Opisano specyficzną i czułą metodę pozwalającą na poznanie profilu ekspresji antygenów glikosfingolipidowych w organach i komórkach układu odpornościowego. Metoda ta wykorzystuje spektrometrię mas z pułapką jonową, umożliwiając etapową fragmentację cząsteczek glikosfingolipidów w celu analizy strukturalnej w porównaniu ze standardami otrzymanymi drogą syntezy chemicznej.
Artykuł metodologiczny
Analiza spektrometryczna glikosfingolipidowych antygenów
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Glikosfingolipidy (GSL) należą do klasy biomakrocząsteczek glikokoniugatów, które niosą informacje strukturalne istotne dla kluczowych procesów biologicznych, takich jak rozwój embrionalny, transdukcja sygnału oraz rozpoznawanie przez receptory odpornościowe1-2. Zawierają one złożone grupy cukrowe w formie izomerów oraz grupy lipidowe z wariantami obejmującymi długość łańcucha acylowego kwasu tłuszczowego, stopień nienasycenia i hydroksylację. Zarówno część węglowodanowa, jak i ceramidowa mogą mieć znaczenie biologiczne. Na przykład triheksyloceramidy obejmują globotriazyloceramid (Galα4Galβ4Glcβ1Cer) oraz izoglobotriazyloceramid (Galα3Galβ4Glcβ1Cer), które mają identyczne masy cząsteczkowe, lecz odmienne wiązania cukrowe w części węglowodanowej, co odpowiada za całkowicie różne funkcje biologiczne3-4. W innym przykładzie wykazano, że modyfikacja części ceramidowej alfa-galaktozyloceramidu, silnego ligandu agonistycznego dla niezmienniczych komórek NKT, zmienia profile sekrecji cytokin oraz ich funkcję w modelach zwierzęcych nowotworów i chorób autoimmunologicznych5. Trudność w przeprowadzaniu analizy strukturalnej izomerów w narządach i komórkach odpornościowych stanowi barierę w określaniu wielu funkcji biologicznych6.
W niniejszej pracy prezentujemy wizualizację metody stosowanej do stosunkowo prostej, szybkiej i czułej analizy profili glikosfingolipidów w komórkach odpornościowych7-9. Metoda ta opiera się na ekstrakcji i modyfikacji chemicznej (permetylacji, patrz poniżej Rycina 5A, w wyniku reakcji permetylacji wszystkie grupy OH heksozy zostały zastąpione grupami MeO) glikosfingolipidów10-15, a następnie na analizie z wykorzystaniem spektrometrii mas z desorpcją/jonizacją laserową wspomaganą matrycą i analizatorem czasu przelotu (MALDI-TOF/MS) oraz spektrometrii mas z pułapką jonową. Do przeprowadzenia pełnej analizy metodą tą wymagane jest 50 milionów komórek odpornościowych. Eksperymenty mogą zostać ukończone w ciągu tygodnia. Względną zawartość poszczególnych glikosfingolipidów można określić poprzez porównanie z syntetycznymi standardami. Metoda ta wykazuje czułość pozwalającą na oznaczenie 1% iGb3 spośród izomerów Gb3 przy obecności 2 fmol całkowitej mieszaniny iGb3/Gb39.
Spektrometria mas z pułapką jonową może być wykorzystywana do analizy izomerów. Na przykład, aby przeanalizować obecność globotriaozyloceramidu i izoglobtriaozyloceramidu w tej samej próbce, można wykorzystać fragmentację cząsteczek glikosfingolipidów w celu strukturalnego rozróżnienia obu form (patrz poniżej Rysunek 5). Ponadto chemiczna modyfikacja reszt cukrowych (poprzez reakcję permetylacji) poprawia wydajność jonizacji i fragmentacji, co przekłada się na wyższą czułość i specyficzność, a także zwiększa stabilność reszt kwasu sialowego. Ekstrakcję i modyfikację chemiczną glikosfingolipidów można przeprowadzić w klasycznym certyfikowanym wyciągu chemicznym, a analizę spektrometryczną w jednostkach centralnych dysponujących instrumentami MS z pułapką jonową.
Protokół
1. Zasady bezpieczeństwa w laboratorium
- Wszystkie rozpuszczalniki organiczne muszą być przechowywane w wyznaczonych obszarach z wyraźnym oznakowaniem. Rodzaj wymaganych gaśnic należy sprawdzić na etykietach producentów.
- Kilka stosowanych odczynników jest potencjalnie rakotwórczych i może powodować depresję psychiczną. Odczynniki te należy stosować w dygestorium z systemem wentylacji (szczegóły znajdują się w tabeli konkretnych odczynników i sprzętu).
- Zaleca się, aby podczas pracy z rozpuszczalnikami organicznymi i komórkami przez cały czas stosować środki ochrony osobistej, takie jak rękawiczki, fartuch laboratoryjny i ochrona oczu.
