Łączenie interfejsu bioelektronicznego z biofabrykacją

Podsumowanie

Ten artykuł opisuje podejście do biofabrykacji: osadzanie polisacharydów reagujących na bodźce w obecności stronniczych elektrod w celu stworzenia biokompatybilnych folii, które mogą być funkcjonalizowane z komórkami lub białkami. Przedstawiamy laboratoryjną strategię generowania folii, a także ich podstawowe zastosowania do tworzenia interaktywnych biofunkcjonalnych powierzchni do zastosowań typu lab-on-a-chip.

Streszczenie

Postępy w technologii lab-on-a-chip obiecują zrewolucjonizować zarówno badania, jak i medycynę dzięki niższym kosztom, lepszej czułości, przenośności i większej przepustowości. Włączenie komponentów biologicznych do biologicznych systemów mikroelektromechanicznych (bioMEMS) wykazało ogromny potencjał w osiąganiu tych celów. Mikrofabrykowane chipy elektroniczne pozwalają na funkcje w skali mikrometrycznej, a także połączenie elektryczne do wykrywania i uruchamiania. Funkcjonalne komponenty biologiczne nadają systemowi zdolność do specyficznego wykrywania analitów, funkcji enzymatycznych i możliwości całej komórki. Standardowe procesy mikrofabrykacji i techniki bioanalityczne są z powodzeniem stosowane od dziesięcioleci odpowiednio w przemyśle komputerowym i biologicznym. Ich połączenie i współpraca w środowisku lab-on-a-chip rodzi jednak nowe wyzwania. Istnieje zapotrzebowanie na techniki, które mogą zbudować interfejs między elektrodą a komponentem biologicznym, który jest łagodny i łatwy do wytworzenia i modelowania.

Biofabrykacja, opisana tutaj, jest jednym z takich podejść, które okazały się bardzo obiecujące ze względu na łatwą do złożenia integrację komponentów biologicznych z wszechstronnością w funkcjach na chipie, które są włączone. Biofabrykacja wykorzystuje materiały biologiczne i mechanizmy biologiczne (samoorganizacja, składanie enzymatyczne) do oddolnego montażu hierarchicznego. Podczas gdy nasze laboratoria zademonstrowały te koncepcje w wielu formatach ^1,2,3, tutaj demonstrujemy proces montażu oparty na elektroosadzaniu, po którym następuje wiele zastosowań oddziaływań opartych na sygnałach. Proces składania polega na elektroosadzaniu biokompatybilnych folii polimerowych reagujących na bodźce na elektrodach, a następnie ich funkcjonalizacji składnikami biologicznymi, takimi jak DNA, enzymy lub żywe komórki ^4,5. Elektroosadzanie wykorzystuje gradient pH utworzony na powierzchni spolaryzowanej elektrody w wyniku elektrolizy wody ^6,7,. Chitozan i alginian to reagujące na bodźce polimery biologiczne, które mogą zostać pobudzone do samoorganizacji w warstwy hydrożelowe w odpowiedzi na narzucone sygnały elektryczne ⁸. Grubość tych hydrożeli zależy od stopnia, w jakim gradient pH rozciąga się od elektrody. Można to modyfikować za pomocą różnych gęstości prądu i czasów osadzania ^6,7. Protokół ten opisuje, w jaki sposób folie chitozanowe są osadzane i funkcjonalizowane przez kowalencyjne przyłączanie składników biologicznych do licznych pierwszorzędowych grup aminowych obecnych na folii za pomocą metod enzymatycznych lub elektrochemicznych ^9,10. Omówione zostaną również filmy alginianowe i ich uwięzienie w żywych komórkach ¹¹. Wreszcie, użyteczność biofabrykacji wykazano na przykładach interakcji opartych na sygnale, w tym transmisji sygnału chemicznego do elektrycznego, komórkowego, a także enzymatycznego do komórki.

Zarówno elektrodepozycja, jak i funkcjonalizacja mogą być wykonywane w warunkach zbliżonych do fizjologicznych, bez potrzeby stosowania odczynników, a tym samym oszczędzają labilne składniki biologiczne przed trudnymi warunkami. Ponadto zarówno chitozan, jak i alginian są od dawna stosowane do celów biologicznie istotnych ^12,13. Ogólnie rzecz biorąc, biofabrykacja, szybka technika, którą można po prostu wykonać na stole laboratoryjnym, może być wykorzystywana do tworzenia wzorów funkcjonalnych składników biologicznych w skali mikronowej na elektrodach i może być wykorzystywana do różnych zastosowań typu lab-on-a-chip.

