Artykuł metodologiczny

Łączenie interfejsu bioelektronicznego za pomocą biofabrykacji

20.3K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/4231

⸱

6 czerwca 2012

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Fischell Department of Bioengineering, University of Maryland , 2Institute for Bioscience and Biotechnology Research, University of Maryland , 3Department of Materials Science and Engineering, University of Maryland

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Niniejszy artykuł opisuje podejście w zakresie biofabrykacji: osadzanie polisacharydów reagujących na bodźce w obecności spolaryzowanych elektrod w celu stworzenia biokompatybilnych filmów, które mogą zostać funkcjonalizowane komórkami lub białkami. Przedstawiamy laboratoryjną strategię wytwarzania tych filmów, a także ich podstawowe zastosowania w tworzeniu interaktywnych, biofunkcjonalizowanych powierzchni dla aplikacji typu lab-on-a-chip.

Streszczenie

Postępy w technologii lab-on-a-chip obiecują zrewolucjonizować zarówno badania naukowe, jak i medycynę dzięki obniżeniu kosztów, lepszej czułości, przenośności oraz wyższej przepustowości. Włączanie komponentów biologicznych do biologicznych mikroelektromechanicznych systemów (bioMEMS) wykazuje ogromny potencjał w osiąganiu tych celów. Mikrotela elektroniczne umożliwiają tworzenie struktur w skali mikrometrycznej oraz zapewniają połączenie elektryczne niezbędne do detekcji i sterowania. Funkcjonalne komponenty biologiczne nadają systemowi zdolność do specyficznego wykrywania analitów, pełnienia funkcji enzymatycznych oraz wykorzystywania potencjału całych komórek. Standardowe procesy mikrotwórcze oraz techniki bioanalityczne są z sukcesem wykorzystywane od dziesięcioleci odpowiednio w przemyśle komputerowym i biologicznym. Ich połączenie i integracja w środowisku lab-on-a-chip niesie jednak ze sobą nowe wyzwania. Istnieje zapotrzebowanie na techniki umożliwiające tworzenie interfejsu między elektrodą a komponentem biologicznym, który byłby łagodny dla próbek, a także łatwy w wytwarzaniu i strukturyzacji.

Biofabrykacja, opisana w niniejszym materiale, jest jednym z podejść, które wykazują duży potencjał dzięki łatwości włączania komponentów biologicznych oraz wszechstronności funkcji realizowanych na chipie. Biofabrykacja wykorzystuje materiały i mechanizmy biologiczne (samorymontaż, montaż enzymatyczny) do hierarchicznego składania struktur w podejściu bottom-up. Choć w naszych laboratoriach koncepcje te zostały zademonstrowane w wielu formatach 1,2,3, tutaj przedstawiamy proces montażu oparty na elektrodepozycji, po której następują wielokrotne zastosowania oddziaływań opartych na sygnałach. Proces montażu polega na elektrodepozycji biokompatybilnych, responsywnych na bodźce filmów polimerowych na elektrodach, a następnie ich funkcjonalizacji komponentami biologicznymi, takimi jak DNA, enzymy lub żywe komórki 4,5. Elektrodepozycja wykorzystuje gradient pH powstający na powierzchni spolaryzowanej elektrody w wyniku elektrolizy wody 6,7. Chitozan i alginian to responsywne biologiczne polimery, które pod wpływem przyłożonych sygnałów elektrycznych mogą ulegać samorymontażowi w filmy hydrożelowe 8. Grubość tych hydrożeli jest określona przez zasięg gradientu pH rozciągającego się od elektrody. Można go modyfikować, zmieniając gęstość prądu oraz czas depozycji 6,7. Niniejszy protokół opisuje sposób depozycji i funkcjonalizacji filmów chitozanowych poprzez kowalencyjne przyłączanie komponentów biologicznych do licznych grup aminowych pierwszorzędowych obecnych na filmie, przy użyciu metod enzymatycznych lub elektrochemicznych 9,10. Omówione zostaną również filmy alginianowe oraz unieruchamianie w nich żywych komórek 11. Na koniec użyteczność biofabrykacji zostanie zademonstrowana na przykładach oddziaływań opartych na sygnałach, w tym transmisji sygnałów chemiczno-elektrycznych, komórka-komórka oraz enzym-komórka.

Zarówno elektrowydzielanie, jak i funkcjonalizacja mogą być przeprowadzane w warunkach zbliżonych do fizjologicznych bez konieczności stosowania odczynników, co pozwala chronić nietrwałe komponenty biologiczne przed drastycznymi warunkami. Ponadto zarówno chitozan, jak i alginian są od dawna wykorzystywane w celach istotnych biologicznie 12,13. W ogólnym ujęciu biofabrykacja, będąca szybką techniką, którą można łatwo przeprowadzić na blacie laboratoryjnym, może być wykorzystana do tworzenia wzorów funkcjonalnych komponentów biologicznych w skali mikronowej na elektrodach i może służyć w szerokim zakresie zastosowań typu lab-on-a-chip.

