Niniejszy protokół opisuje izolację komórek zrębowych pochodzących z tkanki tłuszczowej z aspiratu tłuszczowego oraz stworzenie krytycznego ubytku w kalwaru o rozmiarze 4 mm w celu oceny regeneracji szkieletu.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Naprawa modelu krytycznego ubytku kalwarii z wykorzystaniem stromalnych komórek pochodzących z tkanki tłuszczowej pozyskanych z lipoaspiratu
* These authors contributed equally
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Naprawa i regeneracja szkieletu czaszkowo-twarzowego daje nadzieję na tworzenie tkanek de novo poprzez podejście komórkowe z wykorzystaniem komórek macierzystych. Stromalne komórki pochodzące z tkanki tłuszczowej (ASCs) okazały się być obfitym źródłem multipotencjalnych komórek macierzystych zdolnych do różnicowania osteogennego, chondrogennego, adipogennego i miogennego. W wielu badaniach analizowano potencjał osteogenny tych komórek in vivo z zastosowaniem różnych biomateriałów rusztowaniowych do dostarczania komórek. Wykazano, że dzięki zastosowaniu osteokondukcyjnego rusztowania z kopolimeru kwasu mlekowego i glikolowego powleczonego hydroksyapatytem (HA-PLGA) zasiedlonego komórkami ASCs, w krytycznym defekcie czaszkowym – definiowanym jako ubytek, który nie ulega samoistnemu zagojeniu w ciągu całego życia zwierzęcia – można skutecznie uzyskać silną regenerację kostną. Ten model in vivo demonstruje podstawy podejść translacyjnych mających na celu regenerację tkanki kostnej – komponent komórkowy oraz macierz biologiczną. Metoda ta służy jako model dla docelowego zastosowania klinicznego komórek progenitorowych w naprawie specyficznego defektu tkankowego.
Protokół
1. Izolacja i namnażanie komórek
- Wszystkie zgody pacjentów oraz protokoły eksperymentalne zostały przeanalizowane i zatwierdzone przez Instytucjonalną Komisję Recenzencką Uniwersytetu Stanforda (protokół nr 2188 i nr 9999).
- Pozyskaj ludzką podskórną tkankę tłuszczową podczas zabiegów planowej lipoaspiracji przeprowadzanych w znieczuleniu miejscowym lub ogólnym.
- W lipoaspiracie powstaną dwie warstwy (Rysunek 1A). Nadpływ zawiera zdecydowaną większość przetworzonego materiału komórkowego. Warstwa dolna to głównie wstrzyknięta sól fizjologiczna. Komórki pochodzące z tkanki tłuszczowej (ASCs) można pozyskać z obu warstw, jednak wydajność jest znacznie większa w przypadku nadpływu.
- Aby wyizolować frakcję naczyniowo-stromalną (SVF), przemyj lipoaspirat wielokrotnie równymi objętościami 1X soli fizjologicznej buforowanej fosforanem (PBS) zawierającej 2,5% betadyny (x2), a następnie równą objętością 1X PBS (x1) bez betadyny. Pozostaw do osadzenia.
- Należy zachować szczególną ostrożność i stosować techniki sterylne przez cały proces, aby uniknąć kontaminacji przetworzoną tkanką ludzką.
- Po każdym przemywaniu odessaj warstwę dolną i ją usuń.
- Rozdziel po 15 ml tkanki tłuszczowej do stożkowych probówek BD Falcon o pojemności 50 ml.
- Traw tkankę tłuszczową równą objętością (15 ml) filtrowanej 0,075% kolagenazy typu II w zrównoważonym roztworze soli Hanksa (HBSS) w temperaturze 37 °C w łaźni wodnej przez 60 min przy stałym mieszaniu (ok. 180 wstrząsów/min) – każdą probówkę wietrz co 15 min.
- Zneutralizuj aktywność enzymu za pomocą 15 ml PBS zawierającego 10% płodowej surowicy bydlęcej (FBS) i wiruj przy 1 000 rpm przez 5 min w temperaturze 4 °C, aby uzyskać gęsty osad SVF. Osad będzie stanowił mieszaninę komórek pochodzących z tkanki tłuszczowej oraz erytrocytów.
- Usuń nadpływ, uważając, aby nie rozbić osadu.
- Resuspenduj osad w 10 ml tradycyjnej pożywki wzrostowej (podłoże DMEM/10% FBS/1% roztwór penicyliny-streptomycyny).
- Przefiltruj zawiesinę przez nylonowy sitko komórkowe o rozmiarze oczek 100 μm w celu usunięcia zanieczyszczeń komórkowych.