Protokół

1. Elektrodepozycja alginianowa

1. Podłącz zasilacz do niestandardowych elektrod za pomocą krosowych za pomocą zacisków krokodylkowych. Szkiełko szklane pokryte tlenkiem indu i cyny (ITO) będzie działać jako anoda (elektroda robocza), a folia platynowa będzie służyć jako katoda (przeciwelektroda). Ustawić elektrody tak, aby powierzchnia ITO, która ma być funkcjonalizowana, była przeciwstawna do przeciwelektrody i była ustawiona pionowo w celu zanurzenia w roztworze lub poziomo tak, aby roztwór osadzający znajdował się na powierzchni.
2. Przygotować roztwór do osadzania alginianów, mieszając 1% alginianu i 0,5% CaCO₃ (wagowo) w wodzie destylowanej, a następnie autoklawując roztwór. Zaleca się ciągłe mieszanie roztworu, gdy nie jest używany.
3. Zanurz obie elektrody w roztworze do osadzania. Zastosowany alginian może być znakowany fluorescencyjnie za pomocą FluoroSpheres (Invitrogen), zgodnie z Cheng i wsp. ¹⁴, aby umożliwić obrazowanie fluorescencyjne powstałego filmu.
4. Zastosuj stałą gęstość prądu (3 A/m²) przez 2 minuty; napięcie zmieni się w zakresie 2-3 V.
5. Odłączyć elektrodę i usunąć nieosadzony roztwór. Delikatnie spłucz folię NaCl (0,145 M), aby usunąć zbędny alginian.
6. Krótko inkubować film (~1 min) w CaCl₂ (0,1 M) w celu wzmocnienia żelu. Przepłukać NaCl (0,145 M) i inkubować w pożądanym roztworze uzupełnionym CaCl₂ (1 mM).
7. Obraz za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego (ryc. 1B).

2. Pozycja kodowa komunikujących się populacji komórek w alginianie

1. Hodowla komórek nadawczych sygnału (W3110 wt E. coli), hodowana w pożywce LB, oraz hodowla komórkowa odbiornika sygnału (MDAI2 + pCT6-lsrR-amp ^r + pET-dsRed-kan ^r), hodowana w pożywce LB + 50 μg/ml kanamycyny i ampicyliny, muszą być hodowane przez noc i ponownie inokulowane w celu wzrostu do gęstości optycznej (przy 600 nm) 1. Przed użyciem dostosuj gęstość optyczną hodowli komórek odbiorczych do 0,4-0,6 za pomocą LB.
2. Przygotować roztwór do osadzania składający się z 2% alginianu i 1% CaCO₃ i wymieszać z każdą kulturą komórkową w stosunku 1:1 do końcowego stężenia 1% alginianu, 0,5% CaCO₃, z komórkami rozcieńczonymi do gęstości około połowy gęstości hodowli.
3. Użyć szkiełka podstawowego z dwoma elektrodami ITO zawartymi w studzience polidimetylosiloksanu (PDMS) (przygotowanej zgodnie z instrukcjami Sylgarda i przyciętej do pożądanego rozmiaru) oraz przeciwelektrodą platynową. Podłącz jedną elektrodę ITO do zasilacza z platyną, jak opisano w procedurze 1 (Elektroosadzanie alginianowe).
4. Zanurz elektrody w roztworze do osadzania zawierającym ogniwa odbiorcze. Ustaw zasilacz na stały prąd o gęstości 3 A/m², gdzie wymiar pola powierzchni jest określony przez pojedynczą elektrodę, na której nastąpi osadzanie.
5. Stosuj prąd przez 2 minuty, aby umożliwić kodowanie komórek w matrycy alginianowej.
6. Wypłucz folię zgodnie z opisem w kroku 1.5.
7. Przełącz połączenie anodowe na drugą, sąsiednią elektrodę ITO.
8. Powtórz procedurę osadzania (kroki 2.4 - 2.7), ale tym razem wprowadzając roztwór zawierający komórki nadawcze.
9. Inkubować 2-elektrodowy chip zawierający współosadzone komórki i alginian wapnia przez noc w temperaturze 37 °C w buforowanym roztworze soli fizjologicznej (PBS) uzupełnionym 10% pożywką LB i 1 mM CaCl₂.
10. Po inkubacji zobrazuj za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego (ryc. 2B).

