Granulocytozależne pęcherzowanie skóry indukowane autoprzeciwciałami

Podsumowanie

W modelu zwierzęcym opisanym w niniejszej pracy, oczyszczone przeciwciała IgG przeciwko fragmentowi 200 aminokwasów (aa 757-967) kolagenu VII są wielokrotnie wstrzykiwane myszom, co pozwala na odtworzenie fenotypu pęcherzowego oraz cech histopatologicznych i immunopatologicznych charakterystycznych dla ludzkiego nabytego prątka pęcherzowego (EBA)¹.

Streszczenie

Zjawiska autoimmunologiczne występują u zdrowych osób, jednak w przypadku utraty autotolerancji odpowiedź autoimmunologiczna może prowadzić do specyficznej patologii. Zgodnie z postulatami Witebsky'ego, jednym z kryteriów rozpoznania choroby jako autoimmunologicznej jest odtworzenie tej choroby u zwierząt eksperymentalnych poprzez pasywny transfer autoprzeciwciał. W przypadku nabytej skórnej vollernejy (epidermolysis bullosa acquisita, EBA), prototypowej narządowo swoistej choroby autoimmunologicznej skóry i błon śluzowych, opracowano niedawno kilka modeli eksperymentalnych. W modelu zwierzęcym opisanym w niniejszej pracy, oczyszczone przeciwciała IgG przeciwko fragmentowi 200 aminokwasów (aa 757-967) kolagenu VII są wielokrotnie wstrzykiwane myszom, co odtwarza fenotyp pęcherzykowy oraz cechy histopatologiczne i immunopatologiczne charakterystyczne dla ludzkiej EBA ¹. Pełnoobjawowa, rozsiana choroba jest zazwyczaj widoczna 5-6 dni po pierwszym wstrzyknięciu, a zakres zmian koreluje z dawką podanego IgG swoistego dla kolagenu VII. Uszkodzenie tkanek (powstawanie pęcherzy) w eksperymentalnej EBA zależy od rekrutacji i aktywacji granulocytów przez związane z tkanką autoprzeciwciała ^2,-4. W związku z tym model ten pozwala na analizę zależnej od granulocytów ścieżki zapalnej uczestniczącej w autoimmunologicznym uszkodzeniu tkanek, ponieważ odtwarza on jedynie fazę niezależną od limfocytów T w eferentnej odpowiedzi autoimmunologicznej. Co więcej, jego wartość podkreśla szereg badań wykazujących potencjał autoprzeciwciał do indukowania pęcherzy in vivo oraz badających mechanizm powstawania pęcherzy w EBA ^1,3,-6. Wreszcie, model ten znacznie ułatwi opracowanie nowych terapii przeciwzapalnych w chorobach indukowanych przez autoprzeciwciała. Ogólnie rzecz biorąc, zwierzęcy model pasywnego transferu EBA jest dostępnym i pouczającym modelem choroby, który pomoże badaczom analizować nie tylko patogenezę EBA, ale także odpowiadać na fundamentalne, biologicznie i klinicznie istotne pytania dotyczące autoimmunizacji.

Protokół

1. Przygotowanie przeciwciał patogennych

Uwaga: Oczyszczanie i zagęszczanie przeciwciał należy przeprowadzić tego samego dnia, ponieważ przeciwciał nie powinno się przechowywać przez noc (ON) w 0.1 M glicynie pH 2.5-3 (bufor elucyjny).

Oczyszczanie powinowactwa IgG: należy użyć 25 ml surowicy królika immunizowanego:

1. Rozmrozić surowicę królika ON w temperaturze 4 °C, wymieszać ją w stosunku 1:1 z 1xPBS (buforem prowadzącym) i odwirować przy 1260 x g przez 10 min w temperaturze 20 °C. Opcjonalnie, w przypadku tłustej surowicy, po wirowaniu można przeprowadzić etap filtrowania za pomocą papieru filtrującego.
2. W międzyczasie przemyć kolumnę wypełnioną macierzą białka G 10 objętościami złoża (objętość złoża = objętość macierzy) 1XPBS (buforem prowadzącym).
3. Nanieść rozcieńczoną i przefiltrowaną surowicę na kolumnę i inkubować przez 1 hr na platformie kołyszącej w temperaturze pokojowej (RT).
4. Zebrać frakcję przepływową (FT) do probówki Falcon 50 ml. Nie utylizować jej do czasu ustalenia stężenia i miana oczyszczonego IgG.
5. Przemyć macierz 5 objętościami złoża 1XPBS, a w międzyczasie przygotować probówki Falcon 50 ml do zbierania frakcji eluentu IgG. Do każdej probówki pipetować 1 ml buforu neutralizującego pH: 1 M TRIS pH 10 (lub zachować proporcję 1:20 buforu TRIS w stosunku do ilości zbieranego eluatego).
6. Nanieść na kolumnę 100-150 ml buforu elucyjnego: 0,1 M glicyny pH 2,5-3 i zbierać frakcje po 50 ml. Odwrócić probówkę 2-3x, zmierzyć pH i dodawać bufor neutralizujący do osiągnięcia pH 7,2-7,4.
7. Pobrać kilka kropli eluatego IgG i, używając buforu elucyjnego jako wzorca, zmierzyć OD przy 280 nm. Jeśli OD wynosi <0,1, przerwać zbieranie.
8. Zregenerować macierz białka G i przechowywać ją zgodnie z instrukcjami producenta.

Koncentracja poprzez ultrafiltrację z użyciem probówek Amicon:

1. Przemyj probówki do ultrafiltracji Amicon Ultra (15 ml /30KDa) roztworem 1XPBS, wirując przez 15-20 min przy 3,220 x g w temperaturze 4 °C. Odlej filtrat (FT) z Amicona.
2. Napełnij probówki Amicon 15 ml elowanej frakcji IgG i wiruj przez 25-30 min przy 3,220 x g i 4 °C; czas wirowania zawsze zależy od zawartości białka w elucie.
3. Odlej filtrat (FT) i powtarzaj ultrafiltrację, aż do całkowitego wykorzystania elowanej frakcji.
4. Dokładnie przemyj skoncentrowane IgG dwukrotnie roztworem 1XPBS przez 25-30 min poprzez wirowanie.
5. Zbierz „lepki”, żółtawy roztwór przeciwciał z filtra Amicon do końcowej objętości 1,500-2,000 μl roztworu 1XPBS.
6. Zmierz stężenie preparatu IgG przy użyciu spektrofotometru lub NanoDrop:
   Stężenie (mg/ml) = A(280 nm) x czynnik rozcieńczenia /1,4
7. Umyj i przechowuj probówki Amicon zgodnie z instrukcjami producenta.

2. Wstrzykiwanie myszom swoistych dla kolagenu VII przeciwciał IgG

Przed rozpoczęciem właściwej procedury eksperymentalnej należy upewnić się, że protokół doświadczalny został spisany, a wszystkie materiały niezbędne do przeprowadzenia eksperymentu są przygotowane.

1. Przygotować arkusze danych do oceny stopnia zaawansowania choroby, testów ELISA, analizy immunofluorescencyjnej (IF) oraz oznaczenia mieloperoksydazy (MPO) ⁴.
2. Oznakować probówki na krew i organy, formy do mrożenia (cryomolds) oraz kasety do obróbki histologicznej i zatapiania w parafinie.
3. Roztwory przeciwciał należy przygotować na świeżo lub rozmrozić z zapasów i scharakteryzować pod kątem reaktywności (miano w mikroskopii IF i/lub testach ELISA). Sterylnie przefiltrowany roztwór przeciwciał należy rozcieńczyć w PBS w taki sposób, aby wymagana dawka do wstrzyknięcia mieściła się w zakresie 250-1000 μl. Należy upewnić się, że dysponuje się wystarczającą ilością IgG do przeprowadzenia całego eksperymentu.
4. Przygotować świeży antykoagulant: heparynę 20 U/ml oraz mieszaninę ketaminy 8,7 mg/ml i ksylazyny 1,3 mg/ml do znieczulenia. Na czas uśmiercania myszy należy przygotować oznakowane probówki z 3,7% formaldehydem.
5. Zesterylizować narzędzia chirurgiczne (skalpel, nożyczki, pęsety z ostrym końcem i zakrzywione) oraz przygotować strzykawki (strzykawki insulinowe, strzykawki 1 i 2 ml), igły, aparat cyfrowy i dodatkową kartę pamięci.

