Biosynteza chrzęstnej macierzy pozakomórkowej przez chondrocyty może ulegać zmianom pod wpływem bodźców mechanicznych. Niniejsza metoda opisuje technikę aplikowania dynamicznych odkształceń ściskających do chondrocytów zamkniętych w konstrukcjach 3D oraz ocenę indukowanych zmian w metabolizmie chondrocytów.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Mechaniczna stymulacja hydrożeli z chondrocytów i agarozy
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Chrząstka stawowa wykazuje ograniczoną zdolność do regeneracji w przypadku uszkodzeń mechanicznych lub degradacji wywołanej chorobą, taką jak choroba zwyrodnieniowa stawów. Aby zniwelować ten niedobór, opracowano kilka interwencji medycznych. Jedną z takich metod jest pokrycie uszkodzonego obszaru chrząstką otrzymaną metodami inżynierii tkankowej; jednak tkanka taka zazwyczaj nie posiada właściwości biochemicznych i trwałości chrząstki natywnej, co stawia pod znakiem zapytania jej długoterminową przeżywalność. Ogranicza to zastosowanie inżynierii tkankowej chrząstki do naprawy małych ubytków ogniskowych, w której ochrona wszczepionego materiału zależy od otaczającej go tkanki. W celu poprawy właściwości opracowanej tkanki popularną metodą wykorzystywaną do zwiększenia syntezy pozakomórkowej macierzy chrzęstnej, a także wynikających z tego właściwości mechanicznych tkanki inżynieryjnej, jest stymulacja mechaniczna. Stymulacja mechaniczna polega na przyłożeniu do konstruktów tkankowych sił analogicznych do tych występujących in vivo. Opiera się to na założeniu, że środowisko mechaniczne w części reguluje rozwój i utrzymanie tkanki natywnej1,2. Najczęściej stosowaną formą stymulacji mechanicznej w inżynierii tkankowej chrząstki jest kompresja dynamiczna przy fizjologicznych odkształceniach wynoszących około 5-20% przy częstotliwości 1 Hz1,3. Liczne badania nad efektami kompresji dynamicznej wykazały jej pozytywny wpływ na metabolizm i biosyntezę chondrocytów, co w ostateczności wpływa na właściwości funkcjonalne opracowanej tkanki4-8. W niniejszej pracy przedstawiamy metodę mechanicznej stymulacji konstruktów z hydrożelu agarozy z chondrocytami pod wpływem kompresji dynamicznej oraz analizujemy zmiany w biosyntezie za pomocą testów biochemicznych i radioizotopowych. Metodę tę można łatwo zmodyfikować w celu oceny wszelkich potencjalnych zmian w odpowiedzi komórkowej wywołanych bodźcami mechanicznymi.
Protokół
1. Izolacja pierwotnych chondrocytów stawowych
Pobierz 10-15 plastrów chrząstki o pełnej grubości z powierzchni stawowych stawów zwierzęcych (np. stawu śródręczno-paliczkowego u dojrzałych szkieletowo krów pozyskanych z lokalnej rzeźni).
- Umieścić plasterki chrząstki w szalce Petri 100 mm i inkubować w 20 ml 0,5% proteazy w Ham's F-12 (w/v) przez 2 hr w 37 °C. Przepłukać trzykrotnie w pożywce Ham's F-12 i inkubować z 20 ml 0,15% kolagenazy A w pożywce Ham's F-12 przez noc w 37 °C.
- Przefiltrować zawiesinę komórkową przez sito o oczkach 200 mesh do czystej szalki. Przepłukać filtr 5 ml Ham's F-12 i dodać do szalki. Przenieść zawiesinę komórkową do stożkowej probówki 50 ml. Przepłukać szalkę Petri 10 ml Ham's F-12 i dodać do probówki stożkowej.
- Wirować probówkę przy 600-800 rcf przez 6-8 min w temperaturze pokojowej.
- Odssać nadosad, uważając, aby nie naruszyć osadu komórkowego, i ponownie zawiesić w 40 ml pożywki Ham's F-12.
- Wirować probówkę przy 600-800 rcf przez 6-8 min.
- Powtórzyć kroki 1.4 i 1.5 jeszcze dwa razy, aby łącznie wykonać je 3 razy. Przed trzecim wirowaniem resuspendować osad poprzez wytrząsanie i pobrać alikwot 500 μl do zliczenia komórek.
- Policzyć żywe komórki metodą wykluczania błękitu trypanu9 przy użyciu hemacytometru i odwróconego mikroskopu świetlnego.
- Odssać nadosad i zawiesić osad w objętości pożywki Ham's F-12 tak, aby uzyskać dwukrotność pożądanej gęstości wysiewu (np. 20 x 106 komórek/ml dla końcowego stężenia 10 x 106 komórek/ml po enkapsulacji).