3. Elektroosadzanie chitozanu

1. Podłącz zasilacz do elektrod za pomocą zacisków krokodylkowych. Pokryty złotem chip krzemowy będzie działał jako katoda (elektroda robocza), a folia platynowa będzie służyć jako anoda (przeciwelektroda). Ustaw powierzchnię złotej elektrody tak, aby przeciwstawiała się przeciwelektrodzie i obie są ustawione albo pionowo do zanurzenia w roztworze, albo poziomo, tak aby roztwór do osadzania był zawarty na powierzchni.
2. Przygotuj roztwór chitozanu, mieszając płatki chitozanu z wodą i powoli dodając 2 M HCl w celu rozpuszczenia polisacharydów (końcowe pH 5,6), upewniając się, że postępujesz zgodnie z procedurą opisaną przez Meyera i wsp. ¹⁵.
3. Umieścić elektrody w roztworze chitozanu (0,8%), całkowicie zanurzając żądany obszar do osadzania. Zastosowany chitozan może być znakowany fluorescencyjnie estrem sukcynimidylu 5-(i-6)-karboksyrodaminy 6G (Invitrogen), zgodnie z Wu i wsp. ⁸, aby zobrazować folię osadzoną elektrolitycznie za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej.
4. Stosować prąd o stałej gęstości (4 A/^{m 2}) przez 2 minuty. Napięcie zmieni się w zakresie 2-3 V. Oblicz gęstość prądu w funkcji powierzchni złota elektrody roboczej poddanej działaniu roztworu osadzającego.
5. Przepłucz elektrodę wodą DI, aby usunąć zbędny chitozan. Chip może być przechowywany w wodzie lub PBS (10 mM, pH 7,0).
6. Obraz za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego (rysunek 3C).

4. Transdukcja elektrochemiczna z funkcjonalizowaną folią chitozanową

1. Osadzanie chitozanu i oksydazy glukozowej (GOx) z roztworu (1% chitozan, 680 U/ml GOx, pH 5,6) o gęstości prądu 4 A/^m2 na elektrodzie o wzorzystym wzorze zgodnie z procedurą 3 (elektroosadzanie chitozanu). Zostanie wygenerowany film chitozanowy uwięziony w GOx.
2. Podłącz obrabianą elektrodę do układu trzyelektrodowego jako elektrody roboczej, drutu platynowego jako przeciwelektrody i Ag/AgCl jako elektrody odniesienia, jak opisano na rysunku 4A.
3. Zanurzyć elektrody w roztworze buforu fosforanowego (0,1 M, pH 7,0) zawierającym NaCl (0,1 M).
4. Elektrochemicznie sprzęgnąć białko z filmem chitozanu, przykładając stałe napięcie (0,9 V) przez 60 sekund za pomocą chronoamperometrii¹⁰.
5. Umieścić chip w buforze fosforanowym (0,1 M, pH 7,0) i myć przez 10 minut na wytrząsarce orbitalnej w celu usunięcia nieprzereagowanego NaCl i niesprzężonego GOx.
6. Ponownie podłącz do systemu trzech elektrod zgodnie z opisem w kroku 4.2 i zanurz w roztworze 5 mM glukozy. Korzystając z woltamperometrii cyklicznej, przemiataj potencjał w kierunku dodatnim do 0,7 V. Użyj filmu kontrolnego niezawierającego oksydazy glukozowej jako porównania dla ilości utlenienia obserwowanego podczas przemiatania (Rysunek 4B).
7. Wyjąć elektrody z roztworu glukozy i przepłukać buforem fosforanowym (0,1 M, pH 7,0), a następnie umieścić elektrody w zlewce o pojemności 10 ml zawierającej 8 ml buforu fosforanowego (0,1 M, pH 7,0). Odchyl układ scalony funkcjonalizowany GOx do 0,6 V, aby służył jako elektroda robocza (ilustracja 4C).
8. Dodać podwielokrotności glukozy do buforu (każda podwielokrotność zwiększa stężenie glukozy o 4 mM).
9. Wygeneruj krzywą standardową między prądem w stanie ustalonym a stężeniem glukozy dla funkcjonalizowanej GOx warstwy chitozanu.

5. Funkcjonalizacja białek za pomocą składania enzymatycznego

1. Użyj szkiełka podstawowego z sąsiednią elektrodą ze złota i ITO znajdującą się w studzience PDMS. Odchyl złotą elektrodę o potencjale katodowym do elektroosadzania chitozanu, jak pokazano wcześniej. Krótko spłucz folię w wodzie DI, a następnie PBS za pomocą pipety.
2. Dodać roztwór 3 μM niebieskiego fluorescencyjnie znakowanego "Syntaza AI-2" ¹⁶ (przy użyciu zestawu do znakowania DyLight) + 100 U/ml tyrozynazy w PBS.
3. Inkubować przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej, a następnie spłukać folię PBS.
4. Zastosować potencjał anodowy do elektrody ITO w celu współosadzenia roztworu do osadzania alginianów zawierającego ogniwa odbiorcze (jak przygotowano w krokach 2.1-2.2). Postępuj zgodnie z krokami 2.3-2.6 Procedury 2 (Kodowanie populacji komórek w alginacie).
5. Aby wygenerować przesyłany sygnał (AI-2) enzymatycznie, po wypłukaniu folii dodać roztwór 500 μM S-adenozylohomocysteiny (SAH) w PBS, uzupełniony 10% pożywką LB i 1mM CaCl₂. Przykryć elektrody, aby zapobiec parowaniu roztworu i inkubować przez noc w temperaturze 37 °C. Pozwoli to na odpowiedź komórki odbiorczej poprzez wygenerowanie białka czerwonej fluorescencji (dsRed).
6. Sąsiednie elektrody można obrazować za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej, dostosowując filtry w celu wychwycenia niebieskiej fluorescencji syntazy AI-2 i czerwonej fluorescencji wyrażonej przez współosadzone komórki odbiorcze (Figura 5B).

