Naprawa modelu krytycznego ubytku kalwarii z wykorzystaniem stromalnych komórek pochodzących z tkanki tłuszczowej pozyskanych z lipoaspiratu

Podsumowanie

Niniejszy protokół opisuje izolację komórek zrębowych pochodzących z tkanki tłuszczowej z aspiratu tłuszczowego oraz stworzenie krytycznego ubytku w kalwaru o rozmiarze 4 mm w celu oceny regeneracji szkieletu.

Streszczenie

Naprawa i regeneracja szkieletu czaszkowo-twarzowego daje nadzieję na tworzenie tkanek de novo poprzez podejście komórkowe z wykorzystaniem komórek macierzystych. Stromalne komórki pochodzące z tkanki tłuszczowej (ASCs) okazały się być obfitym źródłem multipotencjalnych komórek macierzystych zdolnych do różnicowania osteogennego, chondrogennego, adipogennego i miogennego. W wielu badaniach analizowano potencjał osteogenny tych komórek in vivo z zastosowaniem różnych biomateriałów rusztowaniowych do dostarczania komórek. Wykazano, że dzięki zastosowaniu osteokondukcyjnego rusztowania z kopolimeru kwasu mlekowego i glikolowego powleczonego hydroksyapatytem (HA-PLGA) zasiedlonego komórkami ASCs, w krytycznym defekcie czaszkowym – definiowanym jako ubytek, który nie ulega samoistnemu zagojeniu w ciągu całego życia zwierzęcia – można skutecznie uzyskać silną regenerację kostną. Ten model in vivo demonstruje podstawy podejść translacyjnych mających na celu regenerację tkanki kostnej – komponent komórkowy oraz macierz biologiczną. Metoda ta służy jako model dla docelowego zastosowania klinicznego komórek progenitorowych w naprawie specyficznego defektu tkankowego.

Protokół

1. Izolacja i namnażanie komórek

1. Wszystkie zgody pacjentów oraz protokoły eksperymentalne zostały przejrzane i zatwierdzone przez Komisję Bioetyczną Uniwersytetu Stanforda (Stanford University Institutional Review Board, protokoły nr 2188 i nr 9999).
2. Pozyskać ludzką podskórną tkankę tłuszczową podczas planowych zabiegów liposukcji przeprowadzanych w znieczuleniu miejscowym lub ogólnym.
3. W aspiracie tłuszczowym powstaną dwie warstwy (Rysunek 1A). Nadlew zaprzeczy ogromną większość przetworzonego materiału komórkowego. Warstwa dolna składa się głównie z wstrzykniętej soli fizjologicznej. Komórki pochodzące z zrostu tkanki tłuszczowej można pozyskać z obu warstw, jednak wydajność jest znacznie wyższa w przypadku nadlewu.
4. Aby wyizolować frakcję naczyniowo-zrazową (SVF), dokładnie przemyć aspirat tłuszczowy równymi objętościami 1X soli fosforanowo-buforowej (PBS) zawierającej 2,5% betadyny (2 razy), a następnie równą objętością 1X PBS (1 raz) bez betadyny. Odstawić do opadnięcia osadu.
5. Należy zachować szczególną ostrożność i stosować techniki sterylne przez cały proces, aby uniknąć zanieczyszczenia przetworzonej tkanki ludzkiej.
6. Odessać i usunąć warstwę dolną po każdym przemyciu.
7. Przenieść 15 ml tkanki tłuszczowej do stożkowych probówek BD Falcon o pojemności 50 ml.
8. Trawić tkankę tłuszczową równą objętością (15 ml) filtrowanej 0,075% kolagenazy typu II w zrównoważonym roztworze soli Hanksa (HBSS) w temperaturze 37 °C w kąpieli wodnej przez 60 min przy stałym mieszaniu (ok. 180 wstrząsów/min) – każdą probówkę należy napowietrzyć co 15 min.
9. Zneutralizować aktywność enzymu za pomocą 15 ml PBS zawierającego 10% płodowej surowicy bydlęcej (FBS) i odwirować przy 1 000 rpm przez 5 min w temperaturze 4 °C, aby uzyskać gęsty osad SVF. Osad będzie stanowił mieszaninę komórek pochodzących z zrostu tkanki tłuszczowej oraz erytrocytów.
10. Usunąć nadlew, nie naruszając osadu.
11. Resuspendować osad w 10 ml tradycyjnej pożywki wzrostowej (Dulbecco's Modified Eagle Medium [DMEM]/10% FBS/1% roztwór penicyliny i streptomycyny).
12. Przefiltrować zawiesinę przez nylonowe sitko komórkowe o oczkach 100 μm w celu usunięcia szczątków komórkowych.
13. Połączyć zawartość 3 probówek w jednej czystej probówce stożkowej o pojemności 50 ml. Odwirować przy 1 000 rpm przez 5 min w temperaturze 4 °C.
14. Usunąć nadlew, nie naruszając osadu.
15. Resuspendować osad w 5 ml tradycyjnej pożywki wzrostowej.
16. Połączyć dwie probówki stożkowe 50 ml na jedną płytkę 10 cm lub pięć probówek stożkowych 50 ml na jedną płytkę 15 cm.
17. Utworzyć kultury pierwotne przez noc w temperaturze 37 °C przy 21% O₂ i 5% CO₂.
18. Po inkubacji nocnej dokładnie przemyć płytki PBS, aby usunąć pozostałe nieprzylegające czerwone krwinki. Otrzymane populacje komórek to komórki pochodzące z zrostu tkanki tłuszczowej.
19. Utrzymywać komórki na poziomach poniżej pełnej konfluencji, aby zapobiec spontanicznej różnicowaniu w temperaturze 37 °C przy 21% O₂ i 5% CO₂ w pożywce wzrostowej. W przypadku wysiewu przy 50% konfluencji komórki zazwyczaj wymagają pasażowania co trzy do czterech dni w standardowej pożywce wzrostowej.

