Ekstrakcja antygenów tkankowych do analiz funkcjonalnych

Podsumowanie

Opisano prosty protokół przygotowania ekstraktów z ludzkich tkanek, które służą jako źródło antygenów w funkcjonalnych testach limfocytów T. Metoda ta pozwala na pomiar odpowiedzi limfocytów T na antygeny pochodzące z tkanek in vitro.

Streszczenie

Wiele antygenów będących celami adaptacyjnej odpowiedzi immunologicznej, rozpoznawanych przez limfocyty B i T, nie zostało jeszcze zdefiniowanych ¹. Dotyczy to w szczególności chorób autoimmunologicznych oraz nowotworów². Naszym celem jest zbadanie antygenów rozpoznawanych przez ludzkie limfocyty T w autoimmunologicznej chorobie, jaką jest cukrzyca typu 1 ^1,3,4,5. Aby przeanalizować odpowiedzi ludzkich limfocytów T przeciwko tkankom, w których antygeny rozpoznawane przez te komórki nie są zidentyfikowane, opracowaliśmy metodę ekstrakcji antygenów białkowych z ludzkich tkanek w formie kompatybilnej z testami funkcjonalnymi ⁶. Wcześniej pomiar odpowiedzi limfocytów T na nieoczyszczone ekstrakty tkankowe był niemożliwy, ponieważ metody ekstrakcji prowadziły do uzyskania lizatu zawierającego detergenty toksyczne dla ludzkich mononuklearnych komórek krwi obwodowej (PBMC). W niniejszym protokole opisujemy metodę ekstrakcji białek z ludzkich tkanek w formie nietoksycznej dla ludzkich limfocytów T. Tkanka jest homogenizowana w mieszaninie butanolu-1, acetonitrylu i wody (BAW). Po zmierzeniu stężenia białka w ekstrakcie tkankowym, znana masa białka jest rozdzielana do probówek. Po ekstrakcji rozpuszczalniki organiczne są usuwane poprzez liofilizację. Liofilizowane ekstrakty tkankowe mogą być przechowywane do czasu użycia. Do zastosowania w testach funkcji immunologicznych, zawiesinę komórek odpornościowych w odpowiedniej pożywce hodowlanej można dodać bezpośrednio do liofilizowanego ekstraktu. Produkcja cytokin oraz proliferacja PBMC w odpowiedzi na ekstrakty przygotowane tą metodą były łatwo mierzalne. Zatem nasza metoda pozwala na szybkie przygotowanie lizatów ludzkich tkanek, które mogą służyć jako źródło antygenów w analizie odpowiedzi limfocytów T. Sugerujemy, że metoda ta ułatwi analizę adaptacyjnych odpowiedzi immunologicznych na tkanki w transplantologii, onkologii i autoimmunologii.

Protokół

1. Przygotowanie tkanki śledziony

1. Uwaga – wszystkie materiały pochodzenia ludzkiego należy traktować jako potencjalnie zakaźne, a wszystkie procedury powinny być przeprowadzane w komorze z laminarnym przepływem powietrza klasy II. Używając sterylnych nożyczek i pęsety, należy usunąć tłuszcz oraz tkankę włóknistą z przekrojów śledziony (o wielkości ~1-2 cm) i maksymalnie odciąć materiał torebki zewnętrznej.
2. Odciąć mały fragment (1-2 cm³) tkanki śledziony i umieścić każdy fragment w sterylnej probówce Falcon 50 ml.
3. Szybko zamrozić fragmenty tkanki poprzez zanurzenie w ciekłym N₂.
4. Przechowywać w temperaturze -80 °C. Podobny protokół jest odpowiedni dla innych tkanek.

2. Przygotowanie ludzkich wysepek do przechowywania

1. Hodować wyspy w medium CMRL. Zebrać wyspy do probówki stożkowej o pojemności 10 ml i dwukrotnie przemyć w PBS, wirując przy 1 500 rpm przez 5 min. Odlać PBS i usunąć pozostały bufor, kładąc na chwilę odwróconą probówkę na ręczniku papierowym. Należy uważać, aby nie wypłukać wysp.
2. Po osuszeniu ponownie zamknąć probówkę, zamrozić błyskawicznie w ciekłym azocie i przechowywać w temperaturze -80 °C.

3. Przygotowanie ekstraktu

1. Przygotować mieszaninę BAW (10:30:60 %v/v) i przechowywać w temperaturze 4 °C.
2. Wyjąć probówkę z temperatury -80 °C. Rozmrozić w temperaturze pokojowej.
3. Dodać odpowiednią ilość lodowatego BAW, aby pokryć fragment tkanki. W przypadku wysepek stosować 3-5 ml. W przypadku tkanki śledziony stosować 10-20 ml, w zależności od wielkości fragmentu tkanki.
4. Złożyć homogenizator tkankowy. Oczyścić poprzez „homogenizację” 10-20 ml 70% etanolu/wody.
5. Zhomogenizować tkankę w kilku cyklach (bursts), po umieszczeniu sondy homogenizatora w probówce z tkanką i roztworem BAW. Następnie przechowywać probówkę w wiadrze z lodem.
6. Dokładnie oczyścić homogenizator pomiędzy próbkami, homogenizując 10-20 ml 70% etanolu/wody, a następnie bufor BAW. Zapobiega to kontaminacji krzyżowej tkanek pomiędzy próbkami. Po użyciu zdemontować i oczyścić 70% etanolem/wodą.
7. Jeśli wymagany jest ekstrakt zawierający wyłącznie materiał rozpuszczalny, zhomogenizowany ekstrakt tkankowy wirować przy 4,000 rpm w temperaturze pokojowej przez 10 min. Jeśli wymagany jest ekstrakt bardziej surowy, wirować przy 1,000 rpm w temperaturze pokojowej przez 5 min. Najodpowiedniejsza technika ekstrakcji białek nierozpuszczalnych w BAW zależy od dalszej analizy białek. Do zastosowań w funkcjonalnych testach immunologicznych sugerujemy próbę rozpuszczenia frakcji nierozpuszczalnej w 8 M mocznika, ponieważ wcześniej stwierdziliśmy, że jest ona dobrze tolerowana⁶.
8. Przenieść nadsącz do czystej probówki i umieścić na lodzie.
9. Oznaczyć stężenie białka w ekstrakcie przy użyciu testu BCA lub analogicznego.

