Artykuł metodologiczny

Dwu- i trójwymiarowe obrazowanie żywych komórek białek odpowiedzi na uszkodzenia DNA

DOI:

10.3791/4251

⸱

28 września 2012

 ,  , 
1Department of Radiation Oncology, Virginia Commonwealth University, 2Department of Biochemistry & Molecular Biology, Virginia Commonwealth University, 3Department of Anatomy & Neurobiology, Virginia Commonwealth University, 4Massey Cancer Center, Virginia Commonwealth University

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten protokół opisuje metodę wizualizacji białka sygnalizacyjnego dwuniciowego DNA, aktywowanego w odpowiedzi na uszkodzenie DNA, jak również jego lokalizacji podczas mitozy.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Pęknięcia dwuniciowe (DSB) są najbardziej szkodliwymi uszkodzeniami DNA, jakie może napotkać komórka. Jeśli nie zostaną naprawione, DSB mają ogromny potencjał do generowania mutacji i aberracji chromosomowych1. Aby zapobiec katalizowaniu niestabilności genomu przez tę traumę, ważne jest, aby komórki wykrywały DSB, aktywowały odpowiedź na uszkodzenie DNA (DDR) i naprawiały DNA. Po stymulacji DDR działa w celu zachowania integralności genomu, wyzwalając zatrzymanie cyklu komórkowego, aby umożliwić naprawę lub zmusić komórkę do poddania się apoptozie. Dominujące mechanizmy naprawy DSB zachodzą poprzez niehomologiczne łączenie końców (NHEJ) i naprawę rekombinacji homologicznej (HRR) (omówione w2). Istnieje wiele białek, których aktywność musi być precyzyjnie zaaranżowana, aby DDR działała prawidłowo. W niniejszym artykule opisano metodę 2- i 3-wymiarowej (D) wizualizacji jednego z tych białek, 53BP1.

Białko wiążące p53 1 (53BP1) lokalizuje się w obszarach DSB, wiążąc się ze zmodyfikowanymi histonami3,4, tworząc ogniska w ciągu 5-15 minut5. Uważa się, że modyfikacje histonów i rekrutacja 53BP1 i innych białek DDR do miejsc DSB ułatwiają strukturalne przegrupowanie chromatyny wokół obszarów uszkodzenia i przyczyniają się do naprawy DNA6. Poza bezpośrednim udziałem w naprawie, opisano dodatkowe role 53BP1 w DDR, takie jak regulacja punktu kontrolnego wewnątrz S, punktu kontrolnego G2 / M i aktywacja dalszych białek DDR7-9. Niedawno odkryto, że 53BP1 nie tworzy ognisk w odpowiedzi na uszkodzenia DNA wywołane podczas mitozy, zamiast tego czeka, aż komórki wejdą do G1 przed lokalizacją w pobliżu DSB6. Stwierdzono, że białka DDR, takie jak 53BP1, wiążą się ze strukturami mitotycznymi (takimi jak kinetochory) podczas progresji przez mitozę10.

W tym protokole opisujemy użycie obrazowania żywych komórek 2- i 3D do wizualizacji powstawania ognisk 53BP1 w odpowiedzi na czynnik uszkadzający DNA kamptotecyny (CPT), a także zachowanie 53BP1 podczas mitozy. Kamptotekyna jest inhibitorem topoizomerazy I, który głównie powoduje DSB podczas replikacji DNA. Aby to osiągnąć, użyliśmy wcześniej opisanego konstruktu fluorescencyjnego białka fuzyjnego 53BP1-mCherry składającego się z domeny białkowej 53BP1 zdolnej do wiązania DSB11. Ponadto użyliśmy konstruktu fluorescencyjnego białka fuzyjnego H2B-GFP, który jest w stanie monitorować dynamikę chromatyny w całym cyklu komórkowym, ale w szczególności podczas mitozy12. Obrazowanie żywych komórek w wielu wymiarach jest doskonałym narzędziem do pogłębienia naszej wiedzy na temat funkcji białek DDR w komórkach eukariotycznych.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