2. Przygotowanie rusztowania

1. Rusztowania zostały przygotowane przez dr Min Lee na University of California, Los Angeles - School of Dentistry.
2. Rusztowania PLGA wykonano z kopolimeru kwasu mlekowego i glikolowego (poly(lactic-co-glycolic acid)) 85/15 (lepkość właściwa = 0,61 dl/g, Birmingham Polymers) metodą odlewania z roztworu i procesu wymywania cząstek.
3. Roztwory PLGA/chloroform zmieszano z sacharozą o średnicy cząsteczek 200-300 μm w celu uzyskania 92% porowatości (frakcja objętościowa), a następnie sprasowano w cienkie arkusze w formie teflonowej.
4. Po liofilizacji przez noc rusztowania zanurzano trzykrotnie w świeżych porcjach wody dwukrotnie destylowanej (dd) H₂O w celu rozpuszczenia sacharozy, a następnie delikatnie wyjmowano z formy teflonowej za pomocą szpatułki z cienkim końcem.
5. Po wymyciu cząstek wszystkie rusztowania zdezynfekowano poprzez zanurzenie w 50%, 60% i 70% etanolu przez 30 min każde, a następnie trzykrotnie płukano ddH₂O.
6. Wszystkie rusztowania wysuszono pod laminarnym dygestorium.
7. Po wykonaniu rusztowania zostały one pokryte apatytem.
   1. Roztwór SBF (symulowany płyn ustrojowy) przygotowano z koncentracjami jonów 5-krotnie wyższymi niż w ludzkiej osoczu krwi. Wszystkie roztwory przefiltrowano sterylnie przez membranę PES 0,22 μm (Nalgene). Bezpośrednio przed procesem powlekania wysuszone rusztowania PLGA poddano trawieniu plazmą argonową w procesie wyładowania żarowego (Harrick Scientific), aby poprawić zwilżalność i jednorodność powłoki.
   2. Wytrawione rusztowania PLGA inkubowano następnie w SBF w temperaturze 37 °C w inkubatorze z płaszczem wodnym przez 12 h, a następnie w SBF 2 pozbawionym Mg²⁺ i HCO₃^- przez kolejne 12 h w 37 °C przy delikatnym mieszaniu.
   3. Pokryte rusztowania PLGA delikatnie płukano sterylną ddH₂O, aby usunąć nadmiar roztworu chlorku sodu, wysuszono w laminarnym dygestorium i zdezynfekowano 70% etanolem.
   4. Integralność powłoki apatytowej przeanalizowano za pomocą skaningowego mikroskopu elektronowego (SEM). Rusztowania pokryte apatytem zamocowano na podstawkach SEM (Ted Pella) i pokryto węglem w celu poprawy przewodnictwa. Podczas obserwacji w SEM (FEI/Phillips XL-30) zastosowano tryb elektronów wtórnych. W celu potwierdzenia składu pierwiastkowego struktur apatytowych wykonano pomiar widma rentgenowskiego z dyspersją energii.