2. Ekstrakcja glikosfingolipidów z komórek białaczki szczura
- Przechowywać komórki białaczki szczura RBL8 (od 10 milionów do 100 milionów) w szklanych probówkach 16x100 mm w temperaturze -80 °C. Komórki należy policzyć za pomocą hemocytometru po barwieniu błękitem trypanu. Żywotność komórek powinna być wyższa niż 95%.
- Ekstrakt lipidów należy przeprowadzić za pomocą intensywnej sonikacji czterokrotnie przez 1-2 h każdorazowo, stosując rozpuszczalniki o mieszanej polarności. Jako pierwszy i ostatni rozpuszczalnik należy użyć 6 ml mieszaniny chloroform-metanol 1:1 (v/v). Jako drugi i trzeci rozpuszczalnik można zastosować 6 ml izopropanol:heksan:H2O 55:25:20 (v/v/v, przed użyciem należy odessać fazę górną). Rozpuszczalnik ten przygotowuje się poprzez zmieszanie izopropanolu, heksanu i H2O w stosunku 55:25:20, energiczne wstrząśnięcie i odczekanie do pojawienia się fazy górnej, którą należy usunąć. Do dalszych prac należy zachować fazę dolną.
- Po sonikacji należy przeprowadzić wirowanie w celu zpelletowania materiału nierozpuszczalnego. Nadpływy należy połączyć. Osuszyć je w Speedvacu przez 4 h. W przypadku braku Speedvacu można zastosować strumień azotu lub wirujący odparowacz. Należy użyć wydajnej pułapki zimna w celu wychwycenia odparowanych rozpuszczalników organicznych. Przedostanie się rozpuszczalnika organicznego do oleju w pompie próżniowej obniży sprawność pompy.
- Przeprowadzić analizę wstępną za pomocą wysokosprawnej chromatografii cienkowarstwowej (HPTLC). W celu ilościowego oznaczenia glikolipidów należy przygotować 0,2% roztwór orcinolu w 50% kwasie siarkowym (100 mg w 50 ml) oraz standard galaktozy (roztwór stokowy 40 mg w 100 ml). Przygotować serię rozcieńczeń do krzywej wzorcowej (od 0 g/L do 20 g/L) w objętości reakcyjnej 30 μl. Do każdej próbki z serii rozcieńczeń dodać 20 μl metanolu. Każdą próbkę glikolipidów rozpuścić w 200 μl metanolu, poddać sonikacji i użyć 20 μl do pomiaru ilości glikolipidów. W probówkach Eppendorf 1,5 ml z nakrętkami (Sarstedt, 72.692.005) dodać do każdej próbki 0,4 ml 0,2% roztworu orcinolu w 50% kwasie siarkowym, a także serię roztworów galaktoza-H2O-metanol służących do krzywej wzorcowej. Gotować przez 5 min w bloku grzewczym w temperaturze 100 °C. Gęstość optyczną reakcji barwnej odczytać przy 440 nm za pomocą czytnika mikropłytek Sunrise Tecan. Aby przeprowadzić HPTLC, należy użyć mieszaniny chloroform:metanol:H2O 60:35:8 (v/v/v) jako rozpuszczalnika dla lipidów neutralnych traktowanych chloroform-metanolem 1:1 (v/v). Dla lipidów kwasowych (gangliozydów) należy użyć izopropanol:heksan:H2O 55:25:20 (v/v/v). Wyizolowane neutralne GSL rozpuszczono w 200 μl rozpuszczalnika chloroform:metanol 1:1(v/v) i naniesiono na płytkę chromatograficzną Merck z żelem krzemionkowym za pomocą kapilar Drummond Microcaps. Płytki rozwijano w rozpuszczalniku chloroform:metanol:H2O 60:35:8 (v/v/v), a następnie osuszono. Glikosfingolipidy uwidoczniono za pomocą orcinolu i kwasu siarkowego w temperaturze 300 °C.
- W celu oddzielenia lipidów neutralnych od kwasowych, należy przeprowadzić frakcjonowanie lipidów neutralnych i kwasowych za pomocą chromatografii wymiany anionowej na małej kolumnie DEAE Sephadex A-25 [żywicę DEAE Sephadex A25 można przygotować poprzez namoczenie proszku żywicy Sephadex A-25 w mieszaninie chloroform:metanol:H2O 30:60:8 (v/v/v) przez noc. Odessać nadpłyn, aż pozostanie tylko żywica Sephadex A25. Dodać świeży chloroform:metanol:H2O 30:60:8 (v/v/v), aby wypłukać żywicę. Powtórzyć czynność trzykrotnie w celu usunięcia ujemnie naładowanych pozostałości z żywicy Sephadex A25].
