Niniejszy protokół opisuje metodę wizualizacji białka sygnałowego pęknięć dwuniciowych DNA, aktywowanego w odpowiedzi na uszkodzenie DNA, a także jego lokalizacji podczas mitozy.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Dwuwymiarowe i trójwymiarowe obrazowanie żywych komórek w celu badania białek odpowiedzi na uszkodzenia DNA
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Pęknięcia obu nici (DSBs) są najbardziej szkodliwymi uszkodzeniami DNA, z jakimi może spotkać się komórka. Jeśli nie zostaną naprawione, DSBs niosą ze sobą ogromny potencjał do generowania mutacji i aberracji chromosomowych1. Aby zapobiec katalizowaniu niestabilności genomowej przez te uszkodzenia, kluczowe jest, aby komórki wykryły DSBs, aktywowały odpowiedź na uszkodzenia DNA (DDR) i naprawiły DNA. Po stymulacji DDR działa w celu zachowania integralności genomu, wywołując zatrzymanie cyklu komórkowego, aby umożliwić przeprowadzenie naprawy, lub wymuszając przejście komórki w apoptozę. Dominujące mechanizmy naprawy DSB zachodzą poprzez niehomologiczne łączenie końców (NHEJ) oraz naprawę poprzez rekombinację homologiczną (HRR) (przegląd w2). Istnieje wiele białek, których aktywność musi być precyzyjnie skoordynowana, aby DDR funkcjonował prawidłowo. W niniejszej pracy opisujemy metodę dwu- i trójwymiarowej (D) wizualizacji jednego z tych białek, 53BP1.
Białko wiążące p53 1 (53BP1) lokalizuje się w obszarach DSB poprzez wiązanie zmodyfikowanych histonów3,4, tworząc ogniska w ciągu 5-15 minut5. Przyjmuje się, że modyfikacje histonów oraz rekrutacja 53BP1 i innych białek DDR do miejsc DSB ułatwiają reorganizację strukturalną chromatyny wokół obszarów uszkodzeń i przyczyniają się do naprawy DNA6. Poza bezpośrednim udziałem w naprawie, opisano dodatkowe role 53BP1 w DDR, takie jak regulacja punktu kontrolnego wewnątrz fazy S, punktu kontrolnego G2/M oraz aktywacja białek DDR działających w dalszej kaskadzie7-9. Niedawno odkryto, że 53BP1 nie tworzy ognisk w odpowiedzi na uszkodzenia DNA indukowane podczas mitozy, lecz oczekuje na wejście komórek w fazę G1 przed lokalizacją w pobliżu DSB6. Stwierdzono, że białka DDR, takie jak 53BP1, łączą się ze strukturami mitotycznymi (takimi jak kinetochory) podczas postępu mitozy10.
W niniejszym protokole opisujemy zastosowanie obrazowania żywych komórek w 2D i 3D do wizualizacji tworzenia się ognisk 53BP1 w odpowiedzi na działanie czynnika uszkadzającego DNA, kamptotecyny (CPT), a także zachowania 53BP1 podczas mitozy. Kamptotecyna jest inhibitorem topoizomerazy I, który powoduje przede wszystkim powstawanie DSB podczas replikacji DNA. W tym celu wykorzystaliśmy wcześniej opisany konstrukt białka fuzyjnego 53BP1-mCherry, składający się z domeny białka 53BP1 zdolnej do wiązania się z DSB11. Dodatkowo zastosowaliśmy konstrukt białka fuzyjnego histony H2B-GFP, umożliwiający monitorowanie dynamiki chromatyny w całym cyklu komórkowym, a w szczególności podczas mitozy12. Wielowymiarowe obrazowanie żywych komórek jest doskonałym narzędziem pozwalającym pogłębić naszą wiedzę na temat funkcji białek DDR w komórkach eukariotycznych.
Protokół
A. Przygotowanie komórek
- Pierwotne ludzkie fibroblasty prawidłowe (GM02270) pozyskano z Coriell Cell Repository, Camden, New Jersey i unieśmiertelniono za pomocą hTERT 6. Komórki hodowano i namnażano w 6-cm szalkach CellStar w pożywce (4 ml) składającej się z MEM uzupełnionej o 20% płodowej surowicy bydlęcej (GIBCO), niezbędne/niezbędne aminokwasy, witaminy, pirogronian sodu oraz penicylinę/streptomycynę (HyClone).