3. Wysiewanie komórek

1. Po osiągnięciu poziomu subkonfluencji przemyć komórki buforem PBS (2x), a następnie poddać trypsynizacji.
2. Policzyć komórki w celu określenia ilości do wysiania.
3. Wysiać 1,5 x 10⁵ komórek na wcześniej docięte rusztowania o średnicy 4,0 mm.
   1. Umieścić pojedyncze rusztowanie w dołku płytki 96-dołkowej.
   2. Ponownie zawiesić komórki w standardowej pożywce wzrostowej w stężeniu około 1,5 x 10⁵ komórek na 20 μl pożywki.
   3. Nanieść pipetą 20 μl bezpośrednio na rusztowanie i inkubować w inkubatorze do hodowli komórkowych przez 30 min.
   4. Po 30 min dodać 200 μl pożywki i inkubować komórki na rusztowaniu przez noc przed operacją.
   5. Nie jest konieczne upewnianie się co do adhezji komórek do rusztowania, ponieważ wysianie odpowiedniej liczby komórek zapewni przyczepienie większości z nich. Zostało to potwierdzone w naszym laboratorium in vivo za pomocą analizy bioluminescencyjnej i histologicznej.

4. Tworzenie defektów sklepienia czaszki i implantacja in vivo

1. Zanurzyć dorosłe (60-dniowe) myszy CD-1 nude w narkozie, stosując koktajl anestetyczny (ketamina/ksylazyna/acepromazyna) w stężeniu 50% (rozcieńczenie 1:1 z 0,9% NaCl) lub zgodnie z zalecanym schematem znieczulania według protokołów instytucjonalnych. Myszy te są atypiczne, dzięki czemu hASCs nie wywołają reakcji immunologicznej.
   1. Dawkowanie: chlorowodorek ketaminy (80 mg/kg), ksylazyna (2,5 mg/kg), acepromazyna (2,5 mg/kg)
   2. Czas trwania działania: około 30 min
2. Zapełnić zwierzę prześcieradłami chirurgicznymi i wysterylizować miejsce operacji betadyną oraz alkoholem (x3), a następnie pokryć oczy myszy maścią przed wykonaniem cięcia pośrodkowego wzdłuż linii sagitalnej skóry głowy zwierzęcia w celu odsłonięcia prawej kości ciemieniowej. Usunąć okostnową z prawej kości ciemieniowej za pomocą tępego skrobania (Rysunek 1B).
3. Wyciąć jednostronny defekt o grubości pełnej ścianki i średnicy 4 mm w prawej kości ciemieniowej, poza obszarem szwów, używając sterylnego wiertła trepanacyjnego z powłoką diamentową. Należy zachować szczególną ostrożność, aby nie uszkodzić leżącej poniżej opony twardej (Rysunek 1B), ponieważ grubość czaszki myszy wynosi <0,3 mm.
4. Przed implantacją opłukać rusztowania sterylnym PBS, aby zapobiec przeniesieniu czynników wzrostu pochodzących z pożywki.
5. Umieścić rusztowanie w defekcie.
6. Na koniec zaszyć skórę i monitorować zwierzę zgodnie z ustalonymi protokołami pooperacyjnymi.
7. W razie potrzeby stosować ustalone środki przeciwbólowe zgodnie z protokołami opieki nad zwierzętami po operacji – np. buprenorfina 0,1 mg/kg.