- Lipidy z kroku 2.1 rozpuścić, poddać sonikacji (nie dłużej niż 10 min) i w razie potrzeby resuspendować w mieszaninie chloroform:metanol:H2O 30:60:8 (v/v/v).
- Przygotować małą kolumnę DEAE Sephadex A25 (forma Cl), używając waty szklanej i 9-calowej pipety Pasteura. Watę szklaną należy upakować starannie, aby proszek żywicy nie przedostawał się przez kolumnę. Dodać żywicę DEAE Sephadex A25 (forma Cl) do „szyjki” 9-calowej pipety Pasteura, nie dopuszczając do wyschnięcia kolumny. Upewnić się, że w eluentcie nie widać żywicy. Próbki rozpuszczono w chloroform:metanol:H2O 30:60:8 (v/v/v). Frakcją lipidów neutralnych jest frakcja przejściowa (flow-through).
- Eluować frakcję lipidów kwasowych (związanych z żywicą) za pomocą 8 ml octanu sodu w metanolu. Obie frakcje, neutralną i kwasową, należy osuszyć, odsolić za pomocą dializy, osuszyć w Speedvacu i przeanalizować za pomocą HPTLC.
Frakcja kwasowa zawiera gangliozydy, które mogą zostać poddane bezpośredniej dializie przed reakcją w kroku 3. Frakcja neutralna zawiera nie tylko neutralne glikosfingolipidy, ale także fosfolipidy (fosfatydylocholinę i sfingomielinę), które muszą zostać usunięte poprzez reakcję acetylacji.
W naszym doświadczeniu metoda z użyciem kasety dializacyjnej jest bardziej wydajna i wygodna niż zastosowanie rurki dializacyjnej lub chromatografii kolumnowej na fazie odwróconej C18.
- Kolejnym krokiem jest usunięcie fosfolipidów z neutralnych glikosfingolipidów poprzez reakcję acetylacji i peracetylacji. Frakcję przepływową z kolumny DEAE Sephadex A-25 wysuszyć w Speedvacu (z chłodzeniem) przez 4 hr. Po wysuszeniu próbek umieścić je ponownie w Speedvacu i suszyć przez kolejne 4 hr. Należy upewnić się, że próbki są całkowicie suche, ponieważ obecność resztkowej wody uniemożliwi zajście reakcji peracetylacji.
- Próbki poddać peracetylacji, dodając 1 ml pirydyny i 0,5 ml bezwodnika octowego, a następnie inkubować w ciemności w temperaturze pokojowej lub 37 °C przez noc. Taka ilość pirydyny i bezwodnika octowego jest odpowiednia dla ilości do 200 μg glikosfingolipidów. Reakcję tę można przeprowadzić w 37 °C, ponieważ GSL wykazują wówczas lepszą rozpuszczalność.
- Materiał po peracetylacji wysuszyć w Speedvacu przez 3 hr, dodając 3 razy po 1 ml toluenu (współodparowanie), aby zapewnić całkowite odparowanie. Jeśli próbki nadal nie są całkowicie suche, kontynuować suszenie w Speedvacu aż do całkowitego wysuszenia.
- Przygotować kolumnę z Florisil (Sigma-Aldrich) (30-60 mesh, 10×80 mm) w pipecie Pasteura z watą szklaną, wypełniając ją granulkami Florisil. Granulki Florisil przed użyciem należy całkowicie wysuszyć poprzez inkubację w piecu w temperaturze 110 °C. Wypełnić pipetę Pasteura granulkami aż do szyjki, a następnie zrównoważyć w mieszaninie 1,2-dichloroetan-heksan 4:1 (v/v).
Elucja z kolumny z Florisilem przebiega bardzo szybko. Wysoka lotność rozpuszczalników może doprowadzić do wyschnięcia kolumny. W związku z tym wszystkie mieszaniny rozpuszczalników należy przygotować przed rozpoczęciem procesu, ponieważ zatrzymanie elucji w trakcie pracy kolumny nie jest możliwe.
- Naniesć peracetylowaną próbkę w 1 ml mieszaniny 1,2-dichloroetan-heksan 4:1 (v/v), a następnie przepłukać kolumnę 6 ml tego samego rozpuszczalnika, a potem 10 ml 1,2-dichloroetanu. Eluować neutralne peracetylowane GSL za pomocą 6 ml mieszaniny 1,2-dichloroetan-aceton 1:1 (v/v). Krok ten pozwala na oddzielenie peracetylowanych fosfolipidów od glikosfingolipidów, ponieważ peracetylowane glikosfingolipidy wiążą się z kolumną Florisil, natomiast peracetylowane fosfolipidy nie wykazują takiego powinowactwa.