Protokół

1. Elektrodepozycja alginianu

  1. Podłączyć zasilacz do wykonanych na zamówienie elektrod za pomocą przewodów patch z klipsami krokodylkami. Szkło pokryte tlenkiem indu i cyny (ITO) będzie pełnić funkcję anody (elektrody roboczej), a folia platynowa funkcję katody (elektrody przeciwnej). Ustawić elektrody tak, aby powierzchnia ITO przeznaczona do funkcjonalizacji była skierowana w stronę elektrody przeciwnej i znajdowała się albo w pozycji pionowej, aby umożliwić zanurzenie w roztworze, albo w pozycji poziomej, tak aby roztwór do osadzania znajdował się na powierzchni.
  2. Przygotować roztwór do osadzania alginianu poprzez zmieszanie 1% alginianu i 0,5% CaCO3 (masowych) w wodzie destylowanej, a następnie poddać roztwór autoklawowaniu. Zaleca się ciągłe mieszanie roztworu w czasie, gdy nie jest on używany.
  3. Zanurzyć obie elektrody w roztworze do osadzania. Zgodnie z metodą Cheng et al. 14, użyty alginian może być znakowany fluorescencyjnie za pomocą FluoroSpheres (Invitrogen), aby umożliwić obrazowanie fluorescencyjne powstałej warstwy.
  4. Przyłożyć stałą gęstość prądu (3 A/m2) przez 2 minuty; napięcie będzie zmieniać się w zakresie 2-3 V.
  5. Odłączyć elektrodę i usunąć nieosadzony roztwór. Delikatnie wypłukać warstwę roztworem NaCl (0,145 M), aby usunąć nadmiar alginianu.
  6. Inkubować warstwę przez krótki czas (~1 min) w CaCl2 (0,1 M), aby wzmocnić żel. Wypłukać roztworem NaCl (0,145 M) i inkubować w wybranym roztworze uzupełnionym o CaCl2 (1 mM).
  7. Wykonać obrazowanie przy użyciu mikroskopu fluorescencyjnego (Rysunek 1B).

2. Współosadzanie komunikujących się populacji komórek w alginianie

  1. Kulturę komórek nadających sygnał (W3110 wt E. coli), hodowaną w pożywce LB, oraz kulturę komórek odbierających sygnał (MDAI2 + pCT6-lsrR-ampr + pET-dsRed-kanr), hodowaną w pożywce LB + 50 μg/mL kanamycyny i ampicyliny, należy hodować przez noc, a następnie ponowić inokulację do uzyskania gęstości optycznej (przy 600 nm) równej 1. Przed użyciem dostosować gęstość optyczną kultury komórek odbierających do poziomu 0,4-0,6 za pomocą pożywki LB.
  2. Przygotować roztwór do osadzania zawierający 2% alginianu i 1% CaCO3, a następnie zmieszać go z każdą z kultur komórek w stosunku 1:1 do końcowego stężenia 1% alginianu i 0,5% CaCO3, tak aby komórki zostały rozcieńczone do gęstości wynoszącej około połowę gęstości hodowli.
  3. Użyć szkiełka przedmiotowego z naniesionymi dwiema elektrodami ITO, ograniczonymi studzienką z polidimetylosiloksanu (PDMS) (przygotowaną zgodnie z instrukcją Sylgard i dociętą do pożądanego rozmiaru) oraz platynową elektrodą przeciw sweaty.
  4. Zanurzyć elektrody w roztworze do osadzania zawierającym komórki odbierające. Ustawić zasilacz na stały prąd o gęstości 3 A/m2, gdzie wymiar powierzchni jest definiowany przez pojedynczą elektrodę, na której nastąpi osadzanie.
  5. Przyłożyć prąd przez 2 minuty, aby umożliwić wspólne osadzanie komórek w matrycy alginianowej.
  6. Przepłukać film zgodnie z opisem w kroku 1.5.
  7. Przełączyć połączenie anodowe na drugą, sąsiednią elektrodę ITO.
  8. Powtórzyć procedurę osadzania (kroki 2.4 - 2.7), wprowadzając tym razem roztwór zawierający komórki nadające sygnał.
  9. Inkubować przez noc w 37 °C chip z dwiema elektrodami zawierający wspólnie osadzone komórki i alginian wapnia w soli fizjologicznej z buforem fosforanowym (PBS) uzupełnionej o 10% pożywki LB i 1 mM CaCl2.
  10. Po inkubacji wykonać obrazowanie za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego (Ryc. 2B).

3. Elektrodepozycja chitosanu

  1. Podłącz zasilacz do elektrod za pomocą krokodylków. Pozłacany chip krzemowy będzie pełnił rolę katody (elektrody roboczej), a folia platynowa posłuży jako anoda (elektroda przeciwna). Ustaw powierzchnię elektrody złotej naprzeciwko elektrody przeciwnej; obie powinny być ustawione albo pionowo w celu zanurzenia w roztworze, albo poziomo w taki sposób, aby roztwór do osadzania znajdował się na powierzchni.
  2. Przygotuj roztwór chitosanu, mieszając płatki chitosanu z wodą i powoli dodając 2 M HCl w celu rozpuszczenia polisacharydów (końcowe pH 5,6), postępując zgodnie z procedurą opisaną przez Meyer et al. 15.
  3. Umieść elektrody w roztworze chitosanu (0,8 %), całkowicie zanurzając obszar przeznaczony do osadzania. Użyty chitosan może być znakowany fluorescencyjnie za pomocą 5-(oraz-6)-karboksyrodaminy 6G estru succinimidylowego (Invitrogen), zgodnie z metodą Wu et al. 8, w celu obrazowania elektroosadzonej warstwy za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej.
  4. Zastosuj stałą gęstość prądu (4 A/m2) przez 2 minuty. Napięcie będzie zmieniać się w zakresie 2-3 V. Oblicz gęstość prądu jako funkcję powierzchni złota elektrody roboczej wystawionej na działanie roztworu do osadzania.
  5. Opłucz elektrodę wodą destylowaną (DI), aby usunąć nadmiar chitosanu. Chip można przechowywać w wodzie lub PBS (10 mM, pH 7,0).
  6. Wykonaj obrazowanie za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego (Rycyna 3C).