5. Kwantyfikacja tworzenia osteoidu

1. Po przeprowadzeniu badania MicroCT u myszy, trójwymiarowy obraz zrekonstruowano przy użyciu oprogramowania MicroView, zgodnie z wcześniejszym opisem¹.
2. Przy użyciu programu Adobe Photoshop obrazy dopasowano do standardowej wysokości.
3. Z wykorzystaniem funkcji Magicznym Różdżką zmierzono liczbę pikseli w obrębie defektu sklepienia czaszki.
4. Procent gojenia defektu określono na podstawie kolejnych skanów CT poprzez pomiar powierzchni defektu sklepienia czaszki, wyznaczenie liczby pikseli i podzielenie jej przez liczbę pikseli pierwotnego defektu.
5. W związku z tym, w przypadku braku dostępności MicroCT, alternatywą jest wykorzystanie programu Adobe Photoshop i pobieranie sklepienia czaszki w wyznaczonych punktach czasowych do analizy histologicznej.
6. Przy użyciu barwień histologicznych, takich jak Aniline Blue i Pentachrome, które wykazują tworzenie osteoidu, należy zabarwić liczne przekroje wzdłuż całego obszaru defektu.
7. Przy użyciu programu Adobe Photoshop należy wyciąć wszystkie obszary, które nie znajdują się w obrębie defektu sklepienia czaszki.
8. Należy użyć funkcji magicznej różdżki, wyznaczyć liczbę pikseli nowo powstałej kostki de novo w obszarze defektu i porównać ją z kontrolami lub innymi zmiennymi.

6. Reprezentatywne wyniki

Tkanka tłuszczowa ma potencjał do odgrywania kluczowej roli w generowaniu komórek progenitorowych do zastosowań klinicznych. Tkanka tłuszczowa posiada unikalną zaletę w postaci łatwo dostępnego źródła, które można pobrać w stosunkowo prostym zabiegu, wiążącym się z minimalną zachorowalnością i śmiertelnością. Po pobraniu i zgromadzeniu tkanki, nasz protokół przedstawiony jest na Rysunku 2. Stromalne komórki pochodzące z tkanki tłuszczowej izoluje się poprzez serię etapów płukania, trawienie kolagenazą oraz wirowanie. Po wysianiu komórek w hodowli można je namnażać, poddawać różnym protokołom różnicowania in vitro lub wprowadzać bezpośrednio in vivo.

Utworzenie krytycznego defektu sklepienia czaszki o średnicy 4 mm zapewnia łatwo dostępny i powtarzalny model in vivo do badania zdolności różnicowania osteogennego naszych komórek stromalnych pochodzenia tłuszczowego. Dzięki zastosowaniu mikro-TK jesteśmy w stanie obserwować tworzenie tkanki kostnej in vivo oraz śledzić postępy naszych interwencji (Rycina 3). Defekt sklepienia czaszki o rozmiarze krytycznym nie goi się w ciągu życia zwierzęcia; około 8 tygodnia obserwujemy, że w przybliżeniu 90% defektu pozostaje otwarte. Sam rusztowanie (patrz dyskusja) posiada właściwości indukcji osteogennej i wykazało zdolność do indukowania częściowej regeneracji kostnej. Typowe wyniki po umieszczeniu samego rusztowania bez komórek wykazują, że około 8 tygodnia w jednej trzeciej defektu nastąpi tworzenie kości de novo. Po wzbogaceniu o komórki stromalne pochodzenia tłuszczowego, w około 8 tygodniu regeneracja kostna występuje w pełnych dwóch trzecich lub więcej powierzchni defektu, choć występują różnice między poszczególnymi zwierzętami i zabiegami. Tworzenie tkanki kostnej można ilościowo ocenić za pomocą histologii; typowe wyniki wykazują zwiększone tworzenie osteoidu w próbkach z ASC po barwieniu błękitem anilinowym i pentachromowym (Rycina 3C). Dodatkowo wykazaliśmy, że zaimplantowane ludzkie komórki przyczyniają się do powstania podścielającej tkanki kostnej de novo, wykorzystując hASC znakowane GFP, które wykazują barwienie in vivo w 2 tygodniu w pobliżu obszaru tworzenia kości de novo w defekcie sklepienia czaszki (Rycina 3D). Ponadto stosujemy immunohistochemię z przeciwciałem specyficznym dla człowieka, aby wykazać przeżycie ludzkich komórek i ich udział w obszarze defektu (Rycina 3E).

