Biosynteza chrzęstnej macierzy pozakomórkowej przez chondrocyty może ulegać zmianom pod wpływem bodźców mechanicznych. Niniejsza metoda opisuje technikę aplikowania dynamicznych odkształceń ściskających do chondrocytów zamkniętych w konstrukcjach 3D oraz ocenę indukowanych zmian w metabolizmie chondrocytów.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Mechaniczna stymulacja hydrożeli z chondrocytów i agarozy
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Chrząstka stawowa wykazuje ograniczoną zdolność do regeneracji w przypadku uszkodzeń mechanicznych lub degradacji wywołanej chorobą, taką jak choroba zwyrodnieniowa stawów. Aby zniwelować ten niedobór, opracowano kilka interwencji medycznych. Jedną z takich metod jest pokrycie uszkodzonego obszaru chrząstką otrzymaną metodami inżynierii tkankowej; jednak tkanka taka zazwyczaj nie posiada właściwości biochemicznych i trwałości chrząstki natywnej, co stawia pod znakiem zapytania jej długoterminową przeżywalność. Ogranicza to zastosowanie inżynierii tkankowej chrząstki do naprawy małych ubytków ogniskowych, w której ochrona wszczepionego materiału zależy od otaczającej go tkanki. W celu poprawy właściwości opracowanej tkanki popularną metodą wykorzystywaną do zwiększenia syntezy pozakomórkowej macierzy chrzęstnej, a także wynikających z tego właściwości mechanicznych tkanki inżynieryjnej, jest stymulacja mechaniczna. Stymulacja mechaniczna polega na przyłożeniu do konstruktów tkankowych sił analogicznych do tych występujących in vivo. Opiera się to na założeniu, że środowisko mechaniczne w części reguluje rozwój i utrzymanie tkanki natywnej1,2. Najczęściej stosowaną formą stymulacji mechanicznej w inżynierii tkankowej chrząstki jest kompresja dynamiczna przy fizjologicznych odkształceniach wynoszących około 5-20% przy częstotliwości 1 Hz1,3. Liczne badania nad efektami kompresji dynamicznej wykazały jej pozytywny wpływ na metabolizm i biosyntezę chondrocytów, co w ostateczności wpływa na właściwości funkcjonalne opracowanej tkanki4-8. W niniejszej pracy przedstawiamy metodę mechanicznej stymulacji konstruktów z hydrożelu agarozy z chondrocytami pod wpływem kompresji dynamicznej oraz analizujemy zmiany w biosyntezie za pomocą testów biochemicznych i radioizotopowych. Metodę tę można łatwo zmodyfikować w celu oceny wszelkich potencjalnych zmian w odpowiedzi komórkowej wywołanych bodźcami mechanicznymi.
Protokół
1. Izolacja pierwotnych chondrocytów stawowych
Pobierz 10-15 plastrów chrząstki o pełnej grubości z powierzchni stawowych stawów zwierzęcych (np. stawu śródręczno-paliczkowego u dojrzałych szkieletowo krów pozyskanych z lokalnej rzeźni).
- Umieścić plasterki chrząstki w szalce Petri 100 mm i inkubować w 20 ml 0,5% proteazy w Ham's F-12 (w/v) przez 2 hr w 37 °C. Przepłukać trzykrotnie w pożywce Ham's F-12 i inkubować z 20 ml 0,15% kolagenazy A w pożywce Ham's F-12 przez noc w 37 °C.
- Przefiltrować zawiesinę komórkową przez sito o oczkach 200 mesh do czystej szalki. Przepłukać filtr 5 ml Ham's F-12 i dodać do szalk....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Opisana metoda aplikacji kontrolowanych bodźców mechanicznych do hydrożeli agarozowych zasiewionych komórkami umożliwia bezpośrednie badanie wpływu dynamicznych sił kompresyjnych na metabolizm chondrocytów. Zastosowanie specjalnie zaprojektowanego zestawu testowego wraz z pierścieniami stabilizującymi zapewniło ograniczenie boczne konstruktów, co pozwoliło uniknąć potencjalnych problemów z przechylaniem się próbek. Wykorzystanie talerzy obciążających z obciążeniem statycznym, zabezpieczonych śrubami zestawowymi, zapewnia.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Nie zgłoszono żadnych konfliktów interesów.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Pożywka Ham's F-12 | Thermo Fisher Scientific | SH3001002 | |
| Kolagenaza A | Sigma Aldrich Ltd. | C0130 | |
| Proteaza | Sigma Aldrich Ltd. | P5147 | |
| Płodowa surowica bydlęca | Sigma Aldrich Ltd. | F1051 | |
| Kwas askorbinowy | Sigma Aldrich Ltd. | A4034 | |
| Antybiotyki/antybiotyki przeciwgrzybicze | Sigma Aldrich Ltd. | A5955 | |
| HEPES | Bioshop Canada Ltd. | HEP001 | |
| Błękit trypanu | Sigma Aldrich Ltd. | 93595 | |
| Hemacytometr Reichert Bright-Line | Hausser Scientific | 1490 | |
| Quant-iT PicoGreen | Invitrogen | P7589 | |
| Papaina z lateksu papai | Sigma Aldrich Ltd. | P3125 | |
| Octan amonu | Sigma Aldrich Ltd. | A1542 | |
| Kwas etylodiaminotetraoctowy | Sigma Aldrich Ltd. | E9884 | |
| DL-Ditiotreitol | Sigma Aldrich Ltd. | 43819 | |
| Agaroza niskotopliwa, typ VII | Sigma Aldrich Ltd. | A9045 | |
| Filtr z siatki (200) | Sigma Aldrich Ltd. | S4145 | |
| Mikromechaniczny tester Mach-1 | Biomomentum Inc. | V500cs | |
| Uchwyt do obciążania ściskaniem | Własnej konstrukcji | Podobny produkt może zostać dostarczony przez Biomomentum Inc. | |
| 24-dołkowa płytka hodowlana Falcon | Thermo Fisher Scientific | B353047 | |
| β-Licznik scyntylacyjny w cieczy | Beckman Coulter | LS6500 | |
| [3H] Prolina | Perkin-Elmer | NET323005MC | |
| [35S] Siarka | Perkin-Elmer | NEX041005MC |
Bibliografia
- Grodzinsky, A. J. Cartilage tissue remodeling in response to mechanical forces. Annual Review of Biomedical Engineering. 2, 691-713 (2000).
- Kuettner, K. E. Biochemistry of articular cartilage in health and disease. Clinical Biochemistry. 25
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
