Wizualizacja odpowiedzi indukowanych przez toksyny bakteryjne przy użyciu fluorescencyjnej mikroskopii żywych komórek

Peter A. Keyel; Michelle E. Heid; Simon C. Watkins; Russell D. Salter

doi:10.3791/4227

Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Wizualizacja odpowiedzi indukowanych przez toksyny bakteryjne przy użyciu fluorescencyjnej mikroskopii żywych komórek

11.7K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/4227

⸱

1 października 2012

Peter A. Keyel¹ , Michelle E. Heid¹ , Simon C. Watkins² , Russell D. Salter¹

¹Department of Immunology, University of Pittsburgh School of Medicine, ²Department of Cell Biology and Physiology, University of Pittsburgh School of Medicine

W tym artykule

Podsumowanie

Opisano metody oczyszczania toksyny wiążącej cholesterol, streptolizyny O, z rekombinowanych E. coli oraz wizualizacji wiązania toksyny z żywymi komórkami eukariotycznymi. Lokalna dostawa toksyny indukuje szybkie i złożone zmiany w komórkach docelowych, ujawniając nowe aspekty biologii tej toksyny.

Streszczenie

Toksyny bakteryjne wiążą się z cholesterolem w błonach, tworząc pory, które umożliwiają wyciek zawartości komórkowej oraz napływ materiałów z otoczenia zewnętrznego. W zależności od stopnia ekspozycji na toksynę oraz rodzaju komórki, komórka może albo dojść do siebie po tym uszkodzeniu, co wymaga aktywnych procesów naprawy błony, albo ulec śmierci¹. Ponadto toksyny te indukują silne reakcje zapalne u zakażonych gospodarzy poprzez aktywację komórek odpornościowych, w tym makrofagów, które produkują szereg cytokin prozapalnych². Wiele bakterii Gram-dodatnich produkuje toksyny wiążące cholesterol, o których wykazano, że przyczyniają się do ich wirulencji poprzez w dużej mierze nieopisane mechanizmy.

Zmiany morfologiczne w błonie plazmatycznej komórek eksponowanych na te toksyny obejmują ich sekwestrację w wzbogaconych w cholesterol wypukłości powierzchniowych, które mogą być odrzucane do przestrzeni zewnątrzkomórkowej, co sugeruje istnienie wewnętrznego mechanizmu obronnego komórki^3,4. Proces ten zachodzi we wszystkich komórkach przy braku aktywności metabolicznej i może być wizualizowany za pomocą EM po fiksacji chemicznej⁴. W komórkach odpornościowych, takich jak makrofagi pośredniczące w zapaleniu w odpowiedzi na ekspozycję na toksyny, sugeruje się, że indukowane pęcherzyki błonowe zawierają cytokiny z rodziny IL-1 i mogą odpowiadać zarówno za usuwanie toksyny, jak i za rozprzestrzenianie tych prozapalnych cytokin^5,6,7. Zasugerowano powiązanie między uwalnianiem IL-1β a specyficznym typem śmierci komórkowej, zwanym pyroptozą, ponieważ oba są procesami zależnymi od kaspazy-1⁸. Aby wyjaśnić złożoność odpowiedzi makrofagów, która obejmuje wiązanie toksyn, odrzucanie pęcherzyków błonowych, uwalnianie cytokin, a potencjalnie śmierć komórkową, opracowaliśmy techniki znakowania i metody mikroskopii fluorescencyjnej, które pozwalają na wizualizację interakcji toksyna-komórka w czasie rzeczywistym, w tym na pomiary dysfunkcji i śmierci (Rysunek 1). Zastosowanie obrazowania żywych komórek jest konieczne ze względu na ograniczenia innych technik. Podejścia biochemiczne nie pozwalają na rozdzielenie efektów występujących w pojedynczych komórkach, natomiast cytometria przepływowa nie oferuje wysokiej rozdzielczości wizualizacji pojedynczych komórek w czasie rzeczywistym. Opisane tutaj metody mogą zostać zastosowane do analizy kinetyki odpowiedzi indukowanych przez inne bodźce, wiążących się ze złożonymi zmianami fenotypowymi w komórkach.