A. Przygotowanie komórek

  1. Normalne ludzkie pierwotne fibroblasty (GM02270) uzyskano z Coriell Cell Repository, Camden, New Jersey i unieśmiertelniono za pomocą hTERT 6. Komórki hodowano i namnażano w 6-cm szalkach CellStar w pożywce (4 ml) składającej się z MEM uzupełnionego 20% płodową surowicą bydlęcą (GIBCO), aminokwasami endogennymi/egzogennymi, witaminami, pirogronianem sodu i penicyliną/streptomycyną (HyClone).
  2. Ludzkie embrionalne komórki nerkowe 293 (HEK293) uzyskano z American Type Culture Collection, a następnie wyhodowano i namnażano w 6-centymetrowych szalkach CellStar. Komórki przechowywano w pożywce (4 ml) składającej się z DMEM uzupełnionego 10% płodową surowicą bydlęcą, endogennymi aminokwasami, L-glutaminą i penicyliną/streptomycyną.
  3. 53BP1-mCherry (N-Myc-53BP1 WT pLPC-Puro; Plazmid Addgene 19836) i H2B-GFP (pCLNR-H2BG; Konstrukty genu fuzyjnego plazmidu Addgene 17735) również wyrażające odpowiednio geny oporności na puromycynę lub G418 były transdukowane (fibroblasty) lub transfekowane (HEK293) przy użyciu SuperFect (Qiagene) do komórek i utrzymywane w ramach selekcji leków. Utrzymanie fluorescencji było okresowo sprawdzane.
  4. 24-48 godzin przed akwizycją obrazu, komórki trypsynizowano do zawiesiny jednokomórkowej i wysiewano z niską gęstością na 3,5-centymetrowych szklanych płytkach dolnych FluroDish.

B. Konfiguracja mikroskopu i akwizycja obrazu

Ten protokół został opracowany przy użyciu mikroskopu konfokalnego Zeiss Cell Observer SD z wirującym dyskiem wyposażonym w statyw AxioObserver Z1, dwukanałowego dysku wirującego Yokagawa CSU-X1A 5000, 2 kamer Photometrics QuantEM 512SC emCCD, oświetlacza światłowodowego HXP 120C, 4 laserów (wieloliniowy Argon Lasos 100mW [458, 488, 514 nm], dioda 50 mW 405 nm, dioda 40 mW 561 nm, i dioda 30 mW 635 nm), AOTF, system inkubacji Pecon XL multiS1 stage, moduły inkubacyjne Zeiss (O2 Module S, CO2 Module S, TempModule S, Heating Unit XL S) oraz Prior zmotoryzowany stopień XY z wkładką NanoScanZ piezo Z. Aby zminimalizować aberracje sferyczne podczas obrazowania żywych komórek podpartych w środowisku wodnym, zastosowano soczewkę obiektywową C-Apochromat 63x/1,20 Water/Corr oraz płyn zanurzeniowy Zeiss Immersol W (o współczynniku załamania światła n = 1,334). Do 2-kanałowego obrazowania konfokalnego zastosowano zwierciadło dichroiczne RQFT 405/488/568/647 oraz filtry emisyjne BP525/50 (zielony) i BP629/62 (czerwony). Użyto oprogramowania systemowego Zeiss Axiovision (ver. 4.8.2.0) z modułami AV4 Multi-channel/Z/T, Fast Imaging, Physiology, MosaiX, Mark & Find, Dual Camera, Inside 4D, Autofocus i 3-D Deconvolution.