6. Reprezentatywne wyniki

Imponowane sygnały elektryczne mogą tworzyć zlokalizowane mikrośrodowiska (np. pola i gradienty) w pobliżu powierzchni elektrody, a te bodźce mogą wywołać samoorganizację polisacharydów, takich jak alginian i chitozan, aby osadzać się jako hydrożelowy film na powierzchni elektrody. Ponieważ to przejście zol-żel zachodzi na powierzchni elektrody, powstała warstwa jest adresowana elektroenergetycznie, a jej geometria pasuje do wzoru elektrody (rysunki 1B, 3C). Biokompatybilne folie, takie jak alginian i chitozan, zapewniają powierzchnie, które można funkcjonalizować składnikami biologicznymi. Za pomocą alginianu unikalne populacje komórek zostały wspólnie zdeponowane pod różnymi adresami. Dowody ich elektroadresacji obserwuje się po interakcji między populacją komórek nadawczych i odbiorczych. Cząsteczka autoinduktora-2 (AI-2) dyfunduje z komórek nadawczych i jest wychwytywana przez komórki odbiorcze, powodując ekspresję białka czerwonej fluorescencji dsRed (ryc. 2A). Na rysunku 2B czerwoną fluorescencję obserwuje się tylko na elektrodzie, do której adresowane są odbiorniki.

Grupy aminowe obecne na chitozanie zapewniają mu reakcję pH wymaganą do elektroosadzania, jak również powierzchnię odpowiednią do funkcjonalizacji. Wykorzystaliśmy te unikalne właściwości poprzez elektrochemiczne sprzężenie enzymu biosensorycznego oksydazy glukozowej (GOx) z elektrolitycznie osadzonymi warstwami chitozanu. Enzym ten zapewnia następnie zdolność wykrywania glukozy poprzez reakcję enzymatyczną (ryc. 4A) wytwarzającą nadtlenek wodoru, który można następnie elektrochemicznie utlenić w celu wytworzenia prądu wyjściowego. W ten sposób sygnał chemiczny może zostać przekształcony w sygnał elektryczny. Rysunek 4B pokazuje, że folie, w których GOx był elektrochemicznie sprzężony, wytwarzają silny sygnał anodowy w obecności glukozy, w przeciwieństwie do folii zawierających GOx. Wyniki te wskazują, że GOx może być montowany na osadzonej warstwie chitozanu i zachowuje aktywność katalityczną. Co więcej, rysunek 4C pokazuje skokowy wzrost prądu anodowego wytwarzanego w odpowiedzi na rosnące stężenie glukozy. Krzywa standardowa obecna również na rysunku 4C pokazuje, że skokowe wzrosty postępowały w sposób niemal liniowy, w zależności od ilości dodanej glukozy. Wyniki te pokazują, że enzym zachowuje również swoją wrażliwość na wzrost stężenia glukozy po sprzężeniu z filmem chitozanu. Dolna granica wykrywalności nie była tutaj badana, ponieważ została wcześniej scharakteryzowana dla tego układu w pracach Meyera i wsp.