Protokół

1. Oczyszczanie streptolizyny O (SLO)

Zaszczepić 20 ml nocnej hodowli komórek BL21 GOLD zawierających plazmid pBADgIII-SLOhis⁹ do 0,5 L bulionu LB i dodać 500 μl ampicyliny o stężeniu 50 mg/ml. Inkubować hodowlę z wytrząsaniem przy 225 rpm w temperaturze 37 °C aż do uzyskania OD₆₀₀ = 0,6, co zwykle zajmuje ~1,5 h. Odwirować 1 ml bakterii (przyjęto jako T₀) przy 10 000 x g przez 5 min, rozpuścić osad w 140 μl 1x buforu do próbek SDS / 1 OD i poddać sonikacji w celu rozbicia DNA do analizy czystości białka.
Indukować bakterie poprzez dodanie do hodowli 5 ml 20% arabinozy i inkubować z wytrząsaniem przy 225 rpm w temperaturze pokojowej przez 3 h. Pobrać 1 ml bakterii, odwirować i rozpuścić w 1x buforze do próbek SDS w sposób opisany powyżej dla punktu czasowego T₃ do analizy czystości.
Zebrać pozostałe bakterie do 500 ml butelki wirówkowej, wirować przy 12 000 x g przez 12 min w temperaturze 4 °C (rotor Sorvall GS-3, 8 500 rpm). Odlać nadsącz, a osad przechowywać w temperaturze -80 °C przez noc lub dłużej, jeśli jest to konieczne.
Resuspendować zamrożony osad na lodzie w 10 ml buforu do lizy i płukania (Lyse/Wash buffer; 50 mM NaH₂PO₄, 300 mM NaCl, 10 mM imidazolu, pH 8,0) uzupełnionego o 400 μl 25% Triton X-100, 100 μl lizozymu o stężeniu 100 mg/ml oraz 50 μl 200 mM fluorku fenylometylosulfonylowego (PMSF). Przenieść resuspendowany osad do probówki Oak Ridge o pojemności 50 ml.
Sonikować lizat 5 razy po 30 s na lodzie w odstępach 30 s. Wirować sonikowany lizat w probówce Oak Ridge przy 39 000 x g przez 20 min w temperaturze 4 °C (rotor Sorvall SS-34, 18 000 rpm).
Podczas wirowania lizatu przemyć 1 ml agarozy Ni-NTA 10 ml buforu do lizy i płukania, a następnie wirować przy 1 200 rpm przez 5 min w temperaturze 4 °C (wszystkie kolejne etapy płukania i elucji należy przeprowadzać w tych samych warunkach wirowania). Odessać płuczkę.
Dodać nadsącz bakteryjny z kroku 1.5 do agarozy Ni-NTA i delikatnie mieszać przez 2,5 h w temperaturze 4 °C. Wirować w celu zebrania nadsączu. Połączyć 30 μl nadsączu z 10 μl 4x buforu do próbek SDS i zachować do analizy czystości. Przemyć ziarna 4 razy buforem do lizy i płukania oraz raz buforem Tris/sól (50 mM Tris, 300 mM NaCl, pH 8,0).
Przeprowadzić elucję trzykrotnie poprzez dodanie do ziaren 1 ml buforu do elucji (250 mM imidazolu w buforze Tris/sól) oraz 5 μl 1 M ditiotreitolu (DTT), inkubować na lodzie przez 10 min, odwirować i zebrać nadsącz. SLO jest białkiem bardzo wrażliwym na utlenianie-redukcję i musi być przez cały czas przechowywane na lodzie. Po redukcji białko szybko traci aktywność w przypadku ogrzania do 37 °C, nawet przez krótki czas.
Przemyć 500 μl agarozy sprzężonej z polimyksyną w buforze do elucji, wirować przy 10 000 x g przez 1 min w temperaturze 4 °C i resuspendować w 500 μl. Aby usunąć endotoksyny, dodać 200 μl ziaren do każdej frakcji elucyjnej i mieszać w temperaturze 4 °C przez 30 min. Wirować przy 10 000 x g przez 1 min w temperaturze 4 °C i zebrać nadsącz. Połączyć 30 μl każdej frakcji elucyjnej z 10 μl 4x buforu do próbek SDS do analizy SDS-PAGE.
Sprawdzić czystość elucji za pomocą SDS-PAGE. Próbki zachowane do analizy żelowej gotować w temperaturze 95 °C przez 5 min i nałożyć 10 μl na żel 10%. Barwić żel błękitem Coomassie, aby zwizualizować białko (Rysunek 2A). Masa SLO wynosi 69 kDa. Wykonać test Bradforda w celu oznaczenia stężenia białka (typowy uzysk dla dwóch pierwszych elucji wynosi 4 mg/ml, ale może się on różnić w zależności od szczepu bakteryjnego i użytego plazmidu).
Przetestować aktywność hemolityczną każdej frakcji elucyjnej (patrz poniżej). Połączyć frakcje elucyjne, w których czystość, stężenie i aktywność hemolityczna są zadowalające. Rozdzielić SLO na jednorazowe alikwoty (zazwyczaj 5-10 μl), zamrozić na lodzie suchym i przechowywać w temperaturze -80 °C.