- Wysuszyć frakcje w Speedvac przez 2 hr, a następnie zdeacetylować za pomocą 2 ml 0,5 M metanolowego roztworu metyleku sodu [Sigma-Aldrich, 403067] w 2 ml metanolu przez 3 hr w temperaturze pokojowej.
- Zneutralizować mieszaninę za pomocą 3 ml octanu metanolowego [kwas octowy/metanol 15/85 v/v], wysuszyć w Speedvac i odsolić poprzez dializę [rozpuścić wysuszone produkty w 3 ml wody, wprowadzić do kasety do dializy Slide-A-Lyzer i dializować przeciwko wodzie przez 24 hr, wymieniając wodę co najmniej dwukrotnie]. Wysuszyć dializowane GSL (w roztworze wodnym) w Speedvac do całkowitego odparowania próbki.
3. Modyfikacja chemiczna (permetylacja) glikosfingolipidów13
- Wprowadzić GSLs (1-20 μg) do szklanej probówki z nakrętką i wkładką teflonową, a następnie dodać dimetylosulfotlenek (150 μl), nie stosując specjalnych warunków suszenia ani atmosfery gazu obojętnego.
- Przygotować sproszkowany wodorotlenek sodu (40-60 mg) z granulek wodorotlenku sodu, rozcierając je w moździerzu chemicznym za pomocą tłuczka. Należy upewnić się, że proszki są przechowywane w bardzo suchym środowisku i zachować ostrożność, wykonując rozcieranie w dygestorium, aby uniknąć wdychania pyłów.
- Następnie dodać proszek wodorotlenku sodu do roztworu próbki za pomocą szpatułki. Dodać jodometan (80 μl) za pomocą strzykawki Hamiltona o objętości 100 μl [można również użyć kalibrowanej pipety VWR o objętości 100 μl połączonej ze strzykawką za pomocą gumowego wężyka] i mieszać mieszaninę w temperaturze pokojowej przez 1 hr.
- Zatrzymać reakcję metylacji, dodając wodę (2 ml). Wyekstrahować produkty permetylowane trzykrotnie poprzez dodanie dichlorometanu (2 ml) [glikolipidy znajdują się w fazie dichlorometanu, która jest fazą dolną, zatem fazę górną można przenieść do nowej szklanej probówki i ponownie poddać ekstrakcji dichlorometanem].
- Połączone ekstrakty z dichlorometanu przemyć trzykrotnie 2 ml wody [górną fazę wodną można następnie usunąć]. Po ostatnim przemyciu przenieść próbki do nowej probówki i wysuszyć w Speedvacu.
- Próbki można następnie rozpuścić w 100-200 μl metanolu w celu przeprowadzenia analizy ESI-MS.
4. Analiza MALDI-TOF permetylowanych glikosfingolipidów
- Przeprowadź eksperymenty MALDI-TOF-MS oraz MALDI-TOF/TOF-MS/MS przy użyciu spektrometru mas MALDI TOF-TOF (Applied Biosystems 4700, Foster City, CA). Przygotuj matrycę, mieszając w równych objętościach (50% obj.) roztwór kwasu dihydroksybenzoenowego (DHB) o stężeniu 10 mg/ml w acetonitrylu oraz 0,1% kwasu trifluorooctowego (TFA) w wodzie.
- Na tarczę MALDI nanieś kropelkę matrycy DHB (1 μl), a następnie kropelkę próbki rozpuszczonej w metanolu (1 μl, zawierającą 100 ng GSLs). Nanieś roztwory powoli i pozostaw do wyschnięcia przed rozpoczęciem analizy.
5. Analiza permetylowanych glikosfingolipidów przy użyciu MS z pułapką jonową
- Przeprowadzić spektrometrię mas na liniowym pułapkującym spektrometrze mas (LTQ, ThermoScientific, San Jose, CA) przy użyciu źródła nanoelektrosprayu, z szybkością przepływu 0,30 μl/min i temperaturą kapilary 230 °C w trybie jonów dodatnich, przy energii kolizyjnej 30-50%. Ustawić energie kolizyjne tak, aby pozostała minimalna względna obfitość jonu prekursorowego. Wykrywać wszystkie jony jako addukty sodowe.
- Zidentyfikować iGb3 (Galα3Galβ4Glcβ1Cer) w izobarycznej mieszaninie standardów Gb3 (Galα4Galβ4Glcβ1Cer) i iGb3 (Galα3Galβ4Glcβ1Cer) poprzez porównanie różnych wzorców jonów produktu MS4 z sodowego jonu molekularnego poprzez fragment glikanu m/z 667 i terminalny jon 1-enu disacharydu m/z 445 (t.j. X→667→445→, gdzie X oznacza jon molekularny wykryty w MS1) czystych permetylowanych standardów iGb3 (Galα3Galβ4Glcβ1Cer) za pomocą ESI-LIT-MS z wzorcami permetylowanego Gb3 (Galα3Galβ4Glcβ1Cer).