- Komórki ludzkiej embrionalnej nerki 293 (HEK293) pozyskano z American Type Culture Collection i hodowano oraz namnażano w 6-cm szalkach CellStar. Komórki utrzymywano w pożywce (4 ml) składającej się z DMEM uzupełnionej o 10% płodowej surowicy bydlęcej, niezbędne aminokwasy, L-glutaminę oraz penicylinę/streptomycynę.
- Konstrukty genów fuzyjnych 53BP1-mCherry (N-Myc-53BP1 WT pLPC-Puro; plazmid Addgene 19836) i H2B-GFP (pCLNR-H2BG; plazmid Addgene 17735), wykazujące również ekspresję genów oporności na puromycynę lub G418 odpowiednio, wprowadzono do komórek poprzez transdukcję (fibroblasty) lub transfekcję (HEK293) przy użyciu SuperFect (Qiagene) i utrzymywano pod selekcją lekową. Okresowo sprawdzano utrzymywanie się fluorescencji.
- Na 24-48 h przed akwizycją obrazów komórki poddano trypsynizacji do zawiesiny pojedynczych komórek i wysiano w niskiej gęstości na szklane płytki FluroDish 3,5-cm.
B. Konfiguracja mikroskopu i akwizycja obrazów
Protokół ten opracowano przy użyciu konfokalnego mikroskopu z dyskiem wirującym Zeiss Cell Observer SD, wyposażonego w statyw AxioObserver Z1, dwukanałową jednostkę dysku wirującego Yokagawa CSU-X1A 5000, dwie kamery emCCD Photometrics QuantEM 512SC, iluminator światłowodowy HXP 120C, 4 lasery (wielolinijny laser argonowy Lasos 100mW [458, 488, 514 nm], diodę 50 mW 405 nm, diodę 40 mW 561 nm oraz diodę 30 mW 635 nm), AOTF, system inkubacji stołu Pecon XL multiS1, moduły inkubacyjne Zeiss (O2 Module S, CO2 Module S, TempModule S, Heating Unit XL S) oraz zmotoryzowany stół XY firmy Prior z wkładką piezoelektryczną NanoScanZ Z. Aby zminimalizować aberracje sferyczne podczas obrazowania żywych komórek w medium wodnym, zastosowano obiektyw C-Apochromat 63x/1.20 Water/Corr oraz ciecz imersyjną Zeiss Immersol W (o współczynniku refrakcji n = 1.334). Do dwukanałowego obrazowania konfokalnego użyto lustra dichroicznego RQFT 405/488/568/647 oraz filtrów emisyjnych BP525/50 (zielony) i BP629/62 (czerwony). Wykorzystano oprogramowanie systemowe Zeiss Axiovision (ver. 4.8.2.0) z modułami AV4 Multi-channel/Z/T, Fast Imaging, Physiology, MosaiX, Mark & Find, Dual Camera, Inside 4D, Autofocus oraz 3-D Deconvolution.
- Upewnij się, że CO2 gaz dopływa do CO2 Moduł systemu inkubacyjnego. Jeśli mikroskop jest wsparty na antywibracyjnym stole pneumatycznym, włącz dopływ powietrza (lub N2 gaz) do stołu pneumatycznego.
- Włącz zasilanie statywu mikroskopu, jednostki dysku obrotowego, kamer, modułów inkubacyjnych, iluminatora HXP, zmotoryzowanego stolika, lasera argonowego oraz komputera.
- Po 1 minucie czasu rozgrzewania przekręć klucz zapłonu lasera argonowego do pozycji „On”.
- Na panelu sterowania laserem Zeiss włącz przełączniki odpowiadające liniom laserowym, które będą wykorzystywane.
- Przełącz przełącznik kontrolera lasera argonowego Lasos z pozycji „standby” na „laser run” i dostosuj kontroler światła do optymalnego poziomu (t. j. tuż poniżej punktu, w którym zielony wskaźnik zmienia kolor na czerwony).