Uwaga: Wszystkie procedury należy przeprowadzać na myszach z narkozą ketaminą/ksylazyną lub izofluranem. Izofluran jest preferowaną opcją znieczulenia podczas codziennych kontroli skóry, ponieważ myszy szybko się budzą. Jednakże podczas robienia zdjęć zazwyczaj wstrzykuje się podskórnie 87 mg/kg ketaminy i 13 mg/kg ksylazyny. W przypadku eutanazji dawkę ketaminy/ksylazyny zwiększa się do 130 mg/kg ketaminy i 20 mg/kg ksylazyny.

1. Oceń ogólny stan zdrowia, wygląd skóry i futra wcześniej oznakowanych zwierząt, zważ je i zmierz grubość ucha (zawsze wykonuj pomiar w tym samym uchu).
2. Zarejestruj zaobserwowane wartości i zmiany w arkuszu oceny klinicznej.
3. Pobierz 20-30 μl (2-3 krople) krwi z żyły ogonowej do strzykawki zawierającej taką samą objętość antykoagulanta.
4. Zdezynfekuj futro i skórę, używając 80% etanolu.
5. Wstrzyknij podskórnie w okolice grzbietu roztwór przeciwciał, używając strzykawki insulinowej. (W przypadku niektórych miejsc (np. uszu) możliwe jest wstrzyknięcie jedynie niewielkich objętości (10-50 μl).)

Iniekcje należy powtarzać co drugi dzień, łącznie 4 razy. U myszy Balb/c i C57BL6 o masie ciała około 20 g choroba zaczyna się rozwijać 3-4 dni po pierwszym podaniu autoprzeciwciał w dawce od 400-500 do 750 μg/g masy ciała na iniekcję.

Po zakończeniu eksperymentu:

1. Wprowadź myszy w stan głębokiej narkozy, wstrzykując podskórnie ketaminę/ksylazynę w dawkach 130 mg/kg i 20 mg/kg, upuść krew z tylnej żyły głównej i wyciнь serce.
2. Pobierz próbki narządów/tkanek, takich jak skóra: ogon, ucho, krew oraz przełyk, i umieść je w wcześniej oznakowanych probówkach wypełnionych PBS lub 3,7% formaldehydem.

Po powrocie do laboratorium:

1. Wirować krew przy 1,200 x g przez 10 min w temperaturze pokojowej (RT) w celu oddzielenia osocza, następnie przenieść osocze do odpowiednio oznakowanych probówek i przechowywać zgodnie z procedurą.
2. Zatopić biopsjat skóry w medium OCT (Optimal Cutting Temperature) przy użyciu form do mrożenia, odpowiednio oznakować i przechowywać w temperaturze -80 °C.
3. Przenieść próbki tkankowe przeznaczone do badania histologicznego do oznakowanych form do zatapiania i przechowywać w 3,7% formaldehydzie do czasu zatopienia w parafinie.

3. Kliniczna ocena ciężkości choroby

Myszy należy codziennie badać pod kątem wystąpienia zmian skórnych i błon śluzowych, a wyniki należy rejestrować w odpowiednich formularzach. Kryteriami wczesnej eutanazji są zmiany skórne obejmujące ponad 20% powierzchni ciała oraz utrata masy ciała rzędu 5-10% całkowitej masy ciała w ciągu trzech kolejnych dni, co odpowiada wynikowi punktacji choroby wynoszącemu 5 (Tabela 1).

1. Połóż mysz na brzuchu. Rozpocznij od obszaru głowy, a konkretnie od prawego ucha, sprawdzając występowanie pęcherzy, nadżerek oraz strupów po stronie wewnętrznej i zewnętrznej. Postąp w ten sam sposób z lewym uchem.
2. Oko prawe i lewe należy zbadać pod kątem obecności rumienia, łysienia, nadżerek i/lub strupów.
3. Następnie należy przejrzeć sierść w obszarze czoła i pyszczka, kontynuując badanie w części brzusznej pyszczka, wargach oraz błonie śluzowej jamy ustnej.
4. Zbadaj prawą przednią kończynę, zaczynając od łapy i przesuwając się ku górze; następnie powtórz czynność dla lewej przedniej kończyny. Zastosuj tę samą procedurę w przypadku prawych i lewych kończyn tylnych.
5. Przejrzyj sierść w obszarze szyi i grzbietu, używając zakrzywionej pęsety z cienkim czubkiem.
6. Połóż mysz na grzbiecie i w ten sam sposób sprawdź część brzuszną oraz strony brzuszne kończyn.
7. Sprawdź ogon.
8. Wykonaj zdjęcia odpowiednich części ciała, w których u myszy rozwinęła się choroba. Należy zwrócić uwagę na jakość i liczbę zdjęć.
9. Oblicz kliniczne wskaźniki nasilenia choroby.