Wyniki
Przykład analizy MALDI MS glikosfingolipidów z linii komórkowej białaczki szczura RBL (typu komórki prezentującej antygen, która prezentuje antygeny glikosfingolipidowe komórkom NKT) przedstawiono na Rysunku 3. Jony można przypisać do konkretnych struktur glikosfingolipidów (Rysunek 3A). W komórkach RBL traktowanych NB-DGJ16, lekiem hamującym syntezę glikosfingolipidów, zaobserwowano znaczną redukcję wszystkich glikosfingolipidów (Rysunek 3B). Izomerów strukturalnych nie można rozróżnić. Możliwości MS/MS urządzenia Applied Biosystems 4700 pozwalają na fragmentację jonów MS1 do fragmentów MS2, co umożliwia uzyskanie ograniczonych informacji strukturalnych. Jednak analiza MS2 jest często niewystarczająca do rozróżnienia izomerów oligosacharydów.
Analiza glikosfingolipidów za pomocą spektrometrii mas z pułapką jonową (Ion-Trap MS) umożliwia badanie izomerów, takich jak iGb3 (Galα3Galβ4Glcβ1Cer) i Gb3 (Galα4Galβ4Glcβ1Cer), które mogą występować jako wykryte na Rysunku 3A jony triheksozyloceramidów. W celu wykrycia takich izomerów standardy iGb3 i Gb3 poddano wielokrotnym rundom fragmentacji, aż do znalezienia różnic (Rysunek 4A oraz 4B). W przedstawionym tutaj przykładzie (Rysunek 5C) iGb3 i Gb3 można było rozróżnić poprzez porównanie ich ze standardami iGb3 i Gb3.
Rycina 1. Schemat blokowy procedury ekstrakcji glikosfingolipidów oraz modyfikacji chemicznej glikosfingolipidów (permetylacji). Glikosfingolipidy wyekstrahowano z komórek za pomocą rozpuszczalników organicznych. W celu usunięcia frakcji niebędących glikosfingolipidami, lipidy można poddać peracetylacji i deacetylacji. Następnie glikosfingolipidy zmodyfikowano chemicznie w reakcji permetylacji, co zwiększa czułość i swoistość detekcji w MS. Na koniec profile glikosfingolipidów określono za pomocą spektrometrii mas MALDI-TOF oraz spektrometrii mas z pułapką jonową.
Rysunek 2. Oznaczanie ilości glikosfingolipidów metodą kwasu siarkowego z orcinolem: Oznaczanie ilości glikosfingolipidów z wykorzystaniem 0,2% roztworu orcinolu w 50% kwasie siarkowym oraz krzywej wzorcowej glukozy.
Rycina 3. Glikosfingolipidomika komórek białaczki szczura. A. Reprezentatywne widmo mas MALDI; każdy jon reprezentuje określoną strukturę glikosfingolipidu, izomery strukturalne nie mogą być rozróżnione. B. NB-DGJ, lek hamujący syntezę glikosfingolipidów, znacząco redukuje wszystkie glikosfingolipidy produkowane w komórkach RBL.
Rysunek 4. Tandemowa spektrometria mas izomerów glikosfingolipidów. A. Charakterystyczne ścieżki rozpadu w pułapce jonowej spektrometrii mas w trybie dodatnim dla permetylowanych GSL Gb3Cer i iGb3Cer. Gb3 i iGb3 są wyraźnie rozróżnialne na podstawie wzorów fragmentacji. Różnice w wiązaniach odzwierciedlone są w jonach produktowych MS4 zgodnych z izobarycznymi prekursorami m/z 445. B. Reprezentatywne wyniki pokazujące, że iGB3 można zmierzyć w mieszaninie izomerów iGb3/Gb3. Gwiazdki oznaczają jony diagnostyczne wyłącznie dla iGb3. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większy rysunek.
Rysunek 5. MS z pułapką jonową umożliwia analizę izomerów glikosfingolipidów. A. Standard iGb3 i Gb3 wykazują różnice w profilu fragmentacji po 4 rundach fragmentacji w spektrometrze mas LTQ z pułapką jonową. B. Charakterystyczny profil MS4 jonów pochodzących z iGb3 lub Gb3. C. Triheksozyloceramidy są mieszaninami izomerów iGb3 i Gb3, które można zidentyfikować metodą MS z pułapką jonową (Rysunek: Dapeng Zhou). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększony rysunek.
