Wizualizacja odpowiedzi indukowanych toksynami bakteryjnymi za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej żywych komórek

Summary

Opisano metody oczyszczania toksyny wiążącej cholesterol streptolizyny O z rekombinowanej E. coli oraz wizualizacji wiązania toksyny z żywymi komórkami eukariotycznymi. Miejscowe dostarczanie toksyny indukuje szybkie i złożone zmiany w docelowych komórkach, ujawniając nowe aspekty biologii toksyn.

Abstract

Toksyny bakteryjne wiążą się z cholesterolem w błonach, tworząc pory, które pozwalają na wyciek zawartości komórkowej i napływ materiałów ze środowiska zewnętrznego. Komórka może albo wyzdrowieć z tej zniewagi, co wymaga aktywnych procesów naprawy błony, albo umrzeć w zależności od ilości ekspozycji na toksyny i typu^{komórki 1}. Ponadto toksyny te wywołują silne reakcje zapalne u zakażonych gospodarzy poprzez aktywację komórek odpornościowych, w tym makrofagów, które wytwarzają szereg cytokin prozapalnych². Wiele bakterii Gram-dodatnich wytwarza toksyny wiążące cholesterol, które, jak wykazano, przyczyniają się do ich zjadliwości poprzez w dużej mierze niescharakteryzowane mechanizmy.

Zmiany morfologiczne w błonie komórkowej komórek narażonych na działanie tych toksyn obejmują ich sekwestrację do wzbogaconych w cholesterol wypustek powierzchniowych, które mogą być zrzucane do przestrzeni zewnątrzkomórkowej, co sugeruje wewnętrzny mechanizm obrony komórkowej^3,4. Proces ten zachodzi we wszystkich komórkach przy braku aktywności metabolicznej i może być uwidoczniony za pomocą EM po utrwaleniu chemicznym⁴. W komórkach odpornościowych, takich jak makrofagi, które pośredniczą w stanie zapalnym w odpowiedzi na ekspozycję na toksyny, sugeruje się, że indukowane pęcherzyki błonowe zawierają cytokiny z rodziny IL-1 i mogą być odpowiedzialne zarówno za wydalanie toksyny, jak i rozprzestrzenianie tych cytokin prozapalnych^5,6,7. Zasugerowano związek między uwalnianiem IL-1β a specyficznym rodzajem śmierci komórki, zwanym pyroptozą, ponieważ oba są procesami zależnymi od kaspazy-1⁸. Aby uporządkować złożoność tej odpowiedzi makrofagów, która obejmuje wiązanie toksyn, złuszczanie pęcherzyków błonowych, uwalnianie cytokin i potencjalnie śmierć komórki, opracowaliśmy techniki znakowania i metody mikroskopii fluorescencyjnej, które pozwalają na wizualizację interakcji toksyna-komórka w czasie rzeczywistym, w tym pomiary dysfunkcji i śmierci (Figura 1). Stosowanie obrazowania żywych komórek jest konieczne ze względu na ograniczenia w innych technikach. Podejścia biochemiczne nie są w stanie rozwiązać problemów zachodzących w pojedynczych komórkach, podczas gdy cytometria przepływowa nie oferuje wizualizacji pojedynczych komórek w czasie rzeczywistym w wysokiej rozdzielczości. Opisane tu metody można zastosować do analizy kinetycznej reakcji wywołanych innymi bodźcami obejmującymi złożone zmiany fenotypowe w komórkach.