2. Test hemolityczny

Przemyć erytrocyty owcze (RBCs) w buforze do analizy RBC (0,3% albuminy surowicy bydlęcej (BSA), 2 mM CaCl₂, 10 mM Hepes, pH 7,4), wirować przy 1 200 rpm przez 5 min i resuspendować do stężenia 2,5% RBCs w 10 ml buforu do analizy RBC.
Do każdego dołka płytki 96-dołkowej z wypukłym dnem (V-bottom) umieszczonej na lodzie dodać 10 μl buforu do analizy RBC. Wykonać rozcieńczenia szeregowe każdego eluatu w duplikacie. Typowe zakresy rozcieńczeń wynoszą od 1:1 000 do 1:512 000. Uwzględnić 3 dołki bez toksyny oraz 3 dołki z 10 μl 2% Triton X-100 jako odpowiednio kontrolę minimum i maksimum.
Przykryć płytkę i inkubować w temperaturze 37 °C przez 30 min. Wirować przy 1 200 rpm przez 5 min. Przenieść 70 μl supernatantu do płaskodennej płytki 96-dołkowej. Odczytać A₄₀₅. Jedną jednostką jest rozcieńczenie toksyny wymagane do 50% lizy erytrocytów. Aktywność toksyny oblicza się jako 1 jednostka * czynnik rozcieńczenia / 0,01 ml.

3. Analiza lityczna komórek

Zebrać komórki, policzyć i odwirować. Resuspendować w stężeniu 2x10⁶/ml w buforze R/B (RPMI z 2 mM CaCl₂, 0,5% BSA) i 20 μg/ml jodku propidyny. Przenieść 100 μl zawiesiny komórek do płytki 96-dołkowej z dnem w kształcie litery V.
Przygotować rozcieńczenia szeregowe SLO do dwukrotności stężenia końcowego w buforze R/B, a następnie dodać 100 μl toksyny lub 100 μl buforu R/B do komórek. Inkubować przez 5 min w 37 °C. Typowe stężenia końcowe mieszczą się w zakresie od 2 000 U/ml do 31,25 U/ml.
Przeanalizować komórki za pomocą cytometru przepływowego i zebrać dane przy użyciu filtrów dla fykoerytryny (PE). Przesunięcie o jedną logarytmiczną jednostkę oznacza komórki przejściowo permeabilizowane, natomiast przesunięcie o trzy jednostki logarytmiczne wskazuje na komórki martwe⁴. Obliczyć specyficzną lizę komórek, odejmując procent martwych komórek w kontroli (%PI^high_ctl) od wartości eksperymentalnej (%PI^high_exp), zgodnie z wzorem: specyficzna liza= (%PI^high_exp-%PI^high_ctl)/(100-%PI^high_ctl)*100