- Uruchom oprogramowanie AxioVision. Uwagainterfejs użytkownika programu AxioVision może być dostosowany do konkretnego mikroskopu oraz sterowanych przez niego komponentów poprzez konfigurację okien i menu rozwijanych. W związku z tym każdy system może posiadać unikalny interfejs. Dlatego w kolejnych krokach przedstawiono ogólne instrukcje obsługi oprogramowania, zamiast wskazówek dotyczących konkretnych okien, kart i/lub menu rozwijanych.
- Na około 1 godzinę przed obrazowaniem w oprogramowaniu zlokalizuj sterowniki inkubatora i włącz ogrzewanie górnej komory oraz płytki stolika. Ustaw temperaturę na 37 °CWłącz CO2 kontrolować i ustawić poziom na 5%.
- Wybierz obiektyw do obrazowania. W niniejszym badaniu zastosowano obiektyw C-Apochromat Water/Corr o powiększeniu 63x i aperturze numerycznej (N.A.) 1,20. UwagaDo tej soczewki wymagane jest zastosowanie medium imersyjnego o współczynniku załamania zbliżonym do wody (płyn imersyjny Zeiss Immersol W).
- Jeśli w dłuższym odstępie czasu planowane jest pobranie próbek z wielu oddzielnych pozycji, należy upewnić się, że zastosowano wystarczającą ilość medium imersyjnego, aby zapewnić jego przeniesienie z jednej pozycji do drugiej.
- Umieść szalkę na stoliku i podnieś obiektyw tak, aby stykał się z jej dnem.
- Za pomocą elementów sterujących mikroskopu lub oprogramowania skieruj emitowane światło do okularów i wybierz odpowiedni zestaw filtrów do szerokiego pola dla interesującego sygnału fluorescencyjnego (w niniejszym badaniu zestaw filtrów „Red” dla 53BP1 oraz zestaw filtrów „GFP” dla H2B).
- Patrząc przez okulary, ustaw ostrość obrazu i zlokalizuj odpowiednie pole z komórkami.
- Za pomocą oprogramowania lub sterowników mikroskopu skieruj emitowane światło z okularów do portu z jednostką konfokalnego dysku obrotowego.
- W oprogramowaniu włącz odpowiedni laser (w przypadku niniejszego badania laser 561 nm dla 53BP1 oraz linię 488 nm lasera argonowego dla H2B).
- Dla każdego kanału należy dostosować intensywność lasera, ustawiając sterownik akustooptycznego filtra przestrajalnego (AOTF) na odpowiedni poziom.
- Wybierz odpowiednie lustro dichroiczne (RQFT 405/488/568/647) oraz filtry emisyjne (BP 629/62 dla 53BP1 i BP 525/50 dla H2B). Otwórz migawkę jednostki tarczy rotacyjnej.
- Wybierz okno „Live”, aby wyświetlić aktualne pole widzenia.
- W oprogramowaniu otwórz panel sterowania „Camera”, wybierz kamerę, której chcesz użyć (w przypadku systemu z dwiema kamerami) i ustaw czas ekspozycji na około 100 ms. Dostosuj wzmocnienie % oraz wzmocnienie EM w razie potrzeby. Uwaga: Konstrukt 53BP1-mCherry wydaje się być dość słabo widoczny. Pomocne okazało się zwiększenie wzmocnienia EM.
- W oprogramowaniu otwórz panel sterowania jednostką konfokalnego dysku obrotowego i dostosuj prędkość obrotu dysku, wpisując czas naświetlania kamery, który został ustawiony w celu uzyskania odpowiedniego obrazu (np. ~100 ms). Kliknij „Set”, aby zatwierdzić zmianę.
- Otwórz „multi-dimensional acquisition”. Wybierz kartę kanałów i wczytaj lub wybierz odpowiednie kanały. W niniejszym badaniu stosujemy kanały zdefiniowane dla dsRed (pobudzenie laserem 561 nm i filtr BP 629/62 dla emisji) oraz GFP (linia lasera 488 nm dla pobudzenia i filtr BP525/50 dla emisji).