4. Analiza próbek skóry i osocza

1. Przygotować, przechowywać i/lub przetworzyć wszystkie pobrane tkanki zgodnie z planem.
2. Wyciąć skrawki zamrożonej tkanki do detekcji przeciwciał króliczych i komponentów układu dopełniacza mysiego metodą IF.
3. Przeanalizować zawartość różnych białek i enzymów (test MPO) w zamrożonej tkance i/lub ekstraktach z organów.
4. Wyciąć skrawki tkanki zatopionej w parafinie i zabarwić metodą H&E w celu wizualizacji zakresu uszkodzeń tkanki.
5. Przeanalizować osocze metodą ELISA oraz immunoblottingu.

Wyniki

Pasywny transfer przeciwciał specyficznych dla antygenu prowadzi do pełnoobjawowej choroby u myszy, która na poziomie klinicznym, histologicznym i immunopatologicznym przypomina ludzkie EBA. Na uszach, pyszczku, łapach, nogach, grzbiecie i wokół oczu myszy rozwijają się pęcherze, strupy, nadżerki oraz łysienie. Pierwsze objawy kliniczne choroby pojawią się najprawdopodobniej na uszach i/lub w obszarze głowy. Za pomocą bezpośredniej IF w krioskrawkach skóry okołoziebiowej wykrywane jest odkładanie się specyficznego IgG kr...

Dyskusja

Pasywny transfer autoprzeciwciał do zwierząt doświadczalnych jest główną metodą wykazania ich patogenności ^{7, -12}. Modele zwierzęce uzyskane tą metodą, poza tym że stanowią pośredni dowód autoimmunizacji ¹³, umożliwiają badanie fazy eferentnej mechanizmu patogennego. Model pasywnego transferu przeciwciał indukujących zależne od granulocytów pęcherze skórne w nabytej błonistych skórze (EBA) został wykorzystany do analizy mechanizmów uszkodzenia tkanek w autoimmunologicznych dermatozach. Okazał się on...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
antygen rekombinowany			Plazmidy kodujące rekombinowane formy mysiego kolagenu VII są dostępne u autora korespondencyjnego.
immunizowane surowica królicza	www.eurogentec.com		Królikach nowozelandzkich białych przeprowadzono immunizację dawką 200 μg antygenu, 3 razy w odstępach 2-tygodniowych. W tym celu wykorzystano usługi firmy Eurogentec S.A., Belgia.
Agaroza z Proteiną G	Roche Applied Science	11243233001
Myszy Balb/c	Charles River Laboratories
Związek OCT, Tissue-Tek	Sakura Finetek	4583	OCT, optymalna temperatura cięcia
Krioforemka standardowa	Sakura Finetek	4557	25 mm × 20 mm × 5 mm
Krioforemka pośrednia	Sakura Finetek	4566	15 mm × 15 mm × 5 mm
Uni-Link-Einbettkassette	R. Langenbrinck	09-0503	Kasety do przetwarzania i zatapiania histologicznego
Spezial-Tatowierfarbe Schwarz	H. Hauptnerund Richard Herberholz GmbH Co. KG	71492000	pasta do tatuażu
Tatowierzange TZ1	EBECO E. Becker Co GmbH		urządzenie do tatuażu
Heparyna	Carl Roth GmbH Co.	7692.1
Formaldehyd 37%	Carl Roth GmbH Co.	7386
Chlorowodorek ketaminy	Sigma-Aldrich Chemie GmbH	K2753-1G
Chlorowodorek ksylazyny	Sigma-Aldrich Chemie GmbH	X1251-1G
sterylny PBS	Biochrom	L182-50
aparat cyfrowy	Nikon	Coolpix 5400
Jednorazowa jednostka filtrująca z nakładką na strzykawkę 0,45 μm	Millipore
Suwmiarka	Mitutoyo 7309	1667338	Farnell (dystrybutor)
arkusz oceny choroby			dołączono przykład