- Połącz zawartość 3 probówek w jednej czystej probówce stożkowej 50 ml. Wiruj przy 1 000 rpm przez 5 min w temperaturze 4 °C.
- Usuń nadpływ, uważając, aby nie rozbić osadu.
- Resuspenduj osad w 5 ml tradycyjnej pożywki wzrostowej.
- Połącz zawartość dwóch probówek 50 ml na jedną płytkę 10 cm lub pięciu probówek 50 ml na jedną płytkę 15 cm.
- Hoduj kultury pierwotne przez noc w temperaturze 37 °C przy 21% O2 i 5% CO2.
- Po inkubacji nocnej dokładnie przemyj płytki PBS-em, aby usunąć pozostałe nieprzylegające erytrocyty. Otrzymane populacje komórek to komórki pochodzące z tkanki tłuszczowej.
- Utrzymuj komórki na poziomie subkonfluencyjnym w pożywce wzrostowej w temperaturze 37 °C przy 21% O2 i 5% CO2, aby zapobiec spontanicznej różnicowaniu. W przypadku wysiewu przy 50% konfluencji komórki zazwyczaj wymagają pasażowania co trzy do czterech dni w standardowej pożywce wzrostowej.
2. Przygotowanie rusztowania
- Rusztowania zostały przygotowane przez dr Min Lee na University of California, Los Angeles - School of Dentistry.
- Rusztowania PLGA wykonano z kopolimeru kwasu mlekowego i glikolowego (poly(lactic-co-glycolic acid)) w stosunku 85/15 (lepkość właściwa = 0,61 dl/g, Birmingham Polymers) metodą odlewania z rozpuszczalnika i wymywania cząstek.
- Roztwory PLGA/chloroform zmieszano z sacharozą o średnicy 200-300 μm, aby uzyskać 92% porowatości (frakcja objętościowa), a następnie sprasowano w cienkie arkusze w formie teflonowej.
- Po liofilizacji przez noc, rusztowania zanurzono w trzech kolejnych porcjach podwójnie destylowanej (dd) H2O w celu rozpuszczenia sacharozy, a następnie ostrożnie usunięto z płyty teflonowej za pomocą szpatułki z cienkim końcem.
- Po wymywaniu cząstek wszystkie rusztowania zdezynfekowano poprzez zanurzenie w 50%, 60% i 70% etanolu przez 30 min każde, a następnie trzykrotnie przepłukano ddH2O.
- Wszystkie rusztowania wysuszono pod laminarnym dygestorium.
- Po wykonaniu rusztowania zostały one pokryte apatytem.
- Roztwór SBF (simulated body fluid) przygotowano z koncentracjami jonów 5-krotnie wyższymi niż w ludzkiej osoczu krwi. Wszystkie roztwory przefiltrowano sterylnie przez membranę PES 0,22 μm (Nalgene). Bezpośrednio przed procesem powlekania, wysuszone rusztowania PLGA poddano trawieniu plazmą argonową (Harrick Scientific) metodą glow discharge, aby poprawić zwilżalność i jednorodność powłoki.
- Wytrawione rusztowania PLGA inkubowano następnie w SBF w temperaturze 37 °C w inkubatorze z płaszczem wodnym przez 12 hr, a następnie w SBF 2 pozbawionym Mg2+ i HCO3- przez kolejne 12 hr w 37 °C przy delikatnym mieszaniu.
- Powlekane rusztowania PLGA delikatnie przepłukano sterylną ddH2O, aby usunąć nadmiar roztworu chlorku sodu, wysuszono w laminarnym dygestorium i zdezynfekowano 70% etanolem.
- Integralność powłoki apatytowej przeanalizowano za pomocą skaningowego mikroskopu elektronowego (SEM). Rusztowania pokryte apatytem zamocowano na podstawkach SEM (Ted Pella) i powleczono węglem w celu poprawy przewodności. Podczas obserwacji SEM (FEI/Phillips XL-30) zastosowano tryb elektronów wtórnych. Uzyskano spektrum rentgenowskie z dyspersją energii, aby potwierdzić skład pierwiastkowy struktur apatytowych.
3. Wysiew komórek
- Po osiągnięciu poziomu subkonfluencji, przemyć komórki PBS-em (2x) i poddać trypsynizacji.
- Policzyć komórki w celu określenia liczby do wysiania
- Wysiać 1,5 x 105 komórek na wcześniej wycięte rusztowania o średnicy 4,0 mm.