4. Podawanie toksyny do komórek w szalkach hodowlanych za pomocą mikropipety

Na jeden dzień przed eksperymentem wysiać 2x10⁵ makrofagi w szalce o średnicy 35 mm z dna szklanego pokrytego kolagenem.
Włącz mikroskop i mikroinżektor. Odczekaj, aż podgrzewany stolik osiągnie temperaturę 37 °C. Wybór mikroskopu zazwyczaj zależy od dostępnego sprzętu w danym laboratorium. Mikroskop musi posiadać odwrócony stolik, system podgrzewania naczyń do 37 °C, kostki filtrów wzbudzenia/emisji odpowiednie dla wybranego barwnika oraz przestrzeń umożliwiającą fizyczne podłączenie mikroinżektora. Przydatna, choć nieobowiązkowa przy mikroiniekcji, jest soczewka Bertranda. Komputer sterujący mikroskopem musi posiadać wystarczającą pamięć do gromadzenia i przechowywania danych.
Barwić komórki przez 30 min w temperaturze 37 °C. W zależności od analizy barwienie można przeprowadzić z użyciem 5 μl Fura2 AM w 1 ml PBS lub 2 μl kalceiny AM w 1 ml pełnej pożywki. W przypadku Fura2 rejestrowane jest wzbudzenie/emisja dla 340/510 nm oraz 380/510 nm, a stosunek sygnałów 340/380 określa przepływ jonów wapnia. Dla kalceiny wzbudzenie/emisja wynosi 495/515 nm, natomiast dla etydyny homodimera 525/620 nm i dla APC 650/660 nm. Można wybrać również inne znaczniki.
Przemyć komórki buforem PBS i przenieść do 1 ml pożywki RPMI uzupełnionej o 2 mM CaCl2₂Zamocuj na mikroskopie.
Rozcieńczyć toksynę i dekstran w wodzie, a następnie odwirować przy 20 000 x g przez 10 min w temperaturze 4 °C. Typowo 1 μl SLO i 4 μl dekstranu-555 o stężeniu 10 mg/ml rozcieńcza się w 6 μl wody. Dekstran lub inną fluorescencyjną cząsteczkę fazy płynnej stosuje się w celu weryfikacji, czy femto-tip nie jest zapchany, a następnie wykonuje wtrysk zgodnie z potrzebami.
Napełnić femto-końcówkę od tyłu 0,07 μl rozcieńczonej toksyny za pomocą mikroladowarki.
Załaduj femtopipetę (femto-tip) do mikroinjektora. Dostosuj kąt nachylenia injektora tak, aby końcówka znajdowała się nad centrum komórek, zachowując przestrzeń do ruchu we wszystkich kierunkach. Zresetuj limit osi Z. Parametry iniekcji powinny być ustawione na czas wtrysku 0,5 s przy ciśnieniu 120 psi i ciśnieniu wstecznym 20 psi. Obniżaj końcówkę, aż znajdzie się w medium.
Używając soczewki Bertranda, wycentruj końcówkę i śledź ją podczas obniżania w kierunku komórek. Po utracie ostrości przełącz się z powrotem na optykę standardową. Cień igły powinien być widoczny w polu widzenia. Ustaw ostrość powyżej komórek i obniżaj igłę, aż stanie się ona widoczna. Ponownie ustaw ostrość na komórkach i ostrożnie zbliż igłę do komórki. Ustaw limit osi Z dla iniekcji. Rozpocznij obrazowanie, przesuń końcówkę do pożądanej pozycji i wykonaj iniekcję, aby uwolnić toksynę w wybranym punkcie czasowym. Podnieś igłę, przesuń ją do nowego obszaru komórek i wykonaj iniekcję. Przesuń igłę do pozycji domyślnej, aby zapobiec niezamierzonemu wyciekowi toksyny z igły.