy, po których nastąpiło tasowanie DNA, co doprowadziło do uzyskania cząsteczki bakteriolitycznej o ewoluowanych właściwościach termicznych. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większy rysunek.

Rycina 2. Szablony 96-dołkowej płytki mikrotitracyjnej do testu ewolucji sterowanej. Schemat płytki mikrotitracyjnej podczas wyznaczania optymalnych warunków ogrzewania (Rycina 2a) polega na zaszczepieniu pojedynczego klonu rodzicielskiego WT PlyC do każdego rzędu płytki mikrotitracyjnej. Schemat płytki mikrotitracyjnej podczas przesiewania mutantów (Rycina 2b) polega na zaszczepieniu każdego dołka w kolumnie 1 unikalnym klonem rodzicielskim WT PlyC, a także zaszczepieniu każdego dołka w kolumnach 2-12 odrębnym klonem mutantem PlyC. Dołki A1-D1 są przeznaczone dla pozytywnych kontroli rodzicielskich, które stanowią konstrukty WT PlyC niepoddane inkubacji w temperaturze niedopuszczalnej. Dołki E1-H1 są przeznaczone dla negatywnych kontroli rodzicielskich, które stanowią konstrukty WT PlyC poddane inkubacji w temperaturze niedopuszczalnej.

Rycina 3. Analiza kinetyczna pozostałej aktywności z porównaniem WT PlyC i 29C3. Enzymy oczyszczono do homogeniczności i inkubowano przez 30 min w termocyklerze w równych stężeniach molowych, albo w temperaturze pokojowej, albo w gradiencie temperatur w zakresie 45-50 °C. Aktywność enzymatyczna koreluje z maksymalną prędkością (Vmax) odnotowaną po inkubacji w określonej temperaturze. Z wyjątkiem 25 °C i 47,7 °C, różnica w aktywności między WT a 29C3 w każdej temperaturze korelowała z wartością p < 0,05. Wszystkie dane przedstawiono jako średnią ±SEM z trzech niezależnych eksperymentów.

Rycina 4. Analiza kinetyki aktywności resztkowej porównująca WT PlyC z 29C3 w 35 °C i 40 °C. Równe stężenia molowe oczyszczonego WT PlyC i 29C3 inkubowano w bloku grzejnym w 35 °C (Rycina 4a) lub 40 °C (Rycina 4b). Aktywność resztkową enzymu mierzono w punktach czasowych 24 i 48 hr. Aktywność każdego konstruktu znormalizowano do maksymalnej prędkości odnotowanej w punkcie zero. Różnica w aktywności między WT a 29C3 w każdej temperaturze i punkcie czasowym korelowała z wartością p < 0.05. Wszystkie dane przedstawiono jako średnią ±SEM z trzech niezależnych eksperymentów.

Rycina 5. Analiza kinetyki aktywności resztkowej w porównaniu WT PlyC i 29C3 w 45 °C. Równe stężenia molowe oczyszczonych białek WT PlyC i 29C3 inkubowano w bloku grzewczym w 45°C, a resztkową aktywność enzymatyczną mierzono co 20 min przez 3 h. Aktywność każdego konstruktu znormalizowano do maksymalnej prędkości odnotowanej w punkcie czasowym zero. Z wyjątkiem punktów danych z 20 min, różnica w aktywności między WT a 29C3 w każdym punkcie czasowym korelowała z wartością p < 0,05. Wszystkie dane przedstawiono jako średnia ±SEM z trzech niezależnych eksperymentów.