2. Enkapsulacja chondrocytów w hydrożelu agarozowym
- Podgrzać 0,8 g autoklawowanej agarozy typu VII w 20 ml sterylnego 1x PBS (pH 7,4) na płycie grzewczej ustawionej na 120 °C aż do rozpuszczenia. Po rozpuszczeniu obniżyć temperaturę do 60 °C, ponieważ wyższe temperatury wpływają na żywotność komórek.
- W stożkowej probówce o pojemności 50 ml dokładnie wymieszać równe objętości zawiesiny komórek z agarozą o dwukrotnie wyższym stężeniu niż pożądane (np. 4% zawiesina agarozy dla końcowego 2% hydrożelu agarozowego). Unikać powstawania dużych pęcherzyków powietrza, ponieważ mogą one wpływać na żywotność komórek i trwałość zmęczeniową konstrukcji.
- Ostrożnie odmierzyć 10 ml mieszaniny chondrocytów i agarozy do szalki Petriego o średnicy 60 mm, unikając powstawania dużych pęcherzyków powietrza.
- Pozostawić na 30 min w temperaturze pokojowej do czasu zżelowania.
- Pobrać wymaganą liczbę próbek hydrożelu agarozowego z chondrocytami (zazwyczaj 20-30), używając wycinaka do biopsji o średnicy 4 mm.
- Zmierzyć i zapisać wymiary fizyczne (średnicę i wysokość) reprezentatywnych próbek za pomocą mikrometru. Konstrukcje powinny mieć wysokość około 5 mm; należy odrzucić próbki pobrane z obszaru, w którym wariancja wysokości próbki przekraczała 2%.
- Przenieść próbki do nowej szalki Petriego o średnicy 60 mm i uzupełnić 10 ml pożywki kompletnej (np. 20% płodowej surowicy bydlęcej w pożywce hodowlanej Ham's F-12 z 20 mM HEPES, 100 μg/ml kwasu askorbinowego oraz 2x antybiotykami/antymykotykami).
3. Stymulacja mechaniczna i znakowanie radiacyjne hydrożeli z chondrocytów i agarozy
- Zautoklawować metalowe elementy zestawu do kompresji. Komponenty plastikowe wysterylizować 70% etanolem (przez noc) oraz światłem UV (przez co najmniej 15 min).
- Aby zapobiec przewracaniu się konstruktów, za pomocą pęsety umieścić 12 sterylnych plastikowych pierścieni stabilizujących (o średnicy wewnętrznej większej niż średnica konstruktu) (n=6, próbki i kontrole) w dołkach płytki hodowlanej 24-dołkowej.
- Za pomocą pęsety ostrożnie przenieść hydrożele chondrocytowo-agarozowe z szalki Petriego do płytki 24-dołkowej, zabezpieczając każdy z nich w pierścieniu stabilizującym.
- Przenieść 400 μl pełnej pożywki (np. 20% FBS w pożywce hodowlanej Ham's F-12 z 20 mM HEPES, 100 μg/ml kwasu askorbinowego oraz 2x antybiotykami/antybiotykami przeciwgrzybiczymi) do każdego dołka z próbką.
- Złożyć wysterylizowany zestaw do kompresji (Rysunek 1) i zabezpieczyć talerze za pomocą śrub imbusowych. Przymocować zestaw do kompresji do płytki hodowlanej 24-dołkowej.
- Poluzować i ponownie dokręcić śruby imbusowe, aby ustanowić kontakt między talerzem a hydrożelem (stan zerowego odkształcenia).
- Załadować złożony zestaw do kompresji do systemu testów mikromechanicznych Mach-1. Zabezpieczyć zestaw na stole pionowym za pomocą bolca pozycjonującego i zablokować śrubą imbusową. Usunąć szablon dystansowy.
- Zastosować dynamiczne obciążenie kompresyjne o żądanej amplitudzie (np. amplituda odkształcenia 10% w stosunku do pierwotnej wysokości próbek), częstotliwości (np. 1 Hz) oraz czasie trwania lub liczbie cykli (np. interwały czasowe do 60 min).
- Po zakończeniu stymulacji mechanicznej ponownie założyć szablon dystansowy, poluzować śrubę imbusową bolca pozycjonującego i wyjąć zestaw do kompresji oraz płytkę hodowlaną z systemu testów mikromechanicznych Mach-1.
- Oznakować radiacyjnie konstrukty komórkowo-hydrożelowe poprzez uzupełnienie pożywki o 5 μCi wybranego izotopu (np. znacznik białkowy [3H]-prolina dla syntezy kolagenu specyficznego dla chondrocytów oraz [35S]-siarka dla syntezy proteoglikanów).