Pokazaliśmy również kowalencyjną immobilizację interesującego nas enzymu, zaprojektowanego tak, aby zawierał niestandardowy znacznik penta-tyrozyny, do chitozanu w sposób kontrolowany enzymatycznie. W szczególności w procesie tym pośredniczy enzym tyrozynaza. Jak pokazano na schemacie na rysunku 5A (góra), enzym, syntaza AI-2 zawiera znacznik penta-tyrozyny. Tyrozynaza działa na znacznik tyrozynowy, utleniając grupy fenolowe reszt do O-chinonów, które następnie kowalencyjnie wiążą się z aminami chitozanu. Dowody na funkcjonalizację filmu chitozanowego syntazą AI-2 przez montaż tyrozynazy obserwuje się na rysunku 5B, gdzie syntaza AI-2 została fluorescencyjnie oznaczona na niebiesko. Ponieważ syntaza AI-2 generuje AI-2 z substratu homocysteiny S-adenozylu (SAH) w taki sam sposób, jak komórki nadawcze, jej bliskość do współzdeponowanych komórek odbiorczych w obecności SAH powoduje również, że komórki odbiorcze reagują fluorescencyjnie poprzez ekspresję dsRed (Figura 5A (poniżej)). Czerwona fluorescencja komórek odbiorczych (ryc. 5B) ponownie demonstruje interakcję między adresami spowodowaną dyfuzją AI-2 z jednego do drugiego, a ponadto wskazuje, że enzymy unieruchomione chitozanem zachowują aktywność po kowalencyjnym związaniu.

Rysunek 1. Elektroosadzanie alginianu. (A) Mechanizm elektroosadzania alginianów: Ponieważ elektroda jest spolaryzowana anodowo, na jej powierzchni zachodzi elektroliza wody, generując miejscowo niskie pH. Cząstki węglanu wapnia reagują z nadwyżką protonów, uwalniając kationy wapnia podczas rozpuszczania cząstek. W obecności łańcuchów polimerowych alginianowych jony ulegają chelatacji w sieci "eggbox", tworząc usieciowany hydrożel na elektrodzie. Wraz ze wzrostem odległości od elektrody alginian ma większą tendencję do pozostawania w roztworze ze względu na zmniejszoną obecność jonów wapnia. (B) Elektroda ITO w kształcie litery L została użyta do elektroosadzania alginianu. Studzienka PDMS została przymocowana do elektrody, aby zawierała zielony, znakowany fluorescencyjnie alginian (1%) i roztwór do osadzania CaCO₃ (0,5%). Po elektroosadzaniu przez 2 minuty przy gęstości prądu 3A/^m2, elektroadresowany hydrożel alginianowy zobrazowano za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej.

Rysunek 2. Kodowanie populacji komórek. (A) Schemat pokazujący interakcję między dwoma szczepami E. coli: Jedna populacja wytwarza autoinduktor-2 (AI-2), cząsteczkę sygnałową i jest określana jako "nadawca AI-2". Druga populacja, określana jako "odbiornik AI-2", jest reporterem AI-2; po otrzymaniu AI-2 przez dyfuzję od nadawcy ulega ekspresji białka czerwonej fluorescencji dsRed. (b) Obraz czerwonej fluorescencji pary elektrod z populacją nadawców AI-2 zdeponowaną alginianem na lewej elektrodzie i populacją odbiornika AI-2 zdeponowaną alginianem na prawej elektrodzie. Widok w powiększeniu pokazuje ekspresję dsRed tylko odbiorników AI-2.

Rysunek 3. Elektroosadzanie chitozanu. (A) Schemat przedstawiający elektroosadzanie chitozanu w zależności od pH. Elektroliza wody na elektrodzie spolaryzowanej katodowo powoduje miejscowe wysokie pH (pokazane przez miejscową zmianę koloru barwnika wskaźnika pH w pobliżu katody na mikrografice), które stymuluje przemianę zol-żel chitozanu w tym obszarze. (B) Aminy obecne w chitozanie nadają mu właściwości reagujące na pH. Powyżej pH 6,3 (pKa chitozanu) aminy są deprotonowane, co ułatwia przejście z protonowanej postaci rozpuszczalnej do nierozpuszczalnej postaci żelowej. (C) Wzorzysta złota elektroda została użyta do elektroosadzania chitozanu. Elektroda, podłączona katodowo do zasilacza, została zanurzona w zielonym, znakowanym fluorescencyjnie roztworze do osadzania chitozanu (0,8%). Po elektroosadzaniu przez 2 minuty przy gęstości prądu 4 A/^m2, elektroadresowany film chitozanowy został zobrazowany za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej.

Rysunek 4. Transdukcja elektrochemiczna z funkcjonalizowaną warstwą chitozanu. (A) Schemat przedstawiający budowę systemu trzech elektrod. Funkcjonalizowany film chitozanowy służy jako elektroda robocza, drut platynowy jako przeciwelektroda, a Ag/AgCl jako elektroda odniesienia. Elektrochemiczna transdukcja glukozy przebiega poprzez reakcje enzymatyczne i elektrochemiczne pokazane, w których wytworzony nadtlenek wodoru może zostać utleniony i wykryty na elektrodzie roboczej. (B) Cykliczny woltammagram (CV) na elektrodzie z filmem chitozanowym zawierającym elektrochemicznie sprzężoną oksydazę glukozową (GOx) wykazuje silny sygnał anodowy w roztworze glukozy o stężeniu 5 mM. Film niezawierający GOx służył jako kontrola i nie wyświetlał żadnego sygnału w tym samym roztworze. (C) Krzywa standardowa między prądem anodowym a stężeniem glukozy wykazuje zależność zbliżoną do liniowej (każda podwielokrotność zwiększyła stężenie glukozy o 4 mM, a także zwiększyła amplitudę prądu na wykresie wstawkowym w sposób krokowy).