  1. Upewnij się, że gaz CO2 jest dostarczany do modułu CO2 systemu inkubacji. Jeśli mikroskop jest wsparty na stole powietrznym antywibracyjnym, włącz dopływ powietrza (lub gazN2) do stołu powietrznego.
  2. Włącz zasilanie statywu mikroskopu, obracającego się zespołu dyskowego, kamer, modułów inkubacyjnych, oświetlacza HXP, zmotoryzowanego stolika, lasera argonowego i komputera.
  3. Po 1 minutach nagrzewania przekręć kluczyk zapłonu lasera argonowego do pozycji "On".
  4. Na panelu sterowania lasera Zeiss włącz przełączniki używanych linii laserowych.
  5. Przełącz przełącznik sterownika lasera Lasos Argon z "czuwania" na "bieg lasera" i ustaw sterownik światła na optymalnym poziomie (tj. tuż poniżej punktu, w którym zielony wskaźnik zmienia kolor na czerwony).
  6. Uruchom oprogramowanie AxioVision. Uwaga: interfejs użytkownika AxioVision można dostosować za pomocą okien i menu rozwijanych, które są specyficzne dla konkretnego mikroskopu i komponentów, którymi steruje. W związku z tym każdy system ma potencjalnie unikalny interfejs. W związku z tym w kolejnych krokach znajdują się ogólne instrukcje dotyczące manipulowania oprogramowaniem, a nie wskazówki dotyczące konkretnych okien oprogramowania, kart i/lub menu rozwijanych.
  7. Około 1 godzinę przed obrazowaniem w oprogramowaniu zlokalizuj elementy sterujące inkubatora i włącz ogrzewanie górnej komory i płytki stopniowej. Ustaw temperaturę na 37 °C. Włącz regulator CO2 i ustaw poziom na 5%.
  8. Wybierz soczewkę obiektywu do obrazowania. W tym badaniu zastosowano soczewkę obiektywową 63x/1,20 N.A. C-Apochromat Water/Corr. Uwaga: W przypadku tego obiektywu potrzebny jest ośrodek zanurzeniowy o współczynniku załamania światła podobnym do wody (płyn zanurzeniowy Zeiss Immersol W).
  9. Jeżeli w ciągu długiego czasu ma być pobierane próbki z wielu oddzielnych pozycji, należy upewnić się, że nałożono wystarczającą ilość podłoża zanurzeniowego, aby zapewnić jego przenoszenie z jednego miejsca do drugiego.
  10. Umieść naczynie na stoliku i doprowadź soczewkę obiektywu do kontaktu z dnem.
  11. Za pomocą elementów sterujących mikroskopu lub oprogramowania skieruj emitowane światło na okulary i wybierz odpowiedni zestaw filtrów szerokokątnych dla interesującego sygnału fluorescencyjnego (w tym badaniu zestaw filtrów "czerwonych" dla 53BP1 i zestaw filtrów "GFP" dla H2B).
  12. Spójrz przez soczewki okularowe, ustaw ostrość obrazu i zlokalizuj odpowiednie pole komórek.
  13. Za pomocą oprogramowania lub elementów sterujących mikroskopu skieruj emitowane światło z dala od okularów do portu z konfokalnym zespołem obracającego się dysku.
  14. W oprogramowaniu włącz odpowiedni laser (do tego badania laser 561 nm dla 53BP1 i linia 488 nm lasera Argon dla H2B).
  15. Dla każdego kanału dostosuj intensywność lasera, dostosowując sterowanie przestrajalnym filtrem akustyczno-optycznym (AOTF) do odpowiedniego poziomu.
  16. Wybierz odpowiednie zwierciadło dichroiczne (RQFT 405/488/568/647) i filtry emisyjne (BP 629/62 dla 53BP1 i BP 525/50 dla H2B). Otwórz żaluzję zespołu obracającego się dysku.
  17. Wybierz okno "Na żywo", aby wyświetlić bieżące pole widzenia.
  18. W oprogramowaniu otwórz kontrolkę "Kamera", wybierz kamerę, która ma być używana (jeśli jest to system z dwiema kamerami) i ustaw czas ekspozycji na około 100 ms. W razie potrzeby dostosuj % i wzmocnienie EM. nuta: Konstrukt 53BP1-mCherry wydaje się nieco przyćmiony. Stwierdziliśmy, że pomocne jest zwiększenie wzmocnienia EM.