- Inkubować oznakowane radiacyjnie konstrukty przez 24 hr w temperaturze 37 °C, 5% CO210.
- Zebrać oznakowane radiacyjnie konstrukty hydrożelowe i wypłukać 3 razy w 1x PBS (pH 7.4), aby usunąć niewbudowany izotop. Przetrawić próbki za pomocą papainy (40 μg/ml w 20 mM octanie amonu, 1 mM kwasie etylenodiaminooctowym i 2 mM ditiotreitolu w 65 °C przez 72 hr).
- Niezwłocznie po trawieniu papainą przeprowadzić analizę zawartości DNA w hydrolizacie przy użyciu testu z barwnikiem PicoGreen11 oraz pomiar aktywności wbudowanego izotopu, znormalizowany do zawartości DNA, za pomocą β-scyntylacji w cieczy12,13.
Uwaga: Zakup i utylizacja materiałów radioaktywnych (izotopów odpadowych oraz przedmiotów, które mogły mieć kontakt z materiałami radioaktywnymi) muszą być zgodne z odpowiednimi instytucjonalnymi (i/lub rządowymi) politykami i procedurami dotyczącymi bezpiecznego obchodzenia się z substancjami radioaktywnymi i ich utylizacji.
4. Reprezentatywne wyniki
Konstrukcje hydrożelowe z agarozy i wołowych chondrocytów stawowych (2% agarozy z enkapsulowanymi komórkami w zagęszczeniu 10 x 106 komórek/ml) poddawano stymulacji mechanicznej z amplitudą odkształcenia ściskającego 10% przy częstotliwości 1 Hz przez 20 do 60 min (lub od 1200 do 3600 cykli), a następnie analizowano zawartość DNA oraz syntezę macierzy zewnątrzkomórkowej metodą wbudowy radioizotopów. Synteza DNA i macierzy zewnątrzkomórkowej zmieniała się w sposób zależny od dawki. Zawartość DNA wykazała istotny spadek o 35% w wyniku 20 lub 30 min stymulacji (p<0,01), podczas gdy 60 min stymulacji nie wywołało żadnego efektu (Rycina 2). Synteza kolagenu i proteoglikanów specyficznych dla chrząstki (oznaczona odpowiednio poprzez wbudowywanie [3H]-proliny i [35S]-siarki) wykazała istotne wzrosty o około 60% w odpowiedzi na 20 lub 30 min stymulacji (p<0,01), przy czym 60 min stymulacji nie wywołało zauważalnego efektu (Rycina 3).
Rycina 1. Schemat niestandardowej aparatury do kompresji dynamicznej służącej do stymulacji konstruktów chondrocytów w agarozie. Lewo: Zmontowana aparatura. Prawo: Widok rozstrzelony przedstawiający poszczególne komponenty.
Rycina 2. Zmiany zawartości DNA w hydrożelach agarozowych z chondrocytami, poddanych stymulacji mechanicznej przy amplitudzie odkształcenia ściskającego 10% z częstotliwością 1 Hz przez okres od 20 do 60 min (średnia ± SEM, n=6/grupa).
Rysunek 3. Zmiany w syntezie macierzy zewnątrzkomórkowej (kolagenu i proteoglikanów) w hydrożelach agarozowych z chondrocytami, stymulowanych mechanicznie przy amplitudzie odkształcenia ściskającego 10% z częstotliwością 1 Hz przez 20 do 60 min (średnia ± SEM, n=6/grupa).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Opisana metoda aplikacji kontrolowanych bodźców mechanicznych do hydrożeli agarozowych zasiewionych komórkami umożliwia bezpośrednie badanie wpływu dynamicznych sił kompresyjnych na metabolizm chondrocytów. Zastosowanie specjalnie zaprojektowanego zestawu testowego wraz z pierścieniami stabilizującymi zapewniło ograniczenie boczne konstruktów, co pozwoliło uniknąć potencjalnych problemów z przechylaniem się próbek. Wykorzystanie talerzy obciążających z obciążeniem statycznym, zabezpieczonych śrubami zestawowymi, zapewnia...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Nie zgłoszono żadnych konfliktów interesów.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Pożywka Ham's F-12 | Thermo Fisher Scientific | SH3001002 | |
| Kolagenaza A | Sigma Aldrich Ltd. | C0130 | |
| Proteaza | Sigma Aldrich Ltd. | P5147 | |
| Płodowa surowica bydlęca | Sigma Aldrich Ltd. | F1051 | |
| Kwas askorbinowy | Sigma Aldrich Ltd. | A4034 | |
| Antybiotyki/antybiotyki przeciwgrzybicze | Sigma Aldrich Ltd. | A5955 | |
| HEPES | Bioshop Canada Ltd. | HEP001 | |
| Błękit trypanu | Sigma Aldrich Ltd. | 93595 | |
| Hemacytometr Reichert Bright-Line | Hausser Scientific | 1490 | |