Dyskusja
Glikom, termin ukuty przez analogię do genomu i proteomu, odnosi się do wszystkich struktur sacharydowych organizmu. Pełne zrozumienie wielorakich funkcji glikozylacji będzie wymagało zintegrowanego podejścia, obejmującego zarówno funkcjonalne, jak i strukturalne badania glikomiki. Oba te podejścia są utrudnione przez brak matrycy w biosyntezie glikanów, wynikającą z tego złożoność i różnorodność struktur glikanowych, częsty wpływ struktury aglikonu na modulowanie oddziaływań ligand-receptor glikanów na poziomie molekularnym oraz funkcjonalne znaczenie ligandów występujących w niskich stężeniach.
Powszechnie przyjmuje się, że spektrometria mas (MS) jest niezastąpioną metodą w badaniach strukturalnych glikomiki, szczególnie w celu identyfikacji i charakteryzacji ligandów występujących w niskich stężeniach. Aby obserwować glikany lub glikokonjugaty jako gatunki molekularne, często stosuje się wysoce wydajną metodę jonizacji niskoenergetycznej, zwaną jonizacją z rozpylaniem elektrostatycznym (ESI). W celu bardziej szczegółowej charakteryzacji struktury glikanu niezbędne jest wyselekcjonowanie poszczególnych gatunków molekularnych i rozbicie glikanów na mniejsze fragmenty. Zazwyczaj odbywa się to poprzez dysocjację indukowaną kolizyjnie, która polega na aktywacji glikanów poprzez zderzenia z cząsteczkami gazu obojętnego. Zwiększona energia indukuje rozrywanie wiązań, a systematyczna analiza powstałych fragmentów dostarcza informacji o strukturze molekularnej glikanu. Często możliwe jest wygenerowanie fragmentów „sygnaturowych”, które są diagnostyczne dla konkretnych cech strukturalnych glikanu. Wraz z masą molekularną fragmenty te mogą być czasami wystarczające do identyfikacji glikanów, jednak w przeszłości do ich pełnej charakteryzacji wymagano znacznie większej ilości informacji, zwłaszcza w przypadku nowych struktur. Metody te obejmują analizę składu cukrowego, analizę wiązań za pomocą chromatografii gazowej sprzężonej ze spektrometrią mas z użyciem częściowo zmetylowanych octanów alditoli oraz specyficzne trawienie glikozydazami17.
Jak wykazano w ciągu ostatniej dekady18-19, wielokrotne rundy fragmentacji niskiej energii, którą można skutecznie przeprowadzić w spektrometrze mas z pułapką jonową (IT-MS), znacznie zwiększają ilość uzyskanych informacji z analizy widm masowych glikanów. Dzięki czterem lub pięciu rundom fragmentacji (co nie jest możliwe w przypadku innych instrumentów MS), można rozróżnić izomeryczne glikany zawierające te same komponenty cukrowe ułożone w różnych wiązaniach cukrowych, nawet gdy występują one razem w mieszaninach składników o tej samej masie cząsteczkowej (izobarów). Na potrzeby tej analizy glikany poddano derywatyzacji, zastępując wszystkie wolne grupy hydroksylowe grupami metylowymi poprzez permetylację. Choć przypisanie struktury glikanów jest możliwe bez permetylacji, proces ten zwiększa czułość analizy17.
Levery i Zhou połączyli wszystkie potencjalne zalety metodologii IT-MS, w tym wykrywanie struktur izomerycznych za pomocą sygnaturowych jonów diagnostycznych, obserwowalnych wyłącznie w widmach MS4 oraz MS5, w celu wysokoczułej identyfikacji i oznaczania ilościowego glikosfingolipidów występujących w formie wielu mieszanin izobarycznych7-9. Teoretycznie jesteśmy w stanie zidentyfikować każdą istniejącą strukturę glikolipidu, pod warunkiem dostępności standardowych glikolipidów, które mogą zostać zsyntetyzowane chemicznie.
Kluczowym etapem tej analizy jest stopień odzyskiwania GSL z próbek biologicznych. Zazwyczaj ze 100 milionów komórek nowotworowych, takich jak RBL, można odzyskać 80 μg GSL. Aby wygenerować wystarczającą liczbę jonów molekularnych do wielokrotnych rund fragmentacji w spektrometrach mas z pułapką jonową, wymagane jest co najmniej 10 μg GSL z nowotworu. Niska wydajność GSL podczas oczyszczania prowadzi do niskiej liczby jonów, których nie można poddać dalszej fragmentacji. Powodzenie analizy zależy od ilości odzyskanych GSL. Zazwyczaj przed analizą z wykorzystaniem źródła nano-elektrosprayu końcowe stężenie permetylowanych GSL rozpuszczonych w metanolu powinno osiągnąć 1 mg/ml. Granica dokładnej analizy MSn zależy od liczby konkretnych jonów w profilu MS1. Do przeprowadzenia szczegółowej analizy MS5 wymagana jest typowa liczebność jonów rzędu e7. Niska wydajność GSL podczas oczyszczania może być spowodowana utratą GSL na etapie peracetylacji (który usuwa fosfolipidy), gdy peracetylowane GSL muszą zostać związane z kolumną chromatograficzną z żywicą Florisil, przepłukane, a następnie eluowane. Aby zapewnić wiązanie peracetylowanych GSL z żelem krzemionkowym, próbki należy dwukrotnie nanieść na kolumnę chromatograficzną po przepływie przez nią.