Dyskusja

Protokół ten, przedstawiony na Rysunku 1, opisuje metodologię z wykorzystaniem 96-dołkowej płytki mikrotitracyjnej, która pozwala na zastosowanie ewolucji kierowanej w celu zwiększenia termostabilności dowolnego enzymu bakteriolitycznego. Dzięki zastosowaniu polimerazy DNA podatnej na błędy można wprowadzić losowe mutacje zwiększające ogólną stabilność kinetyczną tłumaczonej cząsteczki bakteriolitycznej, co zazwyczaj wynika z reorganizacji molekularnych polegających na zwiększeniu oddziaływań elektrostatycznych, tworzeniu mostków disiarczkowych i oddziaływań hydrofobowych, które prowadzą do lepszego upakowania cząsteczkowego, usprawnienia sieci ładunków powierzchniowych lub wzmocnienia wyższego stanu oligomeryzacji^17-18. Po wprowadzeniu mutacji nukleotydowych zastosowano szeroko zakrojoną procedurę przesiewową w celu zidentyfikowania mutacji korzystnych termicznie. Reprezentatywne wyniki przedstawione w niniejszym opracowaniu oparto na jednej rundzie losowej mutogenezy. W rzeczywistości sugeruje się, że w tego typu badaniach zachowania termicznego w ramach ewolucji kierowanej odpowiednie jest przeprowadzenie co najmniej trzech kolejnych rund losowej mutogenezy, w których w każdej rundzie jako enzym wyjściowy wykorzystuje się najstabilniejszy mutant, a następnie zastosowanie tasowania DNA (DNA shuffling)².

Należy zrozumieć, że choć niniejszy protokół identyfikuje mutacje zwiększające stabilność kinetyczną, warianty te niekoniecznie wykazują zwiększoną termostabilność. Cząsteczkę uznaje się za termostabilną, gdy posiada ona zdolność do zachowania swojej struktury w wysokiej temperaturze. Jednak w przedstawionym teście aktywność resztkowa lizatów mutantów nie jest badana w tej samej temperaturze, w której były one początkowo inkubowane podczas etapu obróbki cieplnej, w związku z czym można selekcjonować mutacje sprzyjające refoldingowi, a nie zwiększonej termostabilności¹⁹. Chociaż ekstrapolujemy zachowanie termiczne jako wskaźnik stabilności termicznej, rzeczywistą stabilność termiczną należy zmierzyć empirycznie metodami biofizycznymi, takimi jak dichroizm kołowy (CD), różnicowa kalorymetria skanująca (DSC) oraz różnicowa fluorymetria skanująca (DSF). Wstępne dane z eksperymentów CD i DSF sugerują, że kilka kandydatów zidentyfikowanych za pomocą przedstawionej metodologii rzeczywiście wykazuje zwiększoną termostabilność (dane niepokazane).

Choć metodologia przedstawiona w niniejszym opracowaniu jest specyficzna dla zwiększenia stabilności termicznej PlyC, tę samą metodę można zastosować w celu poprawy aktywności termicznej innych enzymów bakteriolitycznych, wprowadzając niewielkie modyfikacje w takich zmiennych jak bufory, tempo mutacji, warunki ogrzewania oraz systemy ekspresji. Jedną z kluczowych zmiennych związanych z tym badaniem jest tempo mutacji nukleotydowych polimerazy DNA podatnej na błędy. W badaniu ewolucji kierowanej zdecydowaliśmy się na użycie polimerazy DNA Mutazyme II ze względu na dowody eksperymentalne sugerujące, że enzym ten wykazuje najmniejsze skrzywienie w zakresie tego, które nukleotydy są losowo włączane do genu docelowego, w porównaniu z innymi technikami mutogenezy losowej, takimi jak stosowanie hydroksylaminy, szczepów mutator E. coli czy innych polimeraz DNA podatnych na błędy²⁰. Generalnie niższe tempo mutacji jest bardziej pożądane z dwóch powodów. Po pierwsze, inżynieria termostabilności białek zazwyczaj opiera się na stosunkowo niewielkiej liczbie podstawień aminokwasowych. Wysokie tempo mutacji może prowadzić do drastycznych zmian strukturalnych w poszczególnych cząsteczkach, co może skutkować błędnym zwinięciem struktury i rozbieżnościami funkcjonalnymi. Na przykład włączenie reszt glicyny i proliny może zaburzyć wtórne struktury alfa-helikalne²¹. Po drugie, wysokie tempo mutacji nukleotydowych zwiększa prawdopodobieństwo wprowadzenia przedwczesnych kodonów stop, co prowadzi do powstania skróconych cząsteczek, które są biologicznie nieaktywne. Zasadniczo preferowane jest niższe tempo mutacji, ponieważ mniejsza liczba błędów sprzyja kumulacji mutacji adaptacyjnych, podczas gdy wyższe tempo mutacji generuje mutacje neutralne lub szkodliwe²².