- Aby zapewnić rejestrację obrazu, dla obu kanałów zastosowano wspólne lustro dichroiczne (RQFT 405/488/568/647). W oprogramowaniu należy ustawić funkcję „Autofocus”. UwagaPrzejdź do Tools $\rightarrow$ Settings editor, aby dostosować ustawienia MDA. Upewnij się, że ustawiono odpowiednią moc lasera („Odpowiednia moc lasera” odnosi się do ustawienia, które umożliwia wzbudzenie właściwego fluoroforu przy jednoczesnym zminimalizowaniu fotobleachingu).
- W oknie MDA wybierz kartę z-stack. Wybierz opcję „Z-stack at current focus position”. Ustaw zakres dla ~10 μm wykonać stos z-stack i wybrać opcję „optimal” dla liczby kroków, aby zapewnić próbkowanie Nyquista w osi Z. Uwaga: Dokładny rozmiar stosu z (z-stack) będzie zależał od wysokości komórek. Należy go odpowiednio dostosować.
- 23. Kliknij „Start” i przeanalizuj otrzymany obraz z-stack, aby upewnić się, że ustawienia są odpowiednie dla badanego zagadnienia (np. w niniejszym badaniu istotne było obrazowanie całego jądra).
- Wybierz zakładkę „T” (czas). W naszym eksperymencie z kamptotecyną ustawiliśmy odstęp między punktami czasowymi obrazowania na 5 min, a całkowity czas trwania sesji na 1 h dla filmu kontrolnego (komórki niepoddane działaniu substancji). Uwaga: Aby zminimalizować fotoblaknięcie komórek, eksperyment należy skonfigurować w taki sposób, aby AOTF blokował laser pomiędzy punktami czasowymi obrazowania.
- W celu obrazowania wielopunktowego kilku komórek w naczyniu, w oknie MDA wybierz kartę position. Upewnij się, że zaznaczono opcję „Apply 'setting before/after time point' per position”. Wybierz „Mark_Find”. Korzystając z widoku „Live”, przesuń naczynie i wybierz odpowiednie pola widzenia.
- Kliknij „Start” w menu wielowymiarowego pozyskiwania danych (multi-dimensional-acquisition), aby rozpocząć eksperyment i zarejestrować film kontrolny (niepoddanych działaniu czynnika komórek).
- Po nagraniu kontrolnym należy dodać odpowiedni preparat (w tym przypadku, 10 μM kamptotecynę). Nagrania wideo z grupy eksperymentalnej (komórki traktowane lekiem) rejestrowano w odstępach 5–10 min przez okres od 2 do 4 h. Uwaga: Ważną kwestią, którą należy wziąć pod uwagę, jest szybkość, z jaką dany efekt występuje po zastosowaniu preparatu. Jak pokazano na filmie, ogniska 53BP1 zaczynają tworzyć się około 5 min po dodaniu CPT. Choć dodawanie leku do szalki ręcznie i ponowna kalibracja mikroskopu są procesami stosunkowo prostymi, zajmują one pewną ilość czasu. Należy uwzględnić ten fakt podczas projektowania eksperymentów.
- W celu monitorowania mitozy ustawiliśmy interwał na 7,5 min i prowadziliśmy rejestrację przez 4–5 h (konkretne ustawienia zależą od użytej linii komórkowej i długości jej cyklu komórkowego). W przypadku dłuższych pomiarów może być konieczne wprowadzenie korekt, aby zapobiec fotobieleniu.
C. Przetwarzanie i analiza obrazu
Protokół ten został opracowany przy użyciu oprogramowania Volocity (PerkinElmer). Oprogramowanie wykorzystane do pozyskania tych danych (AxioVision) posiada również funkcję przetwarzania i analizy obrazów. Zachęca się użytkowników do korzystania z dostępnego im oprogramowania oraz zapoznania się z odpowiednią literaturą dotyczącą jego zastosowania.
- Uruchom oprogramowanie Volocity. Utwórz i nazwij nową bibliotekę, a następnie zaimportuj pliki wideo.
- Do przeglądania plików najczęściej najkorzystniej jest używać ustawienia „Extended Focus”. Pozwala ono na nałożenie na siebie przekrojów stosu z (z-stack), co w przypadku niniejszego protokołu umożliwia wizualizację ognisk 53BP1 w różnych obszarach jądra.