4. Transdukcja elektrochemiczna z wykorzystaniem funkcjonalizowanej błony chitozanowej

  1. Współosadź chitosan i oksydazę glukozową (GOx) z roztworu (1% chitosan, 680 U/mL GOx, pH 5,6) przy gęstości prądu 4 A/m2 na wzorowanej elektrodzie zgodnie z Procedurą 3 (Elektrootkładanie chitosanu). W wyniku tego procesu powstanie film chitosanu z uwięzionym GOx.
  2. Podłącz potraktowaną elektrodę do układu trójelektrodowego jako elektrodę roboczą, stosując drucik platynowy jako elektrodę pomocniczą oraz Ag/AgCl jako elektrodę odniesienia, zgodnie z opisem na Rysunku 4A.
  3. Zanurz elektrody w roztworze buforu fosforanowego (0,1 M, pH 7,0) zawierającym NaCl (0,1 M).
  4. Przeprowadź elektrochemiczną konjugację białka z filmem chitosanu poprzez przyłożenie stałego napięcia (0,9 V) przez 60 s przy użyciu chronoamperometrii10.
  5. Umieść chip w buforze fosforanowym (0,1 M, pH 7,0) i myj przez 10 minut na wytrząsarce orbitalnej, aby usunąć nieprzereagowany NaCl oraz nieskonjugowany GOx.
  6. Ponownie podłącz do układu trójelektrodowego zgodnie z opisem w kroku 4.2 i zanurz w roztworze 5 mM glukozy. Wykorzystując woltamperometrię cykliczną, wykonaj przesunięcie potencjału w kierunku dodatnim do 0,7 V. Użyj filmu kontrolnego, który nie zawiera oksydazy glukozowej, jako punktu odniesienia dla ilości utleniania zaobserwowanej podczas przesunięcia (Rysunek 4B).
  7. Wyjmij elektrody z roztworu glukozy i wypłucz buforem fosforanowym (0,1 M, pH 7,0), a następnie umieść elektrody w zlewce o pojemności 10 mL zawierającej 8 mL buforu fosforanowego (0,1 M, pH 7,0). Przyłóż do funkcjonalizowanego GOx chipa napięcie 0,6 V, aby służył on jako elektroda robocza (Rysunek 4C).
  8. Dodawaj do buforu alikwoty glukozy (każda alikwota zwiększa stężenie glukozy o 4 mM).
  9. Wyznacz krzywą wzorcową zależności między prądem stanu stacjonarnego a stężeniem glukozy dla funkcjonalizowanego GOx filmu chitosanu.

5. Funkcjonalizacja białek z wykorzystaniem montażu enzymatycznego

  1. Użyć szkiełka przedmiotowego z naniesionymi obok siebie elektrodami z złota i ITO, znajdujących się w studzience z PDMS. Przyłożyć do elektrody złotej potencjał katodowy, aby przeprowadzić elektroosadzanie chitozanu, zgodnie z wcześniejszym opisem. Krótko wypłukać film w wodzie DI, a następnie w PBS za pomocą pipety.
  2. Dodać roztwór 3 μM niebiesko fluorescencyjnie znakowanej „AI-2 Synthase” 16 (z użyciem zestawu znakującego DyLight) + 100 U/mL tyrozynazy w PBS.
  3. Inkubować przez 1 h w temperaturze pokojowej, a następnie wypłukać film w PBS.
  4. Przyłożyć potencjał anodowy do elektrody ITO, aby współosadzić roztwór alginianu zawierający komórki odbiorcze (przygotowany w krokach 2.1-2.2). Postępować zgodnie z krokami 2.3-2.6 Procedury 2 (Współosadzanie populacji komórek w alginianie).
  5. Aby enzymatycznie wygenerować sygnał transmitowany (AI-2), po wypłukaniu filmów dodać roztwór 500 μM S-adenozylohomocysteiny (SAH) w PBS, uzupełniony o 10% pożywkę LB i 1mM CaCl2. Przykryć elektrody, aby zapobiec odparowaniu roztworu, i inkubować przez noc w 37 °C. Pozwoli to na uzyskanie odpowiedzi komórek odbiorczych poprzez generowanie czerwonego białka fluorescencyjnego (dsRed).
  6. Sąsiednie elektrody można obrazować za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej, dostosowując filtry tak, aby uchwycić niebieską fluorescencję AI-2 Synthase oraz czerwoną fluorescencję ekspresjonowaną przez współosadzone komórki odbiorcze (Rysunek 5B).

6. Reprezentatywne wyniki

Przyłożone sygnały elektryczne mogą tworzyć lokalne mikrośrodowiska (np. pola i gradienty) w pobliżu powierzchni elektrody, a bodźce te mogą inicjować samoorganizację polisacharydów, takich jak alginian i chitosan, prowadząc do ich osadzenia w formie filmu hydrożelowego na powierzchni elektrody. Ponieważ to przejście sol-żel zachodzi na powierzchni elektrody, powstały film jest adresowany elektrycznie, a jego geometria odpowiada wzorowi elektrody (Rysunki 1B, 3C). Biokompatybilne filmy, takie jak alginian i chitosan, zapewniają powierzchnie, które mogą być funkcjonalizowane komponentami biologicznymi. Z wykorzystaniem alginianu możliwe było współosadzanie unikalnych populacji komórek w oddzielnych adresach. Dowód ich adresowania elektrycznego obserwuje się podczas interakcji między populacją komórek nadawczych a odbiorczych. Cząsteczka autoinduktora-2 (AI-2) dyfunduje z komórek nadawczych i jest pobierana przez komórki odbiorcze, co skutkuje ekspresją czerwonego białka fluorescencyjnego dsRed (Rysunek 2A). Na Rysunku 2B czerwona fluorescencja jest obserwowana tylko przy elektrodzie, w której zaadresowano komórki odbiorcze.

