Opisano metodę śledzenia neuronów połączonych synaptycznie. Wykorzystujemy specyficzność TVA w komórce upstream, aby zbadać, czy interesująca nas populacja komórek otrzymuje sygnały synaptyczne od genetycznie zdefiniowanych typów komórek.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Wirusowe śledzenie genetycznie zdefiniowanych obwodów neuronalnych
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Klasyczne metody badania obwodów neuronalnych charakteryzują się dość niską wydajnością. W badaniach nad obwodami coraz popularniejsze stają się wirusy transsynaptyczne, w szczególności wirus rzekomej wścieklizny (PRV) i wirus wścieklizny (RABV), a ostatnio także wirus zapalenia jamy ustnej (VSV). Te metody o wyższej wydajności wykorzystują wirusy, które przenoszą się między neuronami w kierunku anterogradowym lub retrogradowym.
Niedawno opracowano zmodyfikowany wirus RABV do monosynaptycznego śledzenia retrogradnego (Rysunek 1A). W tej metodzie gen glikoproteiny (G) zostaje usunięty z genomu wirusa i dostarczony ponownie wyłącznie do wybranych neuronów. Specyficzność infekcji osiąga się poprzez zastąpienie prawidłowej RABV-G chimeryczną białkiem G, składającym się z domeny zewnątrzkomórkowej glikoproteiny ASLV-A i domeny cytoplazmatycznej RABV-G (A/RG)1. Ta chimeryczna G specyficznie infekuje komórki wykazujące ekspresję receptora TVA1. Gen kodujący TVA może być dostarczany różnymi metodami2-8. Po infekcji neuronu wykazującego ekspresję TVA przez RABV-G, wirus RABV może przenosić się do innych, połączonych synaptycznie neuronów w kierunku retrogradnym dzięki własnej glikoproteinie G, która została dostarczona wraz z receptorem TVA. Technika ta pozwala na znakowanie stosunkowo dużej liczby wejść (5-10%)2 do określonego typu komórek, zapewniając próbkowanie wszystkich wejść do zdefiniowanego typu komórki startowej.
Niedawno zmodyfikowaliśmy tę technikę, aby wykorzystać VSV jako znacznik transsynaptyczny9. VSV oferuje kilka zalet, w tym szybkość ekspresji genów. W niniejszej pracy szczegółowo opisujemy nowy system śledzenia wirusowego z użyciem VSV, przydatny do badania mikroobwodów z zwiększoną rozdzielczością. Podczas gdy pierwotne strategie opublikowane przez Wickershama et al.4 oraz Beiera et al.9 umożliwiają znakowanie wszelkich neuronów, które rzutują na pierwotnie zainfekowane komórki wykazujące ekspresję TVA, w tym przypadku VSV został zaprojektowany tak, aby przenosić się wyłącznie do komórek wykazujących ekspresję TVA (Rycina 1B). Wirus jest najpierw pseudotypowany białkiem RABV-G, aby umożliwić infekcję neuronów znajdujących się poniżej neuronów wykazujących ekspresję TVA. Po zainfekowaniu tej pierwszej populacji komórek, uwalniany wirus może infekować wyłącznie komórki wykazujące ekspresję