- Dostosuj filmy w razie potrzeby. Program Volocity jest wyposażony w szereg narzędzi służących do poprawy jakości uzyskanych obrazów. Odpowiednie ustawienie mikroskopu pozwala zaoszczędzić czas podczas późniejszej edycji. Często pomocne jest odszumianie obrazu (dekonwolucja) oraz regulacja jasności i kontrastu. Konkretne potrzeby edycyjne będą różnić się w zależności od eksperymentu.
- Dodaj względny znacznik czasu oraz pasek skali.
- Aby wyświetlić komórki w 3D, przełącz się na ustawienie „3-D Opacity”. Pozwala to na obracanie renderowanych w 3D komórek w przestrzeni, zapewniając tym samym wiele perspektyw oglądu interesujących struktur wewnątrz komórek. Uwaga: Pomocna jest wizualizacja komórek w różnych płaszczyznach, aby określić kierunek przemieszczania się badanych struktur. Na przykład w ustawieniu „Extended Focus” trudno dostrzec, że 53BP1 rzeczywiście dyssocjuje z DNA podczas mitozy, podczas gdy w 3D jest to łatwo zauważalne.
- Filmy i obrazy statyczne można eksportować do różnych typów plików, zależnie od preferencji użytkownika.
D. Reprezentatywne wyniki
Przykład tworzenia się ognisk 53BP1 w odpowiedzi na CPT przedstawiono na Rysunku 1. Komórki poddane działaniu CPT tworzą ogniska w ciągu 5-10 min i utrzymują je przez cały czas rejestracji. Jak pokazano na Rysunku 2, 53BP1 dysocjuje z chromatyny na początku mitozy, tworząc cienką mgiełkę wokół kondensujących się chromosomów. Wraz z nastąpieniem telofazy i zakończeniem mitozy, 53BP1 ponownie agreguje w wyraźne ogniska. Choć komórki HEK293 nie były eksponowane na CPT, mimo to tworzyły liczne, spontaniczne ogniska naprawcze 53BP1 powstałe w wyniku endogennych uszkodzeń DNA. Obserwacja ta pozwoliła nam wyciągnąć wniosek, że 53BP1 nie tworzy ognisk we wczesnej fazie mitozy, co jest zgodne z wcześniejszym doniesieniem wykazującym podobny efekt po narażeniu komórek na promieniowanie jonizujące i leki radiomimetyczne 5.
Rycina 1. Kamptotecyna (10 μM) indukuje pęknięcia dwuniciowe (DSBs) oraz tworzenie się ognisk 53BP1 w cyklujących fibroblastach w ciągu 30 min od dodania leku do medium.
Rycina 2. Białko 53BP1 nie tworzy ognisk podczas mitozy aż do telofazy/G1 w komórkach HEK293.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Utrzymanie integralności genomu jest kluczowe dla przeżycia komórek. Brak ochrony genomu prowadzi do przedwczesnego starzenia się, kancerogenezy lub śmierci 8. Istnieje duże zainteresowanie poznaniem mechanizmów funkcjonowania DDR, co wynika z jego znaczenia zarówno dla badań podstawowych, jak i klinicznych. Na przestrzeni lat opracowano wiele technik wspomagających badanie sposobów, w jakie komórki wykrywają i naprawiają uszkodzenia DNA. Tradycyjne metody, takie jak immunocytochemia i western blotting, stanow...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Nie zadeklarowano żadnych konfliktów interesów.