- Umieścić pojedyncze rusztowanie w dołku płytki 96-dołkowej
- Resuspendować komórki w standardowej pożywce wzrostowej, tak aby uzyskać stężenie około 1,5 x 105 komórek na 20 μl pożywki
- Nanieść pipetą 20 μl bezpośrednio na rusztowanie i inkubować w inkubatorze do hodowli komórkowych przez 30 min.
- Po 30 min dodać 200 μl pożywki i inkubować komórki na rusztowaniu przez noc przed operacją
- Nie ma konieczności zapewnienia adhezji komórek do rusztowania, ponieważ wysianie odpowiedniej liczby komórek gwarantuje, że większość z nich przytwierdzi się do rusztowania. Zostało to potwierdzone w naszym laboratorium in vivo za pomocą analizy bioluminescencyjnej i histologicznej.
4. Wykonanie defektów czaszkowych i implantacja in vivo
- Zanurzyć dorosłe (60-dniowe) myszy CD-1 nude w narkozie, stosując koktajl anestetyczny (ketamina/ksylazyna/acepromazyna) w stężeniu 50% (rozcieńczenie 1:1 z 0,9% NaCl) lub zgodnie z zalecanym schematem znieczulania według protokołów instytucjonalnych. Myszy te są atymiczne, więc hASCs nie wywołają reakcji immunologicznej.
- Dawkowanie: chlorowodorek ketaminy (80 mg/kg), ksylazyna (2,5 mg/kg), acepromazyna (2,5 mg/kg)
- Czas trwania efektu: około 30 min
- Założyć zwierzęciu obłożenie chirurgiczne i wysterylizować miejsce operacji betadyną oraz alkoholem (x3), a następnie pokryć oczy myszy maścią przed wykonaniem pośrodkowego cięcia strzałkowego skóry głowy zwierzęcia w celu odsłonięcia prawej kości ciemieniowej. Usunąć okostnową z prawej kości ciemieniowej za pomocą tępego skrobania (Rysunek 1B).
- Wyciąć jednostronny defekt pełnościenny o średnicy 4 mm w prawej kości ciemieniowej, poza obszarem szwów, używając sterylnego wiertła trepanacyjnego z powłoką diamentową. Należy zachować szczególną ostrożność, aby nie uszkodzić leżącej poniżej opony twardej (Rysunek 1B), ponieważ grubość czaszki myszy wynosi <.3 mm.
- Przed implantacją przepłukać rusztowania sterylnym PBS, aby zapobiec przeniesieniu czynników wzrostu pochodzących z pożywki.
- Umieścić rusztowanie w defekcie.
- Na koniec zaszyć skórę i monitorować zwierzę zgodnie z ustalonymi protokołami pooperacyjnymi.
- W razie potrzeby stosować uznane leki przeciwbólowe zgodnie z protokołami opieki nad zwierzętami w okresie pooperacyjnym – np. buprenorfina 0,1 mg/kg.
5. Ilościowe oznaczanie formowania osteoidu
- Po przeprowadzeniu badania MicroCT u myszy, obraz trójwymiarowy zrekonstruowano przy użyciu oprogramowania MicroView zgodnie z wcześniejszym opisem1.
- Za pomocą programu Adobe Photoshop obrazy dopasowano do standardowej wysokości.
- Przy użyciu funkcji magiczna różdżka zmierzono liczbę pikseli defektu sklepienia czaszki.
- Procentowe gojenie defektu określano za pomocą kolejnych skanów CT poprzez pomiar powierzchni defektu sklepienia czaszki, wyznaczenie liczby pikseli i podzielenie jej przez liczbę pikseli pierwotnego defektu
- W związku z tym, w przypadku braku dostępu do MicroCT, alternatywą jest użycie programu Adobe Photoshop i pobranie sklepienia czaszki w określonych punktach czasowych do badania histologicznego.
- Przy użyciu barwień histologicznych, takich jak błękit anilinowy i pentachrom, które wykazują tworzenie osteoidu, należy zabarwić wiele przekrojów wzdłuż całego obszaru defektu
- Za pomocą programu Adobe Photoshop należy wyciąć wszystkie obszary, które nie znajdują się w obrębie defektu sklepienia czaszki
- Używając funkcji magiczna różdżka, należy wyznaczyć liczbę pikseli nowo powstałej kostki de novo w obszarze defektu i porównać ją z grupami kontrolnymi lub innymi zmiennymi.