  19. W oprogramowaniu otwórz element sterujący konfokalnego zespołu obracającego się dysku i wyreguluj prędkość obracającej się tarczy, wprowadzając czas ekspozycji kamery, który został ustawiony na uchwycenie odpowiedniego obrazu (np. ~100 ms). Kliknij "Ustaw", aby zablokować zmianę.
  20. Otwórz "akwizycję wielowymiarową". Wybierz zakładkę kanału i załaduj/wybierz odpowiednie kanały. W tym badaniu używamy kanałów zdefiniowanych dla dsRed (wzbudzenie laserem 561 nm i filtr BP 629/62 do emisji) oraz GFP (linia laserowa 488 nm do wzbudzenia i filtr BP525/50 do emisji).
  21. Aby zapewnić rejestrację obrazu, dla obu kanałów zastosowano wspólne zwierciadło dichroiczne (RQFT 405/488/568/647). Ustaw oprogramowanie na "Autofokus". Uwaga: Przejdź do Narzędzia→ edytora ustawień, aby dostosować ustawienia MDA. Upewnij się, że ustawiona jest odpowiednia moc lasera ("Odpowiednia moc lasera" odnosi się do ustawienia, które umożliwia wzbudzenie odpowiedniego fluoroforu przy jednoczesnym zminimalizowaniu fotowybielania).
  22. W oknie MDA wybierz zakładkę z-stack. Zaznacz "Z-stack at current focus position" (Stos z w bieżącej pozycji fokusu). Ustaw zakres dla stosu z ~10 μm i wybierz "optymalny" dla liczby kroków, aby zapewnić próbkowanie Nyquist przez Z. Uwaga: Dokładny rozmiar stosu z będzie zależał od wysokości twoich komórek. Dostosuj odpowiednio.
  23. 23. Kliknij "Start" i przeanalizuj wynikowy obraz stosu z, aby upewnić się, że ustawienia są odpowiednie do tego, co badasz (np. w tym badaniu ważne było zobrazowanie całego jądra).
  24. Wybierz zakładkę "T" (czas). W naszym eksperymencie z kamptotecyną ustawiliśmy odstęp między punktami czasowymi obrazowania na 5 minut, a całkowity czas trwania sesji na 1 godzinę dla filmu kontrolnego (komórki nieleczone). Uwaga: aby zminimalizować fotowybielanie komórek, eksperyment powinien być skonfigurowany w taki sposób, aby AOTF wygaszał laser między punktami czasowymi obrazowania.
  25. W przypadku obrazowania wielopunktowego kilku komórek w czaszy, w oknie MDA wybierz zakładkę pozycji. Upewnij się, że zaznaczona jest opcja "Zastosuj ustawienie przed/po" punktu czasowego dla każdej pozycji". Wybierz "Mark_Find". Korzystając z widoku "Na żywo", przesuwaj antenę i wybierz odpowiednie pola widzenia.
  26. Kliknij "Start" w menu akwizycji wielowymiarowej, aby rozpocząć eksperyment i nagrać film kontrolny (z nieleczonych komórek).
  27. Po filmie kontrolnym dodaj odpowiednią terapię (w tym przypadku 10 μM kamptotecyny). Nagrywaliśmy eksperymentalny film (komórki leczone lekami) w odstępach 5-10 minut przez 2-4 godziny. Uwaga: Ważną kwestią do rozważenia jest szybkość, z jaką dany efekt następuje po leczeniu. Jak widać na filmie, ogniska 53BP1 zaczynają się od ~5 minut po dodaniu CPT. Chociaż jest to stosunkowo łatwy proces, ręczne dodawanie leku do naczynia i ponowna kalibracja mikroskopu zajmuje trochę czasu. Należy wziąć to pod uwagę przy projektowaniu eksperymentów.
  28. W celu monitorowania mitozy ustawiamy interwał na 7,5 minuty i nagrywamy przez 4-5 godzin (konkretne ustawienia zależą od użytej linii komórkowej i długości jej cyklu komórkowego). Może być konieczne dokonanie regulacji, aby zapobiec wybielaniu zdjęć podczas dłuższych nagrań.