Rysunek 5. Funkcjonalizacja białek za pomocą składania enzymatycznego. (A, górny) Schemat pokazujący oznaczoną tyrozyną "syntazę AI-2" kowalencyjnie przywiązaną do filmu chitozanowego przez zespół tyrozynazy. Reszty tyrozyny utleniają się do O-chinonów przez działanie tyrozynazy i mogą reagować z grupami aminowymi na filmie chitozanu, tworząc wiązanie kowalencyjne. (A, dolny) Syntaza AI-2 generuje AI-2 z substratu (SAH); komórki odbiorcze zgłaszają wygenerowany AI-2 przez ekspresję fluorescencji dsRed. (B) Obrazy fluorescencyjne przedstawiające film chitozanowy na złocie, funkcjonalizowany niebiesko znakowaną syntazą AI-2. Obok komórki odbiorcze AI-2 są współosadzane z alginianem na ITO. Po dodaniu substratu enzymatycznego do studzienki i inkubacji, komórki odbiorcze AI-2 wykazują ekspresję dsRed.

Dyskusja

Nasze procedury demonstrują elektroosadzanie i funkcjonalizację folii biopolimerowych, proces, który nazywamy biofabrykacją. Poprzez funkcjonalizację komórkami i biomolekułami tworzymy powierzchnie biologiczne zdolne do interakcji ze sobą i adresem elektrod, na którym są zamontowane. Pierwszy krok, elektroosadzanie, odbywa się poprzez wyzwoloną samoorganizację biopolimerów, alginianu i chitozanu w naszych badaniach, w odpowiedzi na sygnał elektryczny. Jak wspomniano wcześniej, generowany jest gradient pH, który może być kontrolowany przez aktualną gęstość i czas osadzania, zapewniając dodatkową kontrolę nad wymiarami i właściwościami folii ^6,17. Odkryliśmy, że dla elektrod wskazanych w tabeli 1 można zastosować różne kombinacje gęstości prądu i czasu osadzania. Chociaż użycie innych elektrod jest wykonalne, konieczne byłoby dostosowanie procedury. W porównaniu z innymi technikami tworzenia filmu proces elektroosadzania jest prosty, szybki i bezodczynnikowy. Nie ma potrzeby posiadania rozbudowanego repertuaru drogiego sprzętu i pracochłonnych przygotowań. Co ważne, proces jest odporny na niewielkie odchylenia eksperymentalne i można go łatwo rozpocząć od nowa, jeśli wystąpi problem.

Chitozan jest w stanie reagować na wysoki katodowy gradient pH ze względu na ważne właściwości funkcjonalne nadane mu przez wysoką zawartość amin pierwszorzędowych. Przy wysokim pH (większym niż pKa ~6,3) aminy są deprotonowane, a chitozan staje się nierozpuszczalny, co pozwala na tworzenie filmu. Po osadzeniu folie pozostaną przymocowane do elektrody. Istnieje jednak możliwość ich rozwarstwienia w razie potrzeby. Folie pozostaną stabilne, dopóki pH roztworu nie spadnie poniżej pKa. Roztwory kwasowe protonują aminy, a następujące po nich odpychania elektrostatyczne pęcznieją żel, aż się rozpuści ¹⁸. Oznacza to, że proces montażu/demontażu jest odwracalny na żądanie i pozwala na usunięcie osadzonych folii i ponowne wykorzystanie elektrod. Dogodnie, zakres pH, w którym zachodzi przemiana zol-żel, jest zbliżony do tego, w którym większość składników biologicznych działa optymalnie. To sprawia, że proces ten idealnie nadaje się do zachowania funkcjonalności podczas montażu⁶.