Oświadczenia
DZ jest konsultantem firmy BioTex, Houston, TX, oraz wynalazcą zaangażowanym w patenty związane z technologiami wspomnianymi w tym artykule, wydane lub będące w procesie aplikacji.
Podziękowania
DZ jest wspierany przez MD Anderson Cancer Center oraz granty NIH AI079232. MD Anderson Cancer Center jest częściowo wspierany przez grant NIH CA16672.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| 1,2 Dichlor–etan | Sigma-Aldrich | 34872 | Rakotwórczy |
| Kwas octowy | VMR | JT9524-0 | |
| Bezwodnik octowy | Fluka | 45830 | |
| Aceton | Fischer | A18P-4 | |
| Chloroform | Fischer | C606-1 | Rakotwórczy |
| DEAE Sephadex A25 (postać chlorkowa) | GE Healthcare Biosciences | AB 17—170-01 | 100 g |
| Dekan (bezwodny): | Sigma-Aldrich | 457116 | 100 ml |
| Kwas dichlorooctowy | Sigma | D54702 | Rakotwórczy |
| Kaseta dializacyjna | Fischer(Pierce | 66110 | Slide-A-Lyzer, 3500 MWCO, 3-12 ml |
| DMSO | Thermo Scientific | 20684 | |
| Octan etylu | Fischer | UN1173 | |
| Florisil | Fluka | 46384 | do wypełniania kolumny chromatograficznej |
| Heksany | EMD | HX0290-6 | |
| Jodek metylu | Riedel de Haen, Niemcy | 03810 | stabilizowany folią srebrową, rakotwórczy |
| Metanol | VWR/EMD | MXO475-1 | |
| Neutralny Qualmix glikosfingolipidów | Matreya | 1505 | |
| Mieszanina monosjalogangliozydów | Matreya | 1508 | |
| Mieszanina disjalogangliozydów | Matreya | 1509 | |
| Laktozyloceramid i pochodne sjalozylowe | Matreya | 1510 | |
| Gangliotetraozylocearamid i pochodne sjalozylowe | Matreya | 1511 | |
| Pipety Pasteura | Fischer | 13-678-6A | 9"'' |
| Pirydyna: | Sigma | 270407 | |
| Wodorotlenek sodu: | BDH | 0292 | 500 g |
| Metylek sodu | Sigma | 404367 | roztwór 0,5 M w metanolu |
| Toluen | J.T. Baker | 9351-03 | 4 L |
| Pipety Pasteura | Fischer | 13-678-6A | 9"'' |
| Włókno szklane (wełna szklana) | Corning Incorporated | 3950 | szkło Pyrex 9989 |
| Probówki szklane 12x75 mm | Fischer | 14-962-10B | |
| Pipety kalibrowane (100 µl) | VMR | 53432-921 | |
| Jednorazowe probówki borokrzemowe 16x100 mm x1,000 | Fischer | 14-961-29 | Z zakrętkami |
| Zakrętki do probówek szklanych | Kimble | 40566C | rozmiar/13-415 |
| Płytki TLC Merck | Sigma | Z 29, 301-6 | |
| Kuweta szklana do TLC | Sigma | Z 12,619-5 | |
| Mikropipety Drummond Microcaps | Drummond scientific company | 1-000-0100 | 10 μl, do nakładania próbek na TLC |
| Czytnik absorbancji mikropłytek Sunrise | Tecan | A-5082 | |
| Papier chromatograficzny Whatman | Fischer | 05-716-3E | 18 cm x 34 cm do kuwety TLC |
| Odczynnik natryskowy z chlorkiem żelaza i orcinolem | Sigma | O7875 | Do wykrywania glikosfingolipidów na płytkach TLC |
| Urządzenie do natryskiwania Prevel | Sigma | Z 36,555-6 | |
| Sonikator | Fischer | FS20 | |
| Wirówka | Sorvall | Legend RT | |
| Speedvac | Savant | AS160 | Z pułapką chemiczną na rozpuszczalniki organiczne |
| Spektrometr mas MALDI TOF-TOF | Applied Biosystems | Proteomics 4700 | |
| Spektrometr mas z pułapką jonową | Thermo | LTQ |
Bibliografia
- Schnaar, R. L., Suzuki, A., Stanley, P. Chapter 10 Glycosphingolipids. Essentials of Glycobiology. Varki, A., Cummings, R. D., Esko, J. D., Freeze, H. H., Stanley, P., Bertozzi, C. R., Hart, G. W., Etzler, M. E. , 2nd edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, N.Y. (2009).