Grupy aminowe obecne w chitosanie zapewniają mu responsywność na pH wymaganą do elektroosadzania, a także powierzchnię odpowiednią do funkcjonalizacji. Wykorzystaliśmy te wyjątkowe właściwości, sprzęgając elektrochemicznie enzym biosensywny — oksydazę glukozową (GOx) — z elektroosadzonymi filmami chitosanowymi. Enzym ten umożliwia detekcję glukozy poprzez reakcję enzymatyczną (Rysunek 4A), w wyniku której powstaje nadtlenek wodoru, który następnie może zostać utleniony elektrochemicznie, generując prąd wyjściowy. W ten sposób sygnał chemiczny może zostać przekształcony w sygnał elektryczny. Rysunek 4B pokazuje, że filmy, w których GOx została sprzężona elektrochemicznie, generują silny sygnał anodowy w obecności glukozy, w przeciwieństwie do filmów niezawierających GOx. Wyniki te wskazują, że GOx może zostać osadzona na filmie chitosanowym i zachowuje aktywność katalityczną. Ponadto Rysunek 4C przedstawia skokowy wzrost prądu anodowego w odpowiedzi na zwiększające się stężenia glukozy. Krzywa wzorcowa, również przedstawiona na Rysunku 4C, wykazuje, że skokowe wzrosty przebiegały w sposób niemal liniowy, zależnie od ilości dodanej glukozy. Wyniki te dowodzą, że enzym zachowuje również swoją czułość na zwiększające się stężenia glukozy po sprzężeniu z filmem chitosanowym. Dolna granica detekcji nie była w tym przypadku badana, ponieważ została wcześniej opisana dla tego układu w pracy Meyera et. al.

Wykazaliśmy również kowalencyjną immobilizację enzymu, zmodyfikowanego tak, aby zawierał specjalny znacznik penta-tyrozynowy, do chitozanu w sposób kontrolowany enzymatycznie. Konkretnie, proces ten jest katalizowany przez tyrozynazę. Jak przedstawiono na schemacie na Rysunku 5A(góra), enzym AI-2 Synthase zawiera znacznik penta-tyrozynowy. Tyrozynaza oddziałuje na znacznik tyrozynowy, utleniając grupy fenolowe reszt do O-chinonów, które następnie wiążą się kowalencyjnie z aminami chitozanu. Dowód na funkcjonalizację filmu chitozanowego za pomocą AI-2 Synthase poprzez montaż tyrozynazowy widoczny jest na Rysunku 5B, gdzie AI-2 Synthase została oznakowana fluorescencyjnie na niebiesko. Ponieważ AI-2 Synthase generuje AI-2 z substratu S-adenozylohomocysteiny (SAH) w taki sam sposób jak komórki nadawcze, jej bliskość do współosadzonych komórek odbiorczych w obecności SAH powoduje również fluorescencyjną odpowiedź komórek odbiorczych poprzez ekspresję dsRed (Rysunek 5A(dół)). Czerwona fluorescencja komórek odbiorczych (Rysunek 5B) ponownie demonstruje interakcję między adresatami dzięki dyfuzji AI-2 z jednego do drugiego i dodatkowo wskazuje, że enzymy immobilizowane na chitozanie zachowują aktywność po związaniu kowalencyjnym.

Tworzenie żelu alginianowego z węglanu wapnia; równanie reakcji; schemat eksperymentalny; dyfuzja jonów.
Rysunek 1. Elektrodepozycja alginianu. (A) Mechanizm elektrodepozycji alginianu: Podczas polaryzacji anodowej elektrody na jej powierzchni zachodzi elektroliza wody, co prowadzi do lokalnego obniżenia pH. Cząsteczki węglanu wapnia reagują z nadmiarem protonów, uwalniając kationy wapnia w miarę rozpuszczania się cząsteczek. W obecności łańcuchów polimerowych alginianu jony te ulegają chelatacji w sieci typu „eggbox”, tworząc sieciowany hydrożel na elektrodzie. Wraz ze wzrostem odległości od elektrody alginian wykazuje większą tendencję do pozostawania w roztworze ze względu na mniejszą obecność jonów wapnia. (B) Do elektrodepozycji alginianu wykorzystano elektrodę ITO o kształcie litery L. Do elektrody przymocowano studzienkę z PDMS, aby pomieścić roztwór do depozycji zawierający alginian znakowany zieloną fluorescencją (1%) oraz CaCO3 (0,5%). Po przeprowadzeniu elektrodepozycji przez 2 min przy gęstości prądu 3A/m2, obraz hydrożelu alginianowego uformowanego elektrochemicznie uzyskano za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej.

Schemat komunikacji AI-2 E. coli na elektrodach ITO i wynik mikroskopii fluorescencyjnej.
Rycina 2. Współosadzanie populacji komórek. (A) Schemat przedstawiający interakcję między dwoma szczepami E. coli: jedna populacja produkuje autoinduktor-2 (AI-2), cząsteczkę sygnałową, i jest określana jako „nadawca AI-2”. Druga populacja, określana jako „odbiorca AI-2”, jest reporterem AI-2; po odebraniu AI-2 drogą dyfuzji od nadawcy, wykazuje ekspresję czerwonego białka fluorescencyjnego dsRed. (b) Obraz czerwonej fluorescencji pary elektrod z populacją nadawcy AI-2 współosadzoną z alginianem na lewej elektrodzie oraz populacją odbiorcy AI-2 współosadzoną z alginianem na prawej elektrodzie. Powiększony widok pokazuje ekspresję dsRed wyłącznie w przypadku odbiorców AI-2.