| Quant-iT PicoGreen | Invitrogen | P7589 | |
| Papaina z lateksu papai | Sigma Aldrich Ltd. | P3125 | |
| Octan amonu | Sigma Aldrich Ltd. | A1542 | |
| Kwas etylodiaminotetraoctowy | Sigma Aldrich Ltd. | E9884 | |
| DL-Ditiotreitol | Sigma Aldrich Ltd. | 43819 | |
| Agaroza niskotopliwa, typ VII | Sigma Aldrich Ltd. | A9045 | |
| Filtr z siatki (200) | Sigma Aldrich Ltd. | S4145 | |
| Mikromechaniczny tester Mach-1 | Biomomentum Inc. | V500cs | |
| Uchwyt do obciążania ściskaniem | Własnej konstrukcji | Podobny produkt może zostać dostarczony przez Biomomentum Inc. | |
| 24-dołkowa płytka hodowlana Falcon | Thermo Fisher Scientific | B353047 | |
| β-Licznik scyntylacyjny w cieczy | Beckman Coulter | LS6500 | |
| [3H] Prolina | Perkin-Elmer | NET323005MC | |
| [35S] Siarka | Perkin-Elmer | NEX041005MC |
Bibliografia
- Grodzinsky, A. J. Cartilage tissue remodeling in response to mechanical forces. Annual Review of Biomedical Engineering. 2, 691-713 (2000).
- Kuettner, K. E. Biochemistry of articular cartilage in health and disease. Clinical Biochemistry. 25, 155-163 (1992).
- Neu, C. P. The interface of functional biotribology and regenerative medicine in synovial joints. Tissue Engineering Part B: Reviews. 14, 235-247 (2008).
- Demarteau, O. Dynamic compression of cartilage constructs engineered from expanded human articular chondrocytes. Biochemical and Biophysical Research Communications. 310, 580-588 (2003).
- Waldman, S. D. Long-term intermittent compressive stimulation improves the composition and mechanical properties of tissue-engineered cartilage. Tissue Engineering. 10, 1323-1331 (2004).
- Hunter, C. J. Dynamic compression of chondrocyte-seeded fibrin gels: effects on matrix accumulation and mechanical stiffness. Osteoarthritis and Cartilage. 12, 117-130 (2004).
- Buschmann, M. D. Mechanical compression modulates matrix biosynthesis in chondrocyte/agarose culture. Journal of Cell Science. 108 (Pt 4), 1497-1508 (1995).
- Quinn, T. M. Mechanical compression alters proteoglycan deposition and matrix deformation around individual cells in cartilage explants. Journal of Cell Science. 111 (Pt 5), 573-583 (1998).
- Kuettner, K. E. Synthesis of cartilage matrix by mammalian chondrocytes in vitro. I. Isolation, culture characteristics, and morphology. The Journal of Cell Biology. 93, 743-750 (1982).
- Lee, D. A. Mechanical loading of chondrocytes embedded in 3D constructs: in vitro methods for assessment of morphological and metabolic response to compressive strain. Methods in Molecular Medicine. 100, 307-324 (2004).
- McGowan, K. B. Biochemical quantification of DNA in human articular and septal cartilage using PicoGreen and Hoechst 33258. Osteoarthritis and Cartilage. 10, 580-587 (2002).
- Fan, J. C. Y. The effect of intermittent static biaxial tensile strains on tissue engineered cartilage. Annals of Biomedical Engineering. 38, 1672-1682 (2010).
- Kaupp, J. A. Mechanical vibrations increase the proliferation of articular chondrocytes in high-density culture. Proceedings of the Institution of Mechanical Engineers, Part H: Journal of Engineering in Medicine. 222, 695-703 (2008).
- Waldman, S. D. Long-term intermittent shear deformation improves the quality of cartilaginous tissue formed in vitro. Journal of Orthopaedic Research. 21, 590-596 (2003).
- Waldman, S. D. A single application of cyclic loading can accelerate matrix deposition and enhance the properties of tissue-engineered cartilage. Osteoarthritis and Cartilage. 14, 323-330 (2006).
- Kisiday, J. D. Effects of dynamic compressive loading on chondrocyte biosynthesis in self-assembling peptide scaffolds. Journal of Biomechanics. 37, 595-604 (2004).
- Chowdhury, T. T. Temporal regulation of chondrocyte metabolism in agarose constructs subjected to dynamic compression. Archives of Biochemistry and Biophysics. 417, 105-111 (2003).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