6. Reprezentatywne wyniki
Tkanka tłuszczowa ma potencjał, aby odgrywać kluczową rolę w generowaniu komórek progenitorowych do zastosowań klinicznych. Tkanka tłuszczowa posiada unikalną zaletę w postaci łatwo dostępnego źródła, które można pozyskać w stosunkowo prostym zabiegu wiążącym się z minimalną zachorowalnością i śmiertelnością. Po pobraniu i zgromadzeniu tkanki, nasz protokół przedstawiono na Rysunku 2. Stromalne komórki pochodzące z tkanki tłuszczowej są izolowane poprzez serię etapów płukania, trawienie kolagenazą oraz wirowanie. Po wysianiu komórek w hodowli można je namnażać, poddać różnym protokołom różnicowania in vitro lub wprowadzić bezpośrednio in vivo.
Utworzenie krytycznego defektu kalwarialnego o średnicy 4 mm zapewnia łatwo dostępny i powtarzalny model in vivo do testowania zdolności do różnicowania osteogennego naszych komórek Purchases stromalnych pochodzenia tłuszczowego. Dzięki zastosowaniu MicroCT jesteśmy w stanie śledzić formowanie się tkanki szkieletowej in vivo oraz monitorować postępy naszych interwencji (Rysunek 3). Defekt kalwarialny o rozmiarze krytycznym nie zagoi się w ciągu życia zwierzęcia i obserwujemy, że około 90% defektu pozostaje otwarte po około 8 tygodniach. Sam rusztowanie (patrz dyskusja) posiada właściwości indukcji osteogennej i wykazało zdolność do indukowania częściowej regeneracji kostnej. Typowe wyniki po umieszczeniu rusztowania bez komórek pokazują, że po 8 tygodniach w około jednej trzeciej defektu następuje tworzenie kości de novo. Po wzbogaceniu o stromalne komórki pochodzenia tłuszczowego, co najmniej dwie trzecie defektu wykazują regenerację kostną po około 8 tygodniach, choć występuje zmienność między poszczególnymi zwierzętami i zabiegami chirurgicznymi. Tworzenie tkanki szkieletowej można ilościowo ocenić za pomocą histologii, a typowe wyniki wykazują zwiększone tworzenie osteoidu w próbkach z ASC po barwieniu błękitem anilinowym i pentachromowym (Rysunek 3C). Dodatkowo wykazujemy, że zaimplantowane ludzkie komórki przyczyniają się do powstania tkanki kostnej de novo poprzez zastosowanie hASC znakowanych GFP, które wykazują barwienie in vivo w 2. tygodniu w pobliżu obszaru tworzenia kości de novo w defekcie kalwarialnym (Rysunek 3D). Ponadto stosujemy immunohistochemię z przeciwciałem specyficznym dla człowieka, aby wykazać przeżycie ludzkich komórek i ich udział w obszarze defektu (Rysunek 3E).
Rysunek 1. A - Lipoaspirat składa się z dwóch warstw. Warstwa górna zawiera adipocyty i większość materiału komórkowego, natomiast warstwa dolna zawiera sól fizjologiczną użytą podczas procedury lipoaspiracji. B - Wykonanie defektu kalwarialnego poprzez nacięcie w linii środkowej nad okostną w celu wyizolowania prawej kości ciemieniowej, a następnie utworzenie krytycznego defektu kalwarialnego o rozmiarze 4 mm bez naruszenia leżącej poniżej opony twardej.
Rysunek 2. Przegląd pobierania i zastosowania lipoaspiratu: od izolacji mezenchymalnych komórek macierzystych tkanki tłuszczowej po ich ekspansję, różnicowanie i wykorzystanie in vitro i in vivo
Rysunek 3. A – mikro-TK wykazujące gojenie in vivo defektu czaszki o rozmiarze krytycznym po zastosowaniu ASC w rusztowaniu z hydroksyapatytu (dolny rząd). Grupy kontrolne obejmują brak rusztowania i defekt (górny rząd) oraz defekt z umieszczeniem rusztowania bez komórek (środkowy rząd). B – Ilościowa ocena gojenia kostnego na podstawie mikro-TK, wykazująca istotnie zwiększone gojenie w grupie ASC. C – Histologia wykazująca zwiększone tworzenie osteoidu w grupie ASC (dolny rząd) przy użyciu barwienia błękitem anilinowym oraz pentachromowego. W barwieniu błękitem anilinowym osteoid barwi się na ciemnoniebiesko, a w barwieniu pentachromowym na żółto. D – hASCS znakowane GFP zasiano na rusztowaniu i umieszczono w defekcie czaszki; zwierzęta uśmiercono w 2. tygodniu. Barwienie wykonano z użyciem przeciwciała znakowanego GFP, aby wykazać udział ludzkich komórek w regeneracji w obszarze defektu. E – Immunohistochemia w kierunku ludzkiego antygenu jądrowego wykazująca obecność ludzkich komórek w obszarze defektu w 2. tygodniu. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększony rysunek.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Od czasu izolacji komórek pochodzących z tkanki tłuszczowej (adipose-derived stromal cells)2 z lipoaspiratu, komórki te były różnicowane w szeroką gamę linii komórkowych. Tkanka tłuszczowa ma pochodzenie mezo-dermalne, w związku z czym multipotentne komórki pochodzące z tkanki tłuszczowej będą prawdopodobnie najskuteczniejsze w zastosowaniach ukierunkowanych na linię mezo-dermalną. Zdolność do generowania tkanki szkieletowej jest szczególnie istotna, biorąc pod uwagę niedobór miejsc pobrania dla autotransplant...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Brak zadeklarowanych konfliktów interesów.