Protocol

1. Oczyszczanie Streptolizyny O (SLO)

1. Zaszczepić 20 ml nocnej hodowli komórek BL21 GOLD zawierających pBADgIII-SLOhis plazmid⁹ w bulionie o pojemności 0,5 l LB i dodać 500 μl 50 mg/ml ampicyliny. Wstrząsnąć kulturą przy 225 obr./min w temperaturze 37 ° C, aż OD₆₀₀ = 0,6, zwykle ~ 1,5 godziny. Odwirować 1 ml bakterii (uważanych za T₀) po 10 000 x g 5 min, rozpuścić osad w 140 μl 1x bufor próbki SDS / 1 OD i poddać sonikacji w celu ścinania DNA w celu analizy czystości białka.
2. Indukować bakterie z dodatkiem 5 ml 20% arabinozy do hodowli, wstrząsać z prędkością 225 obr./min w temperaturze pokojowej przez 3 godziny. Zebrać 1 ml bakterii, odwirować i rozpuścić w 1x buforze próbki SDS, jak powyżej, dla punktu czasowego T₃ do analizy czystości.
3. Zebrać pozostałe bakterie do butelki wirówkowej o pojemności 500 ml, wirować 12 000 x g przez 12 minut w temperaturze 4 °C (wirnik Sorvall GS-3 8 500 obr./min). Zdekantować supernatant, przechowywać osad w temperaturze -80 °C przez noc lub dłużej, jeśli jest to konieczne.
4. Zawiesić zamrożony osad na lodzie w 10 ml buforu lizyj/płuczącego (50 mM NaH₂PO₄, 300 mM NaCl, 10 mM imidazolu, pH 8,0) uzupełnionego 400 μl 25% Triton X-100, 100 μl 100 mg/ml lizozymu, 50 μl 200 mM fluorku fenylometylosulfonylu (PMSF). Przenieś zawieszony osad do 50 ml probówki Oak Ridge.
5. Sonizuj lizat 5 razy przez 30 sekund na lodzie w odstępach 30 sekund. Wirować sonikowany lizat w dębowej rurze kalenicowej przy 39 000 x g przez 20 minut w temperaturze 4 °C (18 000 obr./min wirnik Sorvall SS-34).
6. Podczas wirowania lizatu przemyć 1 ml agarozy Ni-NTA 10 ml buforu Lyse/Wash i wirować z prędkością 1 200 obr./min przez 5 minut w temperaturze 4 °C. (we wszystkich dalszych płukaniach/elucjach stosuje się odwirowanie w tych warunkach). Ssać mycie.
7. Dodać supernatant bakteryjny z kroku 1.5 do agarozy Ni-NTA, delikatnie wstrząsać przez 2,5 godziny w temperaturze 4 °C. Odwirować, aby zebrać supernatant. Połączyć 30 μl supernatantu z 10 μ 4 razy buforem próbki SDS i zachować do analizy czystości. Przemyj kulki 4 razy w buforze Lyse/Wash i raz w buforze Tris/salt (50 mM Tris, 300 mM NaCl, pH 8,0).
8. Eluować 3 razy, dodając 1 ml buforu elucyjnego (250 mM imidazolu w buforze Tris/sól) i 5 μl 1 M ditiotreitolu (DTT) do kulek, inkubując na lodzie przez 10 minut, wirując i zbierając supernatant. SLO jest białkiem bardzo wrażliwym na redoks i musi być przez cały czas trzymane na lodzie. Po zredukowaniu białko szybko traci swoją aktywność, jeśli zostanie podgrzane do 37 °C, nawet przez krótki czas.
9. Przemyć 500 μl agarozy sprzężonej z polimixyną w buforze elucyjnym, wirować w temperaturze 10 000 x g przez 1 minutę w temperaturze 4 °C i ponownie zawiesić w 500 μl. Aby usunąć endotoksynę, dodać 200 μl kulek do każdej elucji i wstrząsać w temperaturze 4 °C przez 30 minut. Wirować w temperaturze 10 000 x g przez 1 minutę w temperaturze 4 °C i zachować supernatant. Połączyć 30 μl każdej elucji z 10 μl 4x buforem próbki SDS do analizy SDS-PAGE.
10. Przetestuj czystość elucji za pomocą SDS-PAGE. Próbki zapisane do analizy żelowej gotować w temperaturze 95 °C przez 5 minut i załadować 10 μl na 10% żel. Barwnik w żelu za pomocą Coomassie w celu wizualizacji białka (ryc. 2A). SLO wynosi 69 kDa. Wykonaj test Bradforda, aby określić stężenie białka (typowa wydajność wynosi 4 mg/ml dla pierwszych dwóch elucji, ale może się różnić w zależności od użytego szczepu bakteryjnego i plazmidu).
11. Przetestuj aktywność hemolityczną każdej elucji (patrz poniżej). Elucje basenowe, w których czystość, stężenie i aktywność hemolityczna są zadowalające. Podwielokrotność SLO w podwielokrotnościach jednorazowego użytku (zazwyczaj 5–10 μl), zamrozić na suchym lodzie i przechowywać w temperaturze -80 °C.