Rycina 1. A – Lipoaspirat składa się z dwóch warstw. Górna warstwa zawiera adipocyty i większość materiału komórkowego, natomiast dolna warstwa zawiera sól fizjologiczną używaną podczas procedury lipoaspiracji. B – tworzenie defektu sklepienia czaszki poprzez nacięcie w linii środkowej nad okostną w celu wyizolowania prawej kości ciemieniowej, a następnie wykonanie krytycznego defektu sklepienia czaszki o rozmiarze 4 mm bez uszkadzania leżącej poniżej opony twardej.

Rysunek 2. Przegląd pobierania i zastosowania lipoaspiratu: od izolacji stromalnych komórek pochodzących z tkanki tłuszczowej po ich ekspansję, różnicowanie i wykorzystanie in vitro i in vivo.

Rysunek 3. A – Mikro-TK obrazujące gojenie in vivo defektu czaszki o rozmiarze krytycznym po zastosowaniu ASC w rusztowaniu z hydroksyapatytu (dolny rząd). Grupy kontrolne obejmują defekt bez rusztowania (górny rząd) oraz defekt z wszczepionym rusztowaniem bez komórek (środkowy rząd). B – Ilościowa ocena gojenia kostnego na podstawie mikro-TK, wykazująca istotnie zwiększone gojenie w grupie ASC. C – Histologia wykazująca zwiększone tworzenie osteoidu w grupie ASC (dolny rząd) przy użyciu barwienia błękitem anilinowym i pentachromowym. W barwieniu błękitem anilinowym osteoid barwi się na ciemnoniebiesko, a w barwieniu pentachromowym na żółto. D – hASCS znakowane GFP zasiano na rusztowaniu, które następnie umieszczono w defekcie czaszki; zwierzęta uśpiono po 2 tygodniach. Barwienie wykonano z użyciem przeciwciała znakowanego GFP, aby wykazać udział ludzkich komórek w regeneracji w obszarze defektu. E – Immunohistochemia przeciwko ludzkiemu antygenowi jądrowemu wykazująca obecność ludzkich komórek w obszarze defektu po 2 tygodniach. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększony rysunek.

Dyskusja

Od czasu izolacji komórek pochodzących z tkanki tłuszczowej (adipose-derived stromal cells)² z lipoaspiratu, komórki te były różnicowane w szeroką gamę linii komórkowych. Tkanka tłuszczowa ma pochodzenie mezo-dermalne, w związku z czym multipotentne komórki pochodzące z tkanki tłuszczowej będą prawdopodobnie najskuteczniejsze w zastosowaniach ukierunkowanych na linię mezo-dermalną. Zdolność do generowania tkanki szkieletowej jest szczególnie istotna, biorąc pod uwagę niedobór miejsc pobrania dla autotransplant...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Pozyskiwanie lipoaspiratu
PBS	Gibco	10010-023
Zrównoważony roztwór soli Hanksa	Cellgro	21-023-CV
Kolagenaza	Sigma	C6885-500MG
Sito do komórek 100 μm	BD Falcon	352360
Filtr sterylizujący Steri-top 500 ml 0,22 μm	Millipore	SCGPT05RE
Defekt sklepienia czaszki
Bezczuistkowy mikrosilnik Z500 UM50C	NSK	NSKZ500
Nóż okrągły 4,0 mm	Xemax Surgical	CK40