Opisano metodę śledzenia neuronów połączonych synaptycznie. Wykorzystujemy specyficzność TVA w komórce upstream, aby zbadać, czy interesująca nas populacja komórek otrzymuje sygnały synaptyczne od genetycznie zdefiniowanych typów komórek.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Wirusowe śledzenie genetycznie zdefiniowanych obwodów neuronalnych
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Klasyczne metody badania obwodów neuronalnych charakteryzują się dość niską wydajnością. W badaniach nad obwodami coraz popularniejsze stają się wirusy transsynaptyczne, w szczególności wirus rzekomej wścieklizny (PRV) i wirus wścieklizny (RABV), a ostatnio także wirus zapalenia jamy ustnej (VSV). Te metody o wyższej wydajności wykorzystują wirusy, które przenoszą się między neuronami w kierunku anterogradowym lub retrogradowym.
Niedawno opracowano zmodyfikowany wirus RABV do monosynaptycznego śledzenia retrogradnego (Rysunek 1A). W tej metodzie gen glikoproteiny (G) zostaje usunięty z genomu wirusa i dostarczony ponownie wyłącznie do wybranych neuronów. Specyficzność infekcji osiąga się poprzez zastąpienie prawidłowej RABV-G chimeryczną białkiem G, składającym się z domeny zewnątrzkomórkowej glikoproteiny ASLV-A i domeny cytoplazmatycznej RABV-G (A/RG)1. Ta chimeryczna G specyficznie infekuje komórki wykazujące ekspresję receptora TVA1. Gen kodujący TVA może być dostarczany różnymi metodami2-8. Po infekcji neuronu wykazującego ekspresję TVA przez RABV-G, wirus RABV może przenosić się do innych, połączonych synaptycznie neuronów w kierunku retrogradnym dzięki własnej glikoproteinie G, która została dostarczona wraz z receptorem TVA. Technika ta pozwala na znakowanie stosunkowo dużej liczby wejść (5-10%)2 do określonego typu komórek, zapewniając próbkowanie wszystkich wejść do zdefiniowanego typu komórki startowej.
Niedawno zmodyfikowaliśmy tę technikę, aby wykorzystać VSV jako znacznik transsynaptyczny9. VSV oferuje kilka zalet, w tym szybkość ekspresji genów. W niniejszej pracy szczegółowo opisujemy nowy system śledzenia wirusowego z użyciem VSV, przydatny do badania mikroobwodów z zwiększoną rozdzielczością. Podczas gdy pierwotne strategie opublikowane przez Wickershama et al.4 oraz Beiera et al.9 umożliwiają znakowanie wszelkich neuronów, które rzutują na pierwotnie zainfekowane komórki wykazujące ekspresję TVA, w tym przypadku VSV został zaprojektowany tak, aby przenosić się wyłącznie do komórek wykazujących ekspresję TVA (Rycina 1B). Wirus jest najpierw pseudotypowany białkiem RABV-G, aby umożliwić infekcję neuronów znajdujących się poniżej neuronów wykazujących ekspresję TVA. Po zainfekowaniu tej pierwszej populacji komórek, uwalniany wirus może infekować wyłącznie komórki wykazujące ekspresję TVA. Ponieważ transsynaptyczne rozprzestrzenianie się wirusa jest ograniczone do komórek wykazujących ekspresję TVA, obecność lub brak połączeń z określonymi typami komórek może być badana z wysoką rozdzielczością. Schemat blokowy tych eksperymentów przedstawiono na Rycynie 2. Przedstawiamy tutaj model obwodu – obwód selektywności kierunkowej w siatkówce myszy. Badamy połączenia komórek amacrynych typu starburst (SAC) z komórkami zwojowymi siatkówki (RGC).
Protokół
1. Wytwarzanie wirusa z cDNA: Odzyskiwanie VSV z cDNA przy użyciu systemu Vaccinia-T710
- Na jeden dzień przed eksperymentem przenieść komórki BsrT7 do szalki 60 mm zawierającej DMEM + 10% FBS. Wysiać 2E6 komórek na szalkę. Komórki BsrT7 są pochodną komórek BHK21, czyli komórek nerki młodego chomika.
- Podgrzać bufor PBS z dodatkiem 1 mM magnezu i 1 mM wapnia do 37 °C.
- Pobrać niewielką alikwot vTF7-3, wirusa vaccinia wykazującego ekspresję polimerazy T7, i rozmrozić do temperatury pokojowej. vTF7-3 jest zakaźnym wirusem vaccinia wykazującym ekspresję polimerazy T7.11or należy stosować wyłącznie w warunkach poziomu bezp....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Wykorzystanie wirusów do badania obwodów neuronalnych jest stosunkowo wydajną metodą analizy połączonych neuronów. Jednak generowanie wirionów zarówno VSV, jak i RABV nie jest zadaniem trywialnym. Mimo przedstawionego powyżej protokołu odzyskiwania wirusa z cDNA, jest to wciąż zdarzenie o niskim prawdopodobieństwie. Poziomy każdego z plazmidów N, P i L muszą być precyzyjnie dostosowane, a w celu zapewnienia odzyskania wirusa konieczne jest przeprowadzenie wielu prób i powtórzeń. Formowanie cząsteczki rybonukleoproteinowe.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Nie zgłoszono żadnych konfliktów interesów.