Tworzenie filmu alginianowego jest ułatwione przez anodową elektrolizę wody, a także obecność węglanu wapnia ⁷. Miejscowe niskie pH na anodzie rozpuszcza węglan wapnia, prowadząc do uwalniania kationów wapnia. Jony te są chelatowane przez alginian, tworząc usieciowaną sieć na powierzchni elektrody. Filmy alginianowe są w szczególności odwracalne przez konkurencję o jony wapnia z innych związków chelatujących, takich jak cytrynian lub EDTA, które można wykorzystać do rozpuszczenia folii, co pozwala na ponowne wykorzystanie leżących pod nimi elektrod. W związku z tym filmy alginianowe są stosunkowo delikatne, gdy są poddawane warunkom fizjologicznym, ponieważ jony wapnia są łatwo wychwytywane z matrycy żelowej, osłabiając jej strukturę i sprzyjając rozwarstwieniu lub regniotowi filmu. Aby przezwyciężyć to ograniczenie, dołączyliśmy etap inkubacji folii w 1 M CaCl₂ w celu wzmocnienia żelu. Dodatkowo zalecamy uzupełnienie roztworu inkubacyjnego folii (pożywki komórkowe itp.) o CaCl₂ w stężeniu 500 μM-3 mM.

Drugą ważną procedurą jest funkcjonalizacja osadzonej folii odpowiednimi składnikami biologicznymi. Można to osiągnąć na dwa sposoby, pierwszym z nich jest koniugacja elektrochemiczna, strategia, która pozwala na szybkie, bezodczynnikowe składanie białek z wyjątkową kontrolą przestrzenną ¹⁰. Jednak funkcjonalizacja w ten sposób jest ograniczona przez dyfuzję jonów Cl^- przez folię do elektrody, a także dyfuzję HOCl, wytworzonego reaktywnego produktu pośredniego, z powrotem do roztworu. Zdolność elektrochemicznie aktywnych cząsteczek do przechodzenia przez folię pozwala na transdukcję sygnałów chemicznych i biologicznych na łatwe do odczytania sygnały elektryczne ¹⁵. Pokazaliśmy sprzężenie za pośrednictwem tyrozynazy jako drugą strategię funkcjonalizacji enzymu z chitozanem, wykazaną przez kowalencyjne przyłączanie syntazy AI-2. Strategia ta pozwala na kontrolowanie i selektywne działanie procesu funkcjonalizacji - zależnego od określonego odczynnika, tyrozynazy, który działa dyskryminująco na białka zawierające znacznik tyrozyny ⁹.

Pokazujemy przydatność i biokompatybilność systemów wieloadresowych poprzez replikację naturalnych ścieżek na chipie. Najpierw zorganizowaliśmy dwie populacje komórek (tj. "nadawców" i "odbiorców") pod różnymi adresami i wykazaliśmy, że oddziaływały one na sąsiednie elektrody, dostarczając AI-2 i generując odpowiedź fluorescencyjną. Koncepcja ta została również zademonstrowana przez Cheng i wsp. w chipie mikroprzepływowym ¹⁴. Naśladowaliśmy również interakcję, ale zamiast tego użyliśmy enzymu do syntezy AI-2 w celu dostarczenia. W ten sposób syntetyczny szlak wewnątrzkomórkowy, synteza AI-2, został zreplikowany poprzez biofabrykację i działał podobnie jak w roztworze.

W obu przypadkach montaż wielu adresów stanowi wyzwanie polegające na uniknięciu niespecyficznego wiązania między adresami, ponieważ każdy roztwór osadzania musi być wprowadzony do całego układu elektrod, nawet jeśli elektroosadzanie jest przeznaczone tylko dla jednego adresu. Delikatne, ale dokładne mycie może usunąć większość pozostałości roztworu z niespolaryzowanych elektrod; Zastosowanie przepływu w kanałach mikroprzepływowych może dodatkowo zminimalizować nieswoistość. Szczególnie w przypadku sąsiedniej biofabrykacji adresów chitozanu i alginianu zalecamy najpierw zdeponowanie filmu chitozanowego, następnie etapy biofunkcjonalizacji, a następnie elektroosadzanie alginianu. Chociaż nie zrobiliśmy tego tutaj, odkryliśmy, że blokowanie filmu chitozanu za pomocą obojętnych białek (takich jak mleko, BSA itp.) znacznie zmniejsza niespecyficzne wiązanie niepożądanych cząsteczek z aminowaną powierzchnią chitozanu.

Znaleźliśmy użyteczność w ustaleniu wzorzystych elektrod, często spotykanych w urządzeniach bioMEMS, jako "planów" dla złożonego układu komórek i biomolekuł. Zastosowania chitozanu osadzanego elektrolitycznie w urządzeniach bioMEMS mogą znacznie wykraczać poza wymienione tu przykłady ¹⁹. Chitozan może być osadzany na różnych geometriach w mikroskali - np. w mikrokanałach i na powierzchniach niepłaskich ^20,15. Folie mogą być również modyfikowane za pomocą innych polimerów i różnych białek, DNA, nanocząsteczek i cząsteczek aktywnych redoks w celu uzyskania nowych właściwości ^21,22,23. W urządzeniach bioMEMS folie chitozanowe były wykorzystywane do dostarczania leków, wykrywania redoks i małych cząsteczek, biokatalizy i badań komórkowych ^20,23,24,25. Podobnie, alginian jest szeroko stosowany jako matryca uwięzienia komórek i został zbadany pod kątem odwracalnego płynnego zatrzymywania populacji komórek i immunoanalizy w filmie ^26,27,28. Folie kompozytowe do zastosowań w inżynierii tkankowej zostały wytworzone przy użyciu elektroosadzania alginianowego, z komponentami takimi jak hydroksyapatyt do implantów ortopedycznych ²⁹.