Schemat procesu elektrodepozycji chitosanu z gradientem pH i układem analizy fluorescencyjnej.
Rysunek 3. Elektrodepozycja chitosanu. (A) Schemat przedstawiający zależną od pH elektrodepozycję chitosanu. Elektroliza wody na elektrodzie z potencjałem katodowym powoduje lokalny wzrost pH (widoczny jako lokalna zmiana barwy wskaźnika pH w pobliżu katody na mikrofotografii), co stymuluje przejście sol-żel chitosanu w tym obszarze. (B) Grupy aminowe obecne w chitosanie nadają mu właściwości reaktywne na pH. Powyżej pH 6,3 (pKa chitosanu) aminy ulegają deprotonowaniu, co ułatwia przejście z protonowanej formy rozpuszczalnej do nierozpuszczalnej formy żelu. (C) Do elektrodepozycji chitosanu wykorzystano wzorcowaną elektrodę złotą. Elektrodę, podłączoną katodowo do zasilacza, zanurzono w roztworze do depozycji chitosanu (0,8%) znakowanego zieloną fluorescencją. Po elektrodepozycji trwającej 2 min przy gęstości prądu 4 A/m2, obraz filmu chitosanowego naniesionego elektrochemicznie wykonano za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej.

Enzymatyczne elektrochemiczne wykrywanie glukozy; schemat, układ potencjostatu, równania reakcji.
Rycina 4. Transdukcja elektrochemiczna z funkcjonalizowaną błoną chitozanową. (A) Schemat przedstawiający układ systemu trzech elektrod. Funkcjonalizowana błona chitozanowa służy jako elektroda robocza, drut platynowy jako elektroda pomocnicza, a Ag/AgCl jako elektroda odniesienia. Transdukcja elektrochemiczna glukozy przebiega poprzez przedstawione reakcje enzymatyczne i elektrochemiczne, w których powstały nadtlenek wodoru może zostać utleniony i wykryty na elektrodzie roboczej. (B) Woltammogram cykliczny (CV) na elektrodzie z błoną chitozanową zawierającą elektrochemicznie sprzężoną oksydazę glukozową (GOx) wykazuje silny sygnał anodowy w 5 mM roztworze glukozy. Błona niezawierająca GOx służyła jako kontrola i nie wykazała sygnału w tym samym roztworze. (C) Krzywa wzorcowa zależności prądu anodowego od stężenia glukozy wykazuje niemal liniową relację (każda alikwota zwiększała stężenie glukozy o 4 mM i zwiększała amplitudę prądu na wykresie wstawkowym w sposób skokowy).

Montaż enzymatyczny, schemat syntazy AI-2, wiązanie kowalencyjne, sygnalizacja enzym-komórka, mikroskopia.
Rycina 5. Funkcjonalizacja białek za pomocą montażu enzymatycznego. (A, góra) Schemat przedstawiający kowalencyjne przytwierdzanie „syntazy AI-2” z etykietą tyrozynową do błony chitozanowej za pomocą montażu tyrozynazowego. Pozostałości tyrozyny ulegają utlenieniu do O-chinonów w wyniku działania tyrozynazy i mogą reagować z grupami aminowymi na błonie chitozanowej, tworząc wiązanie kowalencyjne. (A, dół) Syntaza AI-2 generuje AI-2 z substratu (SAH); komórki odbiorcze raportują wygenerowany AI-2 poprzez ekspresję fluorescencji dsRed. (B) Obrazy fluorescencyjne przedstawiające błonę chitozanową na złocie, funkcjonalizowaną niebiesko znakowaną syntazą AI-2. Obok, komórki odbiorcze AI-2 są współosadzone z alginianem na ITO. Po dodaniu substratu enzymatycznego do studzienki i inkubacji, komórki odbiorcze AI-2 wykazują ekspresję dsRed.

Dyskusja

Nasze procedury demonstrują elektrodepozycję i funkcjonalizację filmów biopolimerowych, proces ten nazywamy biofabrykacją. Poprzez funkcjonalizację komórkami i biomolekułami tworzymy powierzchnie biologiczne zdolne do oddziaływania ze sobą oraz z adresem elektrody, na której zostały zmontowane. Pierwszy etap, elektrodepozycja, zachodzi poprzez wywołany samomontaż biopolimerów (w naszych badaniach alginianu i chitosanu) w odpowiedzi na sygnał elektryczny. Jak wspomniano wcześniej, generowany jest gradient pH, który można kontrolować za pomocą gęstości prądu i czasu depozycji, co zapewnia dodatkową kontrolę nad wymiarami i właściwościami filmu 6,17. Stwierdziliśmy, że dla elektrod wskazanych w Tabeli 1 można zastosować różne kombinacje gęstości prądu i czasu depozycji. Chociaż użycie innych elektrod jest możliwe, konieczne byłoby wprowadzenie korekt do procedury. W porównaniu z innymi technikami tworzenia filmów, proces elektrodepozycji jest prosty, szybki i nie wymaga odczynników. Nie ma potrzeby posiadania rozbudowanego zestawu drogiego sprzętu ani przeprowadzania żmudnych przygotowań. Co ważne, proces ten jest odporny na niewielkie odchylenia eksperymentalne i w przypadku wystąpienia problemu można go łatwo rozpocząć od nowa.

Chitozan jest zdolny do reagowania na wysoki katodowy gradient pH dzięki istotnym właściwościom funkcjonalnym, które nadaje mu wysoka zawartość amin pierwszorzędowych. Przy wysokim pH (powyżej jego pKa wynoszącego ~6,3) aminy ulegają depresprotonowaniu, a chitozan staje się nierozpuszczalny, co umożliwia tworzenie filmu. Po osadzeniu filmy pozostaną przytwierdzone do elektrody. Istnieje jednak możliwość ich odwarstwienia, jeśli jest to pożądane. Filmy pozostaną stabilne tak długo, jak pH roztworu nie spadnie poniżej pKa. Roztwory kwasowe protonują aminy, a następujące po tym odpychanie elektrostatyczne powoduje pęcznienie żelu aż do jego rozpuszczenia 18. Oznacza to, że proces montażu/demontażu jest odwracalny na żądanie i pozwala na usuwanie osadzonych filmów oraz ponowne wykorzystanie elektrod. Co wygodne, zakres pH, w którym zachodzi przejście sol-żel, jest bliski zakresowi, w którym większość komponentów biologicznych funkcjonuje optymalnie. Sprawia to, że proces ten jest idealny dla zachowania funkcjonalności podczas montażu6.