Podziękowania
Chcielibyśmy podziękować Seanowi Whelanowi za pomoc w odzyskiwaniu rekombinowanych wariantów VSV, a Didem Goz i Ryanowi Chrenekowi za pomoc techniczną. Praca ta była wspierana przez HHMI (CLC) oraz grant nr #NS068012-01 (KTB).
....Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Hodowla tkanek | |||
| komórki nerki chomika (BSRT7) | dostępne na zapytanie | ||
| vaccinia (vTF7-3) | dostępne na zapytanie | ||
| plazmidy pN, pP, pl | dostępne na zapytanie | ||
| chlorek wapnia | Sigma | C1016 | |
| chlorek magnezu | Sigma | M8266 | |
| komórki HEK 293T | Open Biosystems | HCL4517 | |
| 60 mm szalka hodowlana traktowana TC | Corning | 430166 | |
| 75 cm2 prostokątna kolba do hodowli komórkowej z ukośnym szyjką i nakrętką z filtrem | Corning | 430641 | |
| Pożywka : DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium) | Invitrogen | 12491-015 | |
| 1 M HEPES pH 7.4 | Gibo | 15630-080 | |
| FBS: płodowa surowica bydlęca | Gibco | 10437-028 | |
| PKS | Invitrogen | 15140-163 | |
| odczynnik do transfekcji Lipofectamine 2,000 | Invitrogen | 11668-019 | |
| strzykawka: strzykawka 5 ml Luer-Lock | Sigma | Z248010-1PAK | |
| filtry strzykawkowe | Nalgene | 190-2520 | |
| PEI: wysokopotencjalny liniowy PEI | Polysciences | 23966 | |
| Wirowanie wirusów | |||
| system filtracji próżniowej na górze probówki Corning 150 ml, pory 0,45 μm | Corning | 430314 | |
| cienkościenne, ultra-przejrzyste probówki do ultrawirowania 38,5 ml, 25 x 89 mm | Beckman-Coulter | 344058 | |
| ultrawirowarka | Beckman-Coulter | optima XL-80K | |
| rotor do ultrawirowarki SW28 | Beckman-Coulter | 342207 | |
| Iniekcje u myszy | |||
| kapilarne mikropipety | Drummond | 5-000-2005 | |
| stereotaks | Narishige | SR-5M | |
| mikromanipulator | Narishige | SM-15 | |
| injektor Ump | World Precision Instruments | Sys-Micro4 | |
| czterokanałowy mikrokontroler | World Precision Instruments | UMP3 | |
| silnik warsztatowy M.TXB z pokrętłem sterującym C.EMX-1, 115 V | Foredom | M.TXB-EM | |
| szybkozmienny uchwyt H.10 | Foredom | H.10 | |
| wiertło stopniowe, 0,5 mm | Foredom | A-58005P | |
| uchwyt mikr–elektrody | World Precision Instruments | MEH2S | |
| ketamina | Henry Schein | 995-2949 | |
| ksylazyna | Henry Schein | 4015809TV | |
| buprenorfina | Henry Schein | 1118217 | |
| strzykawka 1 ml | Becton-Dickinson | 309628 | |
| igła do iniekcji G 30 | Becton-Dickinson | 305106 | |
| ochronna maść okulistyczna | Doctors Foster and Smith | 9N-014748 | |
| etanol | Sigma | 493511 | |
| jod | Sigma | PVP1 | |
| Narzędzia chirurgiczne i do sekcji | |||
| nożyczki | Fine Science Tools | 91402-12 | |
| pinceta standardowa | Fine Science Tools | 11000-12 | |
| pinceta precyzyjna | Fine Science Tools | 11255-20 | |
| sprężynowe nożyczki Vannasa | Fine Science Tools | 15000-00 | |
| rękojeść skalpela | Fine Science Tools | 10003-12 | |
| ostrza skalpela | Fine Science Tools | 10015-00 | |
| szwy | Robbins Instruments | 20.SK640 | |
| Sekcja i barwienie przeciwciałami | |||
| paraformaldehyd | Sigma | P6148 | |
| bufor fosforanowy (PBS) | Sigma | P4417 | |
| Triton X-100 | Sigma | T9284 | |
| surowica osła | Jackson Immunoresearch | 017-000-121 | |
| Przeciwciała | |||
| przeciwciała | millipore | AB144P | |
| anty-gfp | Abcam | ab13970 | |
| przeciwciała osie anty-kurczak Dylight 488 | Jackson immunoresearch | 703-545-155 | |
| przeciwciała osie anty-kurczak Alexa Fluor 647 | Jackson immunoresearch | 705-605-147 | |
| DAPI | Invitrogen | D1306 | |
| Montowanie tkanek | |||
| szkiełka mikroskopowe Superfrost plus | Fisher | 12-550-100 | |
| szkiełka zakrywkowe 22 x 22, grubość 0 | Electron Microscopy Sciences | 72198-10 | |
| elastomer silikonowy | Rogers Corp | HT-6220 | |
| przezroczysty lakier do paznokci | Electron Microscopy Sciences | 72180 | |
| odczynnik antyblaknący Prolong Gold | Invitrogen | P36930 | |
|
Bibliografia
- Wickersham, I. R. Monosynaptic restriction of transsynaptic tracing from single, genetically targeted neurons. Neuron. 53, 639-647 (2007).
- Marshel, J. H., Mori, T., Nielsen, K. J., Callaway, E. M. Targeting single neuronal networks for gene expression and ....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