C. Przetwarzanie i analiza obrazu

Ten protokół został opracowany przy użyciu oprogramowania Volocity (PerkinElmer). Oprogramowanie wykorzystywane do pozyskiwania tych danych (AxioVision) posiada również możliwość przetwarzania i analizy obrazów. Użytkownicy są zachęcani do korzystania z dostępnego dla nich oprogramowania i zapoznania się z odpowiednią literaturą dotyczącą ich zastosowania.

  1. Otwórz oprogramowanie Volocity. Utwórz i nazwij nową bibliotekę, a następnie zaimportuj pliki wideo.
  2. Do przeglądania plików zwykle najbardziej pomocne jest użycie ustawienia "Rozszerzone skupienie". Nakłada to na siebie warstwy stosu z i dla tego protokołu pozwala nam uwidocznić ogniska 53BP1 w różnych obszarach jądra.
  3. W razie potrzeby dostosuj filmy. Volocity jest wyposażony w szereg narzędzi poprawiających jakość pozyskiwanych obrazów. Upewniając się, że ustawienia mikroskopu są odpowiednie, można zaoszczędzić dużo czasu na późniejszą edycję. Często pomocne jest zdekonwolucjonizowanie obrazów i dostosowanie jasności/kontrastu. Twoje konkretne potrzeby edycyjne będą się różnić w zależności od eksperymentu.
  4. Dodaj względny znacznik czasu i podziałkę liniową.
  5. Aby wyświetlić komórki w 3-W, przełącz się na ustawienie "Krycie 3-W". Pozwala to na obracanie komórek renderowanych w 3D w przestrzeni, zapewniając w ten sposób wiele perspektyw interesujących struktur w komórkach. nuta: Pomocne jest wizualizowanie komórek na różnych płaszczyznach w celu określenia, gdzie przemieszczają się interesujące struktury. Na przykład w ustawieniu "Rozszerzone skupienie" trudno jest stwierdzić, że 53BP1 w rzeczywistości dysocjuje od DNA podczas mitozy. Jest to jednak łatwo widoczne w 3D.
  6. Filmy i zdjęcia można eksportować do różnych typów plików w zależności od preferencji użytkownika.

D. Reprezentatywne wyniki

Przykład powstawania ognisk 53BP1 w odpowiedzi na CPT pokazano na rysunku 1. Komórki wystawione na działanie CPT tworzą ogniska w ciągu 5-10 minut i utrzymują te ogniska przez cały czas trwania zapisu. Jak pokazano na rysunku 2, 53BP1 dysocjuje od chromatyny na początku mitozy, tworząc cienką mgiełkę wokół kondensujących się chromosomów. Gdy zachodzi telofaza i mitoza dobiega końca, 53BP1 ponownie agreguje się w odrębne ogniska. Chociaż komórki HEK293 nie były narażone na działanie CPT, niemniej jednak utworzyły obfite, spontaniczne ogniska naprawcze 53BP1 generowane przez endogenne uszkodzenie DNA. Obserwacja ta pozwoliła nam stwierdzić, że 53BP1 nie tworzy ognisk podczas wczesnej mitozy, zgodnie z poprzednim raportem wykazującym podobny efekt po ekspozycji komórek na promieniowanie jonizujące i leki radiomimetyczne 5.

figure-protocol-1
Rysunek 1. Kamptotecyna (10 μM) powoduje powstawanie ognisk DSB i 53BP1 w cyklicznych fibroblastach w ciągu 30 minut od dodania leku do pożywki.

figure-protocol-2
Rysunek 2. 53BP1 nie tworzy ognisk podczas mitozy aż do telofazy/G1 w komórkach HEK293.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Utrzymanie integralności genomu ma kluczowe znaczenie dla przetrwania komórek. Niezachowanie genomu skutkuje przedwczesnym starzeniem się, kancerogenezą lub śmiercią 8. Istnieje duże zainteresowanie poznaniem, jak funkcjonuje DDR, co wynika z jego znaczenia zarówno dla badań podstawowych, jak i klinicznych. Na przestrzeni lat opracowano wiele technik, które pomagają w badaniu, w jaki sposób komórki wykrywają i naprawiają uszkodzenia DNA. Tradycyjne metody, takie jak immunocytochemia i western blotting, były p...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nie stwierdzono konfliktu interesów.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Częściowo wspierane przez R01NS064593 i R21ES016636 (K.V.). Mikroskopia została wykonana w VCU - Department of Neurobiology & Anatomy Microscopy Facility, wspieranym częściowo przez finansowanie z grantu podstawowego NIH-NINDS Center 5P30NS047463. Mikroskop konfokalny z wirującym dyskiem został zakupiony z nagrodą NIH-NCRR (1S10RR027957).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Naczynia hodowlane CellStarGreiner Bio-one
FluroDish naczynia ze szklanym dnemWorld Precision Instruments, Inc.
MEM mediaGIBCO
Aminokwasy endogenneGIBCO
AminokwasyGIBCO
WitaminyGIBCO
Pirogronian soduInvitrogen
Penicylina/Streptomycyna Hyklon
Płodowa surowicabydlęcaGIBCO
N-Myc-53BP1 WT pLPC-Puro;
plazmid 19836		Addgene
pCLNR-H2BG; plazmid 17735Addgene
SuperFectQiagen
Zeiss Cell Observer SDZeiss
AxioVision (wydanie 4.8.2)Zeiss
Zeiss Immersol W OilOprogramowanie Zeiss
Volocity ( wersja 6.0)PerkinElmer
System obrazowania