2. Test hemolityczny

1. Umyć krwinki czerwone owiec (RBC) w buforze do oznaczania RBC (0,3% albuminy surowicy bydlęcej (BSA), 2 mM CaCl₂, 10 mM Hepes, pH 7,4), wirować z prędkością 1,200 obr./min przez 5 minut i ponownie zawiesić przy 2,5% krwinkach czerwonych w 10 ml buforu do oznaczania RBC.
2. Dodać 10 μl buforu/dołka do oznaczania RBC w 96-dołkowej płytce z dnem w kształcie litery V na lodzie. Każdą elucję należy rozcieńczyć seryjnie w dwóch egzemplarzach. Typowe zakresy rozcieńczeń wynoszą od 1:1 000 do 1:512 000. Uwzględnij 3 studzienki bez toksyny i 3 studzienki z 10 μl 2% Triton X-100 jako odpowiednio dołki minimalne i maksymalne.
3. Przykryć płytkę i inkubować w temperaturze 37 °C przez 30 minut. Wirować przy 1 200 obr./min przez 5 min. Przenieść 70 μl supernatantu na płaską płytkę 96-dołkową. Przeczytaj A₄₀₅. Jedna jednostka to rozcieńczenie toksyny wymagane do 50% lizy erytrocytów. Aktywność toksyny wynosi 1 jednostkę* współczynnik rozcieńczenia/0,01 ml.

3. Test lityczny komórek

1. Zbieraj komórki, licz, wiruj. Zawiesić w 2x10⁶/ml w buforze R/B (RPMI z 2 mM CaCl₂, 0,5% BSA) i 20 μg/ml jodku propidyny. Dodaj 100 μl komórek do 96-dołkowej płytki z dnem w kształcie litery V.
2. Seryjnie rozcieńczyć SLO do 2x stężenia końcowego w buforze R/B, dodać 100 μl toksyny lub 100 μl buforu R/B do komórek. Inkubować 5 min 37 °C. Typowe stężenia końcowe wahają się od 2 000 U/ml do 31,25 U/ml.
3. Uruchom komórki na cytometrze przepływowym i zbierz dane za pomocą filtrów dla fikoerytryny (PE). Przesunięcie o jeden log reprezentuje przejściowo przepuszczalne komórki, podczas gdy przesunięcie o 3 logarytmiczne oznacza martwe komórki⁴. Obliczyć specyficzną lizę komórek, odejmując procent martwych komórek w grupie kontrolnej (%PI^wysoki_ctl) od eksperymentalnej (%PI^wysokiej_exp), w następujący sposób: specyficzna liza = (%PI^wysoka_exp-%PI^wysoka_ctl)/(100-%PI^wysoka_ctl)*100

4. Mikropipetowe dostarczanie toksyny do komórek w szalkach hodowlanych

1. Dzień przed eksperymentem umieść 2x10⁵ makrofagów na pokrytej kolagenem naczyniu o średnicy 35 mm ze szklanym dnem.
2. Włącz mikroskop i mikrowtryskiwacz. Pozostawić podgrzany stage czas do ogrzania do 37 °C. Wybór mikroskopu zwykle zależy od tego, co jest dostępne lokalnie. Mikroskop potrzebuje odwróconego stolika, stolika zdolnego do podgrzania naczyń do 37 °C, kostki filtra wzbudzenia/emisji odpowiednie dla wybranego barwnika oraz miejsca do fizycznego podłączenia mikrowtryskiwacza. Soczewka Bertranda jest pomocna w przypadku mikroiniekcji, ale nie jest wymagana. Komputer sterujący mikroskopem potrzebuje wystarczającej ilości pamięci do zbierania i przechowywania danych.
3. Znakować komórki przez 30 minut barwnikiem w temperaturze 37 °C. W zależności od testu, znakowanie można przeprowadzić za pomocą 5 μl Fura2 AM w 1 ml PBS lub 2 μl kalceiny AM w 1 ml pełnej pożywki. W przypadku Fura2 wzbudzenie/emisja jest zbierana dla 340/510 nm i 380/510 nm, a stosunek sygnałów 340/380 określa strumień wapnia. W przypadku kalceiny wzbudzenie/emisja wynosi 495/515 nm, podczas gdy homodimer etydyny wynosi 525/620 nm, a APC wynosi 650/660 nm. Można również wybrać inne etykiety.
4. Umyj komórki PBS i umieść w 1 ml RPMI uzupełnionym 2 mM CaCl₂. Montaż na mikroskopie.
5. Rozcieńczyć toksynę i dekstran w wodzie i odwirować w temperaturze 20 000 x g 10 min przez 4 °C. Zazwyczaj 1 μl SLO i 4 μl 10 mg/ml dekstranu-555 rozcieńcza się w 6 μl wody. Dekstran lub inna fluorescencyjna cząsteczka fazy płynnej służy do sprawdzenia, czy końcówka femto nie jest zatkana i wstrzykuje się ją zgodnie z życzeniem.
6. Załaduj końcówkę femto od tyłu 0,07 μl rozcieńczonej toksyny za pomocą mikroładowarki.
7. Załaduj końcówkę femto na mikrowtryskiwacz. Dostosuj kąt wtryskiwacza tak, aby końcówka znajdowała się nad środkiem komórek z miejscem na ruch we wszystkich kierunkach. Wyczyść limit Z. Ustawienia wtrysku powinny być takie, że wtryskiwanie odbywa się przez 0,5 sekundy przy ciśnieniu 120 psi i przeciwciśnieniu 20 psi. Dolna końcówka, aż wejdzie do medium.
8. Używając soczewki Bertranda, wyśrodkuj końcówkę i podążaj za końcówką, gdy jest opuszczana bliżej komórek. Gdy stracisz ostrość, przełącz się z powrotem na normalną optykę. Cień igły powinien być widoczny w terenie. Ustaw ostrość nad komórkami i opuść igłę, aż będzie ostra. Skoncentruj się z powrotem na komórkach i ostrożnie przyłóż igłę do komórki. Ustawić limit Z dla wstrzyknięcia. Rozpocznij obrazowanie, przesuń końcówkę do żądanej pozycji, wstrzyknij, aby uwolnić toksynę w żądanym punkcie czasowym. Podnieś igłę, przenieś się do nowego obszaru komórek i wstrzyknij. Przesuń igłę do pozycji wyjściowej, aby zapobiec niepożądanemu wyciekowi toksyny z igły.