Tworzenie filmu alginianowego jest wspomagane przez anodową elektrolizę wody oraz obecność węglanu wapnia 7. Lokalne niskie pH przy anodzie rozpuszcza węglan wapnia, co prowadzi do uwalniania kationów wapnia. Jony te są chelatowane przez alginian, tworząc sieciową strukturę na powierzchni elektrody. Filmy alginianowe są wyraźnie odwracalne dzięki konkurencji o jony wapnia ze strony innych związków chelatujących, takich jak cytrynian lub EDTA, które mogą być użyte do rozpuszczenia filmów, co umożliwia ponowne wykorzystanie znajdujących się pod nimi elektrod. W związku z tym filmy alginianowe są stosunkowo nietrwałe w warunkach fizjologicznych, ponieważ jony wapnia są łatwo usuwane z macierzy żelu, co osłabia jego strukturę i sprzyja delaminacji lub ponownemu rozpuszczaniu filmu. Aby przezwyciężyć to ograniczenie, wprowadziliśmy etap inkubacji filmu w 1 M CaCl2 w celu wzmocnienia żelu. Ponadto zalecamy, aby roztwór inkubacyjny filmu (pożywka komórkowa itp.) był suplementowany CaCl2 w stężeniu 500 μM-3 mM.

Drugą główną procedurą jest funkcjonalizacja naniesionego filmu odpowiednimi komponentami biologicznymi. Można to osiągnąć na dwa sposoby, z czego pierwszym jest konjugacja elektrochemiczna – strategia umożliwiająca szybki, bezodczynnikowy montaż białek z wyjątkową kontrolą przestrzenną 10. Jednak funkcjonalizacja w ten sposób jest ograniczona przez dyfuzję jonów Cl- przez film do elektrody, a także dyfuzję HOCl, generowanego reaktywnego produktu pośredniego, z powrotem do roztworu. Zdolność cząsteczek elektrochemicznie aktywnych do przenikania przez film umożliwia transdukcję sygnałów chemicznych i biologicznych na łatwe do odczytania sygnały elektryczne 15. Wykazaliśmy, że sprzęganie za pośrednictwem tyrozynazy stanowi drugą strategię funkcjonalizacji enzymatycznej chitosanu, co zademonstrowano poprzez kowalencyjne przyłączenie syntazy AI-2. Strategia ta pozwala na kontrolowany i selektywny proces funkcjonalizacji – zależny od konkretnego odczynnika, tyrozynazy, która działa specyficznie na białka zawierające znacznik tyrozynowy 9.

Wykazujemy użyteczność i biokompatybilność systemów wieloadresowych poprzez replikację naturalnych szlaków na chipie. W pierwszej kolejności zorganizowaliśmy dwie populacje komórek (tj. „nadawców” i „odbiorców”) pod odrębnymi adresami i wykazaliśmy, że oddziaływały one za pośrednictwem sąsiednich elektrod, aby dostarczyć AI-2 i wywołać odpowiedź fluorescencyjną. Koncepcja ta została zaprezentowana również przez Cheng et al. w chipie mikrofluidycznym 14. Odtworzyliśmy to oddziaływanie, lecz zamiast tego wykorzystaliśmy enzym do syntezy dostarczanego AI-2. W ten sposób, dzięki biofabrykacji, zreplikowano syntetyczny wewnątrzkomórkowy szlak syntezy AI-2, który funkcjonował w sposób zbliżony do jego działania w roztworze.

W obu przypadkach montaż wielu adresów wiąże się z wyzwaniem uniknięcia nieswoistego wiązania między adresami, ponieważ każdy roztwór do osadzania musi zostać wprowadzony do całego układu elektrod, mimo że elektrodepozycja jest zamierzona tylko w jednym adresie. Delikatne, lecz dokładne płukanie pozwala usunąć większość pozostałego roztworu z elektrod niepodlegających polaryzacji; zastosowanie przepływu w kanałach mikrofluidycznych może dodatkowo zminimalizować nieswoistość. Szczególnie w przypadku sąsiedniej biofabrykacji adresów z chitozanu i alginianu zalecamy najpierw osadzanie filmu chitozanowego, następnie przeprowadzenie etapów biofunkcjonalizacji, a po tym elektrodepozycję alginianu. Chociaż nie zrobiliśmy tego w niniejszej procedurze, stwierdziliśmy, że blokowanie filmu chitozanowego białkami obojętnymi (takimi jak mleko, BSA itp.) znacznie zmniejsza nieswoiste wiązanie niepożądanych cząsteczek z amionowaną powierzchnią chitozanu.