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Botuyan, M. V., Lee, J., Ward, I. M., Kim, J. E., Thompson, J. R., Chen, J., Mer, G. Structural basis for the methylation state-specific recognition of histone H4-K20 by 53BP1 and Crb2 in DNA repair. Cell. 127, 1361-1373 (2006).
  2. Dimitrova, N., Chen, Y. C., Spector, D. L., de Lange, T. 53BP1 promotes non-homologous end joining of telomeres by increasing chromatin mobility. Nature. 456, 524-528 (2008).
  3. Feuerhahn, S., Egly, J. M. Tools to study DNA repair: what's in the box. Trends Genet. 24, 467-474 (2008).
  4. Giunta, S., Belotserkovskaya, R., Jackson, S. P. DNA damage signaling in response to double-strand breaks during mitosis. J. Cell Biol. 190, 197-207 (2010).
  5. Giunta, S., Jackson, S. P. Give me a break, but not in mitosis: the mitotic DNA damage response marks DNA double-strand breaks with early signaling events. Cell Cycle. 10, 1215-1221 (2011).
  6. Golding, S. E., Morgan, R. N., Adams, B. R., Hawkins, A. J., Povirk, L. F., Valerie, K. Pro-survival AKT and ERK signaling from EGFR and mutant EGFRvIII enhances DNA double-strand break repair in human glioma cells. Cancer Biol. Ther. 8, 730-738 (2009).
  7. Huyen, Y., Zgheib, O., Ditullio, R. A., Gorgoulis, V. G., Zacharatos, P., Petty, T. J., Sheston, E. A., Mellert, H. S., Stavridi, E. S., Halazonetis, T. D. Methylated lysine 79 of histone H3 targets 53BP1 to DNA double-strand breaks. Nature. 432, 406-411 (2004).
  8. Jackson, S. P., Bartek, J. The DNA-damage response in human biology and disease. Nature. 461, 1071-1078 (2009).
  9. Kanda, T., Sullivan, K. F., Wahl, G. M. Histone-GFP fusion protein enables sensitive analysis of chromosome dynamics in living mammalian cells. Curr. Biol. 8, 377-385 (1998).
  10. Massignani, M., Canton, I., Sun, T., Hearnden, V., Macneil, S., Blanazs, A., Armes, S. P., Lewis, A., Battaglia, G. Enhanced fluorescence imaging of live cells by effective cytosolic delivery of probes. PLoS One. 5, e10459(2010).
  11. Nakamura, K., Sakai, W., Kawamoto, T., Bree, R. T., Lowndes, N. F., Takeda, S., Taniguchi, Y. Genetic dissection of vertebrate 53BP1: a major role in non-homologous end joining of DNA double strand breaks. DNA Repair (Amst). 5, 741-749 (2006).
  12. Schultz, L. B., Chehab, N. H., Malikzay, A., Halazonetis, T. D. p53 binding protein 1 (53BP1) is an early participant in the cellular response to DNA double-strand breaks. J. Cell. Biol. 151, 1381-1390 (2000).
  13. Valerie, K., Povirk, L. F. Regulation and mechanisms of mammalian double-strand break repair. Oncogene. 22, 5792-5812 (2003).
  14. Wang, B., Matsuoka, S., Carpenter, P. B., Elledge, S. J. 53BP1, a mediator of the DNA damage checkpoint. Science. 298, 1435-1438 (2002).
  15. Ward, I. M., Minn, K., Jorda, K. G., Chen, J. Accumulation of checkpoint protein 53BP1 at DNA breaks involves its binding to phosphorylated histone H2AX. J. Biol. Chem. 278, 19579-19582 (2003).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Live Cell ImagingDNA Damage Response53BP1 FociCamptothecin TreatmentConfocal MicroscopyFluorescent Fusion ProteinsChromatin DynamicsMitotic Cell AnalysisSpatial Temporal RelationshipsGenomic Stability

Powiązane artykuły