Podziękowania
Wspierane częściowo przez granty R01NS064593 i R21ES016636 (K.V.). Mikroskopia została przeprowadzona w VCU - Department of Neurobiology & Anatomy Microscopy Facility, wspieranej częściowo z funduszy z grantu rdzeniowego NIH-NINDS 5P30NS047463. Konfokalny mikroskop z wirującym dyskiem został zakupiony dzięki dotacji NIH-NCRR (1S10RR027957).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| szalki hodowlane CellStar | Greiner Bio-One | ||
| szalki z przeszklonym dnem FluroDish | World Precision Instruments, Inc. | ||
| pożywka MEM | GIBCO | ||
| Aminokwasy nieessentialne | GIBCO | ||
| Aminokwasy | GIBCO | ||
| Witaminy | GIBCO | ||
| pirowinian sodu | Invitrogen | ||
| Penicylina/Streptomycyna | HyClone | ||
| płodowa surowica bydlęca | GIBCO | ||
| N-Myc-53BP1 WT pLPC-Puro; plazmid 19836 | Addgene | ||
| pCLNR-H2BG; plazmid 17735 | Addgene | ||
| SuperFect | Qiagen | ||
| System obrazowania Zeiss Cell Observer SD | Zeiss | ||
| AxioVision (wersja 4.8.2) | Zeiss | ||
| Olej immersyjny Zeiss Immersol W | Zeiss | ||
| oprogramowanie Volocity (wersja 6.0) | PerkinElmer |
Bibliografia
- Botuyan, M. V., Lee, J., Ward, I. M., Kim, J. E., Thompson, J. R., Chen, J., Mer, G. Structural basis for the methylation state-specific recognition of histone H4-K20 by 53BP1 and Crb2 in DNA repair. Cell. 127, 1361-1373 (2006).
- Dimitrova, N., Chen, Y. C., Spector, D. L., de Lange, T. 53BP1 promotes non-homologous end joining of telomeres by increasing chromatin mobility. Nature. 456, 524-528 (2008).
- Feuerhahn, S., Egly, J. M. Tools to study DNA repair: what's in the box. Trends Genet. 24, 467-474 (2008).
- Giunta, S., Belotserkovskaya, R., Jackson, S. P. DNA damage signaling in response to double-strand breaks during mitosis. J. Cell Biol. 190, 197-207 (2010).
- Giunta, S., Jackson, S. P. Give me a break, but not in mitosis: the mitotic DNA damage response marks DNA double-strand breaks with early signaling events. Cell Cycle. 10, 1215-1221 (2011).
- Golding, S. E., Morgan, R. N., Adams, B. R., Hawkins, A. J., Povirk, L. F., Valerie, K. Pro-survival AKT and ERK signaling from EGFR and mutant EGFRvIII enhances DNA double-strand break repair in human glioma cells. Cancer Biol. Ther. 8, 730-738 (2009).
- Huyen, Y., Zgheib, O., Ditullio, R. A., Gorgoulis, V. G., Zacharatos, P., Petty, T. J., Sheston, E. A., Mellert, H. S., Stavridi, E. S., Halazonetis, T. D. Methylated lysine 79 of histone H3 targets 53BP1 to DNA double-strand breaks. Nature. 432, 406-411 (2004).
- Jackson, S. P., Bartek, J. The DNA-damage response in human biology and disease. Nature. 461, 1071-1078 (2009).
- Kanda, T., Sullivan, K. F., Wahl, G. M. Histone-GFP fusion protein enables sensitive analysis of chromosome dynamics in living mammalian cells. Curr. Biol. 8, 377-385 (1998).
- Massignani, M., Canton, I., Sun, T., Hearnden, V., Macneil, S., Blanazs, A., Armes, S. P., Lewis, A., Battaglia, G. Enhanced fluorescence imaging of live cells by effective cytosolic delivery of probes. PLoS One. 5, e10459(2010).
- Nakamura, K., Sakai, W., Kawamoto, T., Bree, R. T., Lowndes, N. F., Takeda, S., Taniguchi, Y. Genetic dissection of vertebrate 53BP1: a major role in non-homologous end joining of DNA double strand breaks. DNA Repair (Amst). 5, 741-749 (2006).
- Schultz, L. B., Chehab, N. H., Malikzay, A., Halazonetis, T. D. p53 binding protein 1 (53BP1) is an early participant in the cellular response to DNA double-strand breaks. J. Cell. Biol. 151, 1381-1390 (2000).
- Valerie, K., Povirk, L. F. Regulation and mechanisms of mammalian double-strand break repair. Oncogene. 22, 5792-5812 (2003).
- Wang, B., Matsuoka, S., Carpenter, P. B., Elledge, S. J. 53BP1, a mediator of the DNA damage checkpoint. Science. 298, 1435-1438 (2002).
- Ward, I. M., Minn, K., Jorda, K. G., Chen, J. Accumulation of checkpoint protein 53BP1 at DNA breaks involves its binding to phosphorylated histone H2AX. J. Biol. Chem. 278, 19579-19582 (2003).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