Stwierdziliśmy, że tworzenie elektrod wzorowanych, często spotykanych w urządzeniach bioMEMS, jest użyteczne jako „szablony” dla złożonych układów komórek i biomolekuł. Zastosowania elektroosadzonego chitosanu w urządzeniach bioMEMS mogą wykraczać daleko poza przytoczone tutaj przykłady 19. Chitosan może być osadzany na różnych geometriach w skali mikro – na przykład w mikrokanałach i na powierzchniach niepłaskich 20,15. Filmy te mogą być również modyfikowane innymi polimerami oraz różnymi białkami, DNA, nanocząsteczkami i cząsteczkami aktywnymi redoks w celu uzyskania nowych właściwości 21,22,23. W urządzeniach bioMEMS filmy chitosanowe były wykorzystywane do dostarczania leków, detekcji potencjałów redoks i małych cząsteczek, biokatalizy oraz badań nad komórkami 20,23,24,25. Podobnie alginian jest szeroko stosowany jako matryca do unieruchamiania komórek i był badany pod kątem odwracalnego ograniczania przepływu populacji komórek oraz immunoanalizy wewnątrzfilmu 26,27,28. Za pomocą elektroosadzania alginianu wytworzono filmy kompozytowe do zastosowań w inżynierii tkankowej, zawierające komponenty takie jak hydroksyapatyt, przeznaczone do implantów ortopedycznych 29.

W naszych demonstracjach biofabrykacji wykazaliśmy, że interakcje pomiędzy komponentami biologicznymi oraz na interfejsie bioelektronicznym są równie istotne; otwiera to perspektywę integracji wszystkich rodzajów oddziaływań w celu uzyskania zaawansowanej wydajności przesyłu sygnałów na chipie. W związku z tym biofabrykacja może ułatwić wytwarzanie urządzeń o zredukowanych „minimalnych rozmiarach elementów” jako bezpośrednia kontynuacja szybkiego rozwoju mikrofabrykacji, często napędzanego przez elektronikę użytkową. Oznacza to, że urządzenia następnej generacji mogą w rzeczywistości zawierać labilne komponenty biologiczne, oferujące naturalne, niezwykle precyzyjne możliwości montażu i rozpoznawania w skalach długości jeszcze mniejszych niż w systemach stworzonych przez człowieka. Przewidujemy zastosowania w najbliższej przyszłości w instrumentacji analitycznej, czujnikach środowiskowych, a nawet w biokompatybilnych urządzeniach implantowalnych.

Oświadczenia

Produkcja i wolny dostęp do tego artykułu są sponsorowane przez Agencję Redukcji Zagrożeń Obronnych Stanów Zjednoczonych (Defense Threat Reduction Agency).

Podziękowania

Potwierdzamy otrzymanie funduszy z DTRA na wsparcie przygotowania niniejszego manuskryptu oraz z ONR, DTRA i NSF na częściowe wsparcie prowadzonych badań.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
ZasilaczKeithleySourceMeter 2400
Potencjostat tróbelektrodowyCH InstrumentsPotencjostat/Galwanostat 600D
Elektroda odniesienia RE-5B Ag/AgCl z elastycznym złączem BASiMF-2052
Wafel krzemowy powlekany złotem, Si 500 µm, Cr 12 nm, Au 120 nm, SiO2 do izolacjiwykonany na zamówienie
Szkiełko przedmiotowe powlekane tlenkiem indu i cyny, prostokątne, rezystancja 8-12 ΩSigma-Aldrich578274
Blaszka/folia platynowa (0,002 cala)Surepure Chemetals1897
Slim Line 2" Krokodylki (zaciski typu krokodyl) RadioShack270-346
Przewód połączeniowy z wielostopniowymi wtykami bananowymiTSElectronicB-36-02 B-24-02
zestaw elastomeru silikonowego SYLGARD 184Dow CorningNC9020938 od Fischera
Stereomikroskop fluorescencyjnyOlympus CorporationMVX10 MacroView
cellSens Standard Olympus Corporationwersja 1.3
Tabela 1. Sprzęt do elektrodepozycji i wizualizacji fluorescencyjnej.
Chitozan, średnia masa cząsteczkowaSigma-Aldrich448877
Kwas solny, ARISTAR, stopień czystości ACS, NF, FCC VWR internationalBDH3030
Wodorotlenek sodu, roztwór, 10,00 NVWR internationalVW3247
Kwas alginowy, sól sodowaSigma-Aldrich180947
Węglan wapnia wytrącony Multifex-MM, cząstki 70 nmSpeciality Minerals Inc.100-3630-3
Tabela 2. Odczynniki do roztworu chitosanu i alginianu.
Chlorek wapnia, dwuwodnianyJ.T. Baker0504
Chlorek sodu, krystaliczny, certyfikowany ACSFischer ScientificS271
Wodorofosforan potasu, bezwodnySigma-AldrichP9791
fosforan dwuwodorkowy potasu, bezwodnySigma-AldrichP3786
bufor fosforanowy (PBS)Sigma-AldrichP4417
Tabela 3. Pozostałe składniki roztworu i odczynniki buforowe.
Oksydaza glukozowa z *Aspergillus niger*Sigma-AldrichG2133
Tyrozynaza z grzybaSigma-AldrichT3824
pożywka LB, Miller (granulowana)Fischer ScientificBP9723-2
"AI2-syntaza" (HGLPT)Zasoby laboratoryjne 16
komórki typu dzikiego W3110Zasoby laboratoryjne 30
MDAI2 + pCT6-lsrR-ampr + pET-dsRed-kanProszę o podanie tekstu źródłowego do przetłumaczenia. komórki Zasoby laboratoryjne 30
FluoroSpheres: 1μśrednica m, Ex/Em: 505/515InvitrogenF8765
ester succinimidylowy 5-(i-6)-karboksyrodaminy 6G, Ex/Em: 525/560InvitrogenC-6157
zestaw do znakowania przeciwciał DyLight, 405Thermo Fisher Scientific, Inc.PI-53020
Tabela 4. Enzymy, komórki i inne odczynniki do funkcjonalizacji.