W każdej rundzie randomowej mutagenezy kolejną krytyczną zmienną, którą należy zoptymalizować, jest temperatura inkubacji stosowana podczas procesu przesiewania. Wybór eksperymentalnej temperatury niepermissywnej jest stosunkowo trudny. Początkowo zastosowano temperaturę inkubacji o 10 °C wyższą niż temperatura niepermissywna PlyC, jednak po przesiewaniu 3 000 mutantów nie udało się zidentyfikować żadnych korzystnych mutacji. Biorąc pod uwagę, że metodologie ewolucji kierowanej polegają na sekwencyjnej identyfikacji korzystnych substytucji aminokwasowych o efektach addytywnych, zdecydowano, że podczas procesu przesiewania należy zastosować mniej rygorystyczną temperaturę, nawet jeśli zwiększy to prawdopodobieństwo powstania wyników fałszywie dodatnich. W związku z tym zastosowano temperaturę inkubacji o zaledwie kilka stopni wyższą od temperatury niepermissywnej, a następnie ponownie przesiewano wybranych kandydatów, aby wykluczyć wyniki fałszywie dodatnie.

Zdecydowaliśmy się zastosować temperaturę inkubacji, która nie była zbyt niska (≤ 1 °C powyżej najniższej temperatury niepermisywnej) i przeciwnie, nie była zbyt wysoka (≥ 5 °C powyżej najniższej temperatury niepermisywnej). Idealną temperaturą, którą postanowiliśmy zastosować w tym konkretnym teście, była umiarkowana wartość o 2 °C wyższa od eksperymentalnie wyznaczonej temperatury niepermisywnej. Wybór temperatury zbyt niskiej spowodowałby znacznie wyższy odsetek fałszywie dodatnich wyników niż około 20%, które zaobserwowaliśmy (Tabela I), stosując umiarkowaną temperaturę inkubacji. Ponadto zastosowanie zbyt wysokiej temperatury inkubacji mogłoby ostatecznie uniemożliwić identyfikację mutantów o znacznie poprawionej termostabilności. Na przykład zastosowanie temperatury inkubacji ≥ 5 °C doprowadziłoby do braku możliwości zidentyfikowania obiecującego mutanta 29C3, a także większości pozostałych kandydatów wybranych podczas pierwszej rundy screeningu.

Podsumowując, przedstawiamy protokół inżynierii enzymów bakteriolitycznych w celu uzyskania zwiększonej stabilności kinetycznej. Ponadto ten sam test, z pominięciem etapów ogrzewania, może być wykorzystany do przesiewania mutacji zwiększających aktywność katalityczną. Zwiększenie zarówno aktywności katalitycznej, jak i termostabilności jest istotną barierą rozwojową, przed którą staje każdy enzym terapeutyczny. Chociaż szczegóły tego protokołu są specyficzne dla endolizyny PlyC, metodologię tę można zaadaptować do dowolnego enzymu bakteriolitycznego przy wprowadzeniu zaledwie kilku zmian. Przedstawiliśmy wstępne wyniki z tylko pierwszej rundy mutagenezy, które potwierdzają funkcjonalność testu, co doprowadziło do wdrożenia i identyfikacji mutacji generujących znaczący wzrost termostabilności molekularnej.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Odczynnik do ekstrakcji białek bakteryjnych B-PER II	Thermo Scientific	78260
Zestaw do randomowej mutogenezy GeneMorph II	Agilent Technologies	200500
Przezroczysta płytka mikrotitracyjna 96-dołkowa z płaskim dnem i pokrywką	BD Vacutainer Labware Medical	353072
Płytki PCR 96-dołkowe bez ramki	Fisher Scientific	14-230-232
Rotor z koszyczkami (swing-bucket)	Eppendorf	A-2-DWP
Sól sodowa ampicyliny	Fisher Scientific	BP1760
Chloramfenikol	Fisher Scientific	BP904
Arabinoza	Fisher Scientific	BP2504
Wektor ekspresyjny pBAD24	ATCC	87399
Wektor ekspresyjny pBAD33	ATCC	87402