W naszych demonstracjach biofabrykacji wykazaliśmy, że zarówno interakcje między składnikami biologicznymi, jak i na całym interfejsie bioelektronicznym są równie przydatne; Stwarza to perspektywę integracji wszystkich rodzajów interakcji w celu uzyskania wyrafinowanej wydajności w transmisji sygnału na chipie. W związku z tym biofabrykacja może ułatwić wytwarzanie urządzeń o zmniejszonych "minimalnych rozmiarach funkcji" jako bezpośrednia kontynuacja szybkiego rozwoju mikrofabrykacji, często motywowanej przez elektronikę użytkową. Oznacza to, że następne urządzenia nowej generacji mogą w rzeczywistości zawierać labilne komponenty biologiczne, które oferują znakomite możliwości naturalnego montażu i rozpoznawania w jeszcze mniejszej skali niż systemy stworzone przez człowieka. Przewidujemy w najbliższej przyszłości zastosowania w oprzyrządowaniu analitycznym, czujnikach środowiskowych, a nawet biokompatybilnych urządzeniach wszczepialnych.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Zasilacz	Keithley	SourceMeter 2400
Potencjostat z trzema elektrodami	CH Instruments	Potentiostat/Galvanostat 600D
RE-5B Ag/AgCl Elektroda referencyjna z elastycznym złączem	BASi	MF-2052
Pozłacany wafel silikonowy, 500um Si, 12nM Cr, 120nM Au, SiO2 do izolacji	na		zamówienie
Szkiełko szklane powlekane tlenkiem indu i cyny, prostokątne, rezystancja 8-12 omów	Sigma-Aldrich	578274
Platynowy arkusz/folia (0,002 cala)	Surepure Chemetals	1897
Slim Line 2" Zaciski krokodylkowe	RadioShack	270-346
Multi-Stacking Banana	Patchcord TSElectronic	B-36-02 B-24-02
SYLGARD 184 silikon zestaw elastomerów	Dow Corning	Fischer
Fluorescecence	Olympus Corporation	MVX10 MacroView
cellSens Standard	Olympus Corporation	wersja 1.3
Tabela 1. Sprzęt do elektroosadzania i wizualizacji fluorescencji.
Chitozan, średniocząsteczkowy	Sigma-Aldrich	448877
Kwas solny, ARISTAR. ACS, NF, FCC Grade	VWR international	BDH3030
Wodorotlenek sodu, roztwór. 10.00N	VWR international	VW3247
Kwas alginowy, sól sodowa	Sigma-Aldrich	180947
Multifex-MM Wytrącony węglan wapnia, cząstki 70 nm	Speciality Minerals Inc.	100-3630-3
Tabela 2. Odczynniki w roztworze chitozanu i alginianu.
Chlorek wapnia, dwuwodny	J.T. Baker	0504
Chlorek sodu, certyfikowany ACS krystaliczny	Fischer Scientific	S271
Fosforan potasu jednozasadowy, bezwodny	Sigma-Aldrich	P9791
Fosforan potasu dwuzasadowy, bezwodny	Sigma-Aldrich	P3786
buforowana fosforanem	Sigma- Aldrich	P4417
Tabela 3. Inne składniki roztworu i odczynniki buforowe.
Oksydaza glukozowa z aspergillus niger	Sigma-Aldrich	G2133
Tyrozynaza z grzybów	Sigma-Aldrich	T3824
LB bulion, Miller (granulowany)	Fischer Scientific	BP9723-2
"AI2-Synthase" (HGLPT)	Lab stock 16
W3110 komórki typu dzikiego	Lab magazyn 30
MDAI2 + ogniwa pCT6-lsrR-ampr + pET-dsRed-kanr	Lab stock 30
FluoroSpheres: 1μ m średnica, Ex/Em: 505/515	Invitrogen	F8765
5-(and-6)-karboksyrodamina 6G ester sukcynimidylowy, Ex/Em: 525/560	Invitrogen	C-6157
DyLight, 405	Thermo Fisher Scientific, Inc.	PI-53020
Tabela 4. Enzymy, komórki i inne odczynniki funkcjonalizujące.