Bibliografia

  1. Luo, X. In situ generation of pH gradients in microfluidic devices for biofabrication of freestanding, semi-permeable chitosan membranes. Lab Chip. 10, 59-65 (2010).
  2. Javvaji, V., Baradwaj, A. G., Payne, G. F., Raghavan, S. R. Light-Activated Ionic Gelation of Common Biopolymers. Langmuir. 27, 12591-12596 (2011).
  3. Dowling, M. B., Javvaji, V., Payne, G. F., Raghavan, S. R. Vesicle capture on patterned surfaces coated with amphiphilic biopolymers. Soft Matter. 7, 1219-1226 (2011).
  4. Liu, Y. Biofabrication to build the biology-device interface. Biofabrication. 2, 022002-022002 (2010).
  5. Yang, X., Shi, X. -W., Liu, Y., Bentley, W. E., Payne, G. F. Orthogonal Enzymatic Reactions for the Assembly of Proteins at Electrode Addresses. Langmuir. 25, 338-344 (2008).
  6. Cheng, Y. In situ quantitative visualization and characterization of chitosan electrodeposition with paired sidewall electrodes. Soft Matter. 6, 3177-3183 (2010).
  7. Cheng, Y. Mechanism of anodic electrodeposition of calcium alginate. Soft Matter. 7, 5677-5684 (2011).
  8. Wu, L. -Q. Spatially Selective Deposition of a Reactive Polysaccharide Layer onto a Patterned Template. Langmuir. 19, 519-524 (2003).
  9. Wu, H. C. Biofabrication of antibodies and antigens via IgG-binding domain engineered with activatable pentatyrosine pro-tag. Biotechnol. bioeng. , 103-231 (2009).
  10. Shi, X. -W. Reagentless Protein Assembly Triggered by Localized Electrical Signals. Adv. Mater. 21, 984-988 (2009).
  11. Shi, X. -W. Electroaddressing of Cell Populations by Co-Deposition with Calcium Alginate Hydrogels. Adv. Funct. Mater. 19, 2074-2080 (2009).
  12. de Vos, P., Faas, M. M., Strand, B., Calafiore, R. Alginate based microcapsules for immunoisolation of islet cells. Biomaterials. 27, 5603-5617 (2006).
  13. Jayakumar, R., Prabaharan, M., Sudheesh Kumar, P. T., Nair, S. V., Tamura, H. Novel chitin and chitosan nanofibers and their biomedical applications. Biotechnol. Adv. 29, 322-337 (2011).
  14. Cheng, Y. Electroaddressing Functionalized Polysaccharides as Model Biofilms for Interrogating Cell Signaling. Adv. Funct. Mater. 22, 519-528 (2012).
  15. Meyer, W. L. Chitosan-coated wires: conferring electrical properties to chitosan fibers. Biomacromolecules. 10, 858-864 (2009).
  16. Fernandes, R., Roy, V., Wu, H. -C., Bentley, W. E. Engineered biological nanofactories trigger quorum sensing response in targeted bacteria. Nat. Nanotechnol. 5, 213-217 (2010).
  17. Yi, H. Biofabrication with chitosan. Biomacromolecules. 6, 2881-2894 (2005).
  18. Liba Benjamin, D., Aranha India, V., Kim, E., Payne Gregory, F. ACS Symposium Series Ch. 4. Renewable and Sustainable Polymers. 1063, American Chemical Society. 61-71 (2011).
  19. Koev, S. T. Chitosan: an integrative biomaterial for lab-on-a-chip devices. Lab Chip. 10, 3026-3042 (2010).
  20. Luo, X. Programmable assembly of a metabolic pathway enzyme in a pre-packaged reusable bioMEMS device. Lab Chip. 8, 420-430 (2008).
  21. Spinks, G. M. A novel "dual mode" actuation in chitosan/polyaniline/carbon nanotube fibers. Sensor Actuat B-Chem. 121, 616-621 (2007).
  22. Yi, H. Patterned assembly of genetically modified viral nanotemplates via nucleic acid hybridization. Nano letters. 5, 1931-1936 (2005).
  23. Kim, E. Redox-cycling and H2O2 generation by fabricated catecholic films in the absence of enzymes. Biomacromolecules. 12, 880-888 (2011).
  24. Xie, Y., Xu, B., Gao, Y. Controlled transdermal delivery of model drug compounds by MEMS microneedle array. Nanomedicine. 1, 184-190 (2005).
  25. Odaci, D., Timur, S., Telefoncu, A. A microbial biosensor based on bacterial cells immobilized on chitosan matrix. Bioelectrochemistry. 75, 77-82 (2009).
  26. Selimoglu, S. M., Elibol, M. Alginate as an immobilization material for MAb production via encapsulated hybridoma cells. Crit Rev Biotechnol. 30, 145-159 (2010).
  27. Braschler, T., Johann, R., Heule, M., Metref, L., Renaud, P. Gentle cell trapping and release on a microfluidic chip by in situ alginate hydrogel formation. Lab Chip. 5, 553-559 (2005).
  28. Yang, X. In-Film Bioprocessing and Immunoanalysis with Electroaddressable Stimuli-Responsive Polysaccharides. Adv. Funct. Mater. 20, 1645-1652 (2010).
  29. Cheong, M., Zhitomirsky, I. Electrodeposition of alginic acid and composite films. Colloid Surface A. 328, 73-78 (2008).
  30. Tsao, C. Y., Hooshangi, S., Wu, H. C., Valdes, J. J., Bentley, W. E. Autonomous induction of recombinant proteins by minimally rewiring native quorum sensing regulon of E. coli. Metab. Eng. 12, 291-297 (2010).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

ElectrodepositionChitosan FilmsAlginate FilmsLab on a ChipBioMEMSFluorescence MicroscopyElectrochemical DetectionSignal TransmissionBiological Components
Łączenie interfejsu bioelektronicznego za pomocą biofabrykacji
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.