Results

Zazwyczaj 10^{7-10 8} U/ml SLO można uzyskać przy stężeniu białka 4 mg/ml. Ilość toksyny wymagana do lizy komórek różni się w zależności od typu komórki, ale zwykle wynosi 125-500 U/ml SLO (ryc. 2B). Typy komórek, takie jak makrofagi, mogą być bardziej odporne (4000 U/ml), chociaż inne (zwłaszcza linie komórek T) są bardziej wrażliwe. Wskaźniki wrażliwości te odpowiadają dostępnym na rynku SLO. Aktywność toksyny zmniejsza się około 2-krotnie przy każdym zamrożeniu i rozmrożeniu, dlateg...

Discussion

Opisane tutaj techniki pozwalają na zbadanie odpowiedzi komórek odpornościowych na toksyny bakteryjne. Najważniejszym krokiem jest obchodzenie się z toksyną i jej dawkowanie. Aktywność toksyny może być bardzo zmienna, nawet między różnymi podwielokrotnościami tego samego preparatu, ze względu na jej kruchość. Wymaga to albo zbadania każdej podwielokrotności toksyny w stosunku do referencyjnej linii komórkowej lub erytrocytów, albo zastosowania gradientów toksyn. Gradienty toksyn, dostarczane przez mikropipety, pozwalają ...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agaroza Ni-NTA	Qiagen	30210
polimixin-agaroza	Sigma	P1411-5ML
Zeba Desalt Spin col	Fisher	PI-89891
owce RBC	Fisher	50-415-688
pBADgIII-SLO	N/A	N/	A patrz ref9
Cy5 monoreaktywny barwnik	GE Healthcare
Fura2-AM	Life Technologies	F1221
Calcein AM/ Ethidium homodimer	Life Technologies	L3224
Anti-CD11c-APC	BD Biosciences	550261
naczynie ze szklanym dnem pokryte kolagenem	Mattek	P35GCol-1.5-10-C
femto-tip II	Fisher	E5242957000
Microloader	Fisher	E5242956003
dextran Alexa 555	Life Technologies	D34679
Injectman NI 2	Eppendorf	920000029
FemtoJet	Eppendorf	5247 000.013
Tabela 1. Lista i źródło potrzebnych odczynników i sprzętu. Konkretne urządzenia i odczynniki używane w tym protokole, wraz z numerem firmy i katalogu, są wymienione.
Buffer Composition Step Used Liza/mycie 50 mM NaH2PO4 300 mM NaCl 10 mM imidazol, pH 8,0 1,4 Tris/sól 50 mM Tris, pH 8,0 300 mM NaCl 1,7 Bufor elucyjny 50 mM Tris, pH 8,0 300 mM NaCl 250 mM imidazol 1,8 RBC Bufor testowy 0,3% BSA 2 mM CaCl2 10 mM HEPES, pH 7,4 2,1 buffer R/B RPMI pożywka do hodowli komórkowych 2 mM CaCl2< br/> 0,5% BSA 3.1
Tabela 2. Lista używanych w tym protokole. Zastosowane, ich skład i pierwszy krok, na którym są używane w protokole, są wymienione.