Podziękowania
Pragniemy podziękować dr. George'owi Commonsowi oraz dr. Deanowi Vistnesowi za wsparcie i współpracę w naszych badaniach. Praca ta jest wspierana przez granty National Institute of Dental and Craniofacial Research nr 1 R21 DE019274-01, R01EB009689 oraz RC2 DE020771- 02, fundację Oak Foundation oraz Hagey Laboratory for Pediatric Regenerative Medicine przyznane M.T.L. Dr Hyun otrzymuje wsparcie z Saint Joseph Mercy Hospital GME.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Pozyskiwanie lipoaspiratu | |||
| PBS | Gibco | 10010-023 | |
| Zrównoważony roztwór soli Hanksa | Cellgro | 21-023-CV | |
| Kolagenaza | Sigma | C6885-500MG | |
| Sito do komórek 100 μm | BD Falcon | 352360 | |
| Filtr sterylizujący Steri-top 500 ml 0,22 μm | Millipore | SCGPT05RE | |
| Defekt sklepienia czaszki | |||
| Bezczuistkowy mikrosilnik Z500 UM50C | NSK | NSKZ500 | |
| Nóż okrągły 4,0 mm | Xemax Surgical | CK40 |
Bibliografia
- Levi, B., James, A. W., Nelson, E. R. Human adipose-derived stromal cells heal critical size mouse calvarial defect. PLoS One. 5, (2010).
- Zuk, P. A., Zhu, M., Ashjia, P. Human adipose tissue is a source of multipotent stem cells. Mol. Biol. Cell. 13, 4279-4295 (2002).
- Keefe, M. S., Keefe, M. A. An evaluation of the effectiveness of different techniques for intraoperative antibiotics into alloplastic implants for use in facial reconstruction. Arch Facial Plastic Surg. 11, 246-251 (2009).
- Mitchell, J. B., McIntosh, K., Zvonic, S. Immunophenotype of human adipose-derived cells: Temporal changes in stromal-associated and stem cell-associated markers. Stem Cells. 24, 376-385 (2006).
- Dominici, M., Blanc, K. L. e, Mueller, I. Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stroma cells. The International Society for Cellular Therapy position statement. Cytotherapy. 8, 315-317 (2006).
- Cowan, C. M., Shi, Y. Y., Aalami, O. O. Adipose-derived adult stromal cells heal critical-size calvarial defects. Nat Biotechnol. 22, 560-567 (2004).
- Levi, B., Nelson, E. R., Li, S. Dura mater stimulates human adipose-derived stromal cells to undergo bone formation in mouse calvarial defects. Stem Cells. 29, 1241-1255 (2011).
- Phipps, M. C., Clem, W. C., Catledge, S. A. Mesenchymal stem cells responses to bone-mimetic electrospun matrices composed of polycaprolactone, collagen I and nanoparticulate hydroxyapatite. PLoS One. 6, (2011).
- Yuan, H., Zang, Z., Li, Y. Osteoinduction by calcium phosphate biomaterials. J. Mater. Sci. Mater. Med. 9, 723-726 (1998).
- Wei, G., Jun, Q., Giannobile, W. V. The enchancement of osteogenesis by nano-fibrous scaffolds incorporating rhBMP-7 nanospheres. Biomaterials. 28, 2087-2096 (2007).
- Li, C., Verpari, C., Jin, H. J. Electrospun silk-BMP-2 scaffolds for bone tissue engineering. Biomaterials. 27, 3115-3124 (2006).
- Zhang, Y., Fan, W., Nothdurft, L. In vitro and in vivo evaluation of adenovirus combined silk fibroin scaffolds for bone morphogenetic protein-7 gene delivery. Tissue Eng Part C Methods. 17, 789-797 (2011).
- Levi, B., Hyun, J. S., Nelson, E. R. Non-integrating knockdown and customized scaffold design enhances human-adipose-derived stem cells in skeletal repair. Stem Cells. 29, 21028-21029 (2011).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