4. Liofilizacja ekstraktów

1. W zależności od wymaganej masy białka (t.j. 100 μg na probówkę), odpowiednio rozcieńczyć homogenat i rozdzielić aliquoty do oznakowanych, sterylnych probówek Falcon 5,0 ml (12x75 mm). Często stosujemy 100 μg/probówkę.
2. Za pomocą sterylnej igły do strzykawki o rozmiarze 18-20 G wykonać 3 otwory w zakrętce każdej probówki.
3. Zamrozić probówki, umieszczając je na suchym lodzie przez ok. 10 min lub w zamrażarce -80 °C przez >1 h. Przechowywać w temperaturze -80 °C do momentu umieszczenia w liofilizatorze.
4. Włączyć liofilizator i pozwolić mu osiągnąć temperaturę równowagi (-100 °C). Trwa to około 30 min.
5. W zależności od objętości liofilizacja może zostać zakończona w ciągu 3 h, jednak rutynowo pozostawiamy próbki na noc.
6. Po zakończeniu cyklu suszenia wyłączyć pompę próżniową i powoli wyrównać ciśnienie w komorze. Wyjąć kasetę.
7. W sterylnej komorze z laminarnym przepływem powietrza zdjąć perforowane zakrętki z probówek i zastąpić je nowymi (Falcon 352032).
8. Przechowywać probówki w temperaturze -20 °C. Próbki można zrekonstytuować w pożywce hodowlanej lub innych buforach i wykorzystać w testach funkcjonalnych lub biochemicznych.

5. Reprezentatywne wyniki

Rysunek 1 przedstawia barwienie żelu białkowego z naniesionym ekstraktem z śledziony i tkanki trzustkowej pozbawionej wysepek (oznaczonej jako acinar) oraz oczyszczonymi ludzkimi wysepkami (oznaczonymi jako islets). Wyniki pokazują dobrą reprezentację białek o różnych masach cząsteczkowych dla każdej z tkanek.

Zdolność ekstraktów tkankowych do stymulowania proliferacji ludzkich limfocytów T została przetestowana za pomocą testu proliferacji opartego na CFSE⁷ (Rycina 2). PBMC wykorzystane w tym badaniu wyizolowano od osoby z cukrzycą typu 1. Wielkość odpowiedzi wyrażono jako stosunek liczby komórek CFSE^dim na 5 000 komórek CD4⁺, CFSE^bright bez antygenu do liczby komórek CFSE^dim na 5 000 komórek CD4⁺, CFSE^bright z antygenem, na podstawie próbek wykonanych w trzech powtórzeniach⁷. Wyniki wykazują słabą, lecz wykrywalną proliferację w odpowiedzi na ekstrakt z komórek acynarnych (CD1=3,5) oraz silniejszą odpowiedź na ekstrakt z wysepek (6,8). Inaktywowany wirus grypy (CDI= 142,6) został włączony jako kontrola pozytywna.

Rycina 1. Żel białkowy.

Rycina 2. Wyniki testu proliferacji opartego na CFSE przeciwko ekstraktom z komórek acynarnych i wysepek trzustkowych. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną rycinię.

Dyskusja

Niniejszy protokół został opracowany w celu uzyskania ekstraktu z tkanki ludzkiej wolnego od substancji toksycznych, takich jak detergenty. W szczególności został on wykorzystany do przygotowania ekstraktów z tkanki ludzkiej, które mogą być stosowane w testach funkcji układu odpornościowego człowieka in vitro. Ekstrakty przygotowane zgodnie z tym protokołem mogą być również rekonstytuowane w dowolnym buforze i wykorzystywane do wielu analiz biochemicznych, takich jak western blotting czy chromatografia cieczowa....

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
sterylne probówki polistyrenowe 5 ml 12 x 75 mm	BD Falcon	352054
Zakrętki do probówek polistyrenowych (powyżej)	BD Falcon	352032
probówki sterylne 50 ml	Becton Dickinson	352070
Acetonitryl	Mallinckradt Chemicals	2856-10
Butan-1-ol	Sigma Aldrich	537993-IL
Homogenizator: PRO200	Biostrategia	01-01200	generator ząbkowany 10 x 115 mm
Liofilizator			Virtis, Benchtop 4K
Sterylna igła 18-20 G	Becton Dickinson	REF 302032
Pożywka CMRL-1066	Sigma	C0422
PBS	Sigma	D8537
Tabela 1. Specyficzne odczynniki i sprzęt.