- Bendelac, A. Chapter 17 NKT cells and other Innate-like T and B lineages. Fundamental Immunology. Paul, W. E. , 6th edition, Lippincott Williams & Wilkins. (2011).
- Jacewicz, M., Clausen, H., Nudelman, E., Donohue-Rolfe, A., Keusch, G. T. Pathogenesis of shigella diarrhea. XI. Isolation of a shigella toxin-binding glycolipid from rabbit jejunum and HeLa cells and its identification as globotriaosylceramide. J. Exp. Med. 163 (6), 1391-1404 (1986).
- Zhou, D. The immunological function of iGb3. Curr. Protein Pept. Sci. 7 (4), 325-333 (2006).
- Miyamoto, K., Miyake, S., Yamamura, T. A synthetic glycolipid prevents autoimmune encephalomyelitis by inducing TH2 bias of natural killer T cells. Nature. 413 (6855), 531-534 (2001).
- Zhou, D., Levery, S. B., Hsu, F. F., Wang, P. G., Teneberg, S., Almeida, I. C., Li, Y., Xu, H., Wang, L. X., Xia, C., Ibrahim, N. K., Michael, K. Immunologic mapping of glycomes: implications for cancer diagnosis and therapy. Frontiers in Bioscience. S3, 1520-1532 (2011).
- Li, Y., Thapa, P., Hawke, D., Kondo, Y., Furukawa, K., Furukawa, K., Hsu, F. F., Adlercreutz, D., Weadge, J., Palcic, M. M., Wang, P. G., Levery, S. B., Zhou, D. Immunologic glycosphingolipidomics and NKT cell development in mouse thymus. J. Proteome Res. 8 (6), 2740-2751 (2009).
- Li, Y., Zhou, D., Xia, C., Wang, P. G., Levery, S. B. Sensitive quantitation of isoglobotriaosylceramide in the presence of isobaric components using electrospray ionization-ion trap mass spectrometry. Glycobiology. 18 (2), 166-176 (2008).
- Li, Y., Teneberg, S., Thapa, P., Bendelac, A., Levery, S. B., Zhou, D. Sensitive detection of isoglobo and globo series tetraglycosylceramides in human thymus by ion trap mass spectrometry. Glycobiology. 18 (2), 158-165 (2008).
- Hakomori, S. I. A rapid permethylation of glycolipid, and polysaccharide catalyzed by methylsulfonyl carbanion in dimethyl sulfoxide. J. Biochem. (Tokyo). 55, 205(1964).
- Ciucanu, I., Kerek, F. Rapid and simultaneous methylation of fatty and hydroxy fatty acids for gas-liquid chromatographic analysis. Carbohydr. Res. 131, 209(1984).
- Kang, P., Mechref, Y., Klouckova, I., Novotny, M. V. Rapid Commun Mass Spectrom. 19 (23), 3421-3428 (2005).
- Levery, S. B., Hakomori, S. Microscale methylation analysis of glycolipids using capillary gas chromatography-chemical ionization mass fragmentography with selected ion monitoring. Methods Enzymol. 138, 13-25 (1987).
- Spooncer, E., Fukuda, M., Klock, J. C., Oates, J. E., Dell, A. Isolation and characterization of polyfucosylated lactosaminoglycan from human granulocytes. J. Biol. Chem. 259 (8), 4792-4801 (1984).
- Ciucanu, I., Costello, C. E. Elimination of oxidative degradation during the per-O-methylation of carbohydrates. J. Am. Chem. Soc. 125, 16213(2003).
- Platt, F. M., Neises, G. R., Karlsson, G. B., Dwek, R. A., Butters, T. D. N-butyldeoxygalactonojirimycin inhibits glycolipid biosynthesis but does not affect N-linked oligosaccharide processing. J. Biol. Chem. 269 (43), 27108-27114 (1994).
- Mulloy, B., Hart, G. W., Stanley, P. Chapter 47 Structural Analysis of Glycans. Essentials of Glycobiology. Varki, A., Cummings, R. D., Esko, J. D., Freeze, H. H., Stanley, P., Bertozzi, C. R., Hart, G. W., Etzler, M. E. , 2nd edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, N.Y. (2009).
- Ashline, D., Singh, S., Hanneman, A., Reinhold, V. Congruent strategies for carbohydrate sequencing. 1. Mining structural details by MSn. Anal. Chem. 77 (19), 6250-6262 (2005).
- Zhang, H., Singh, S., Reinhold, V. N. Congruent strategies for carbohydrate sequencing. 2. FragLib: an MSn spectral library. Anal. Chem. 77 (19), 6263-6270 (2005).
Przedruki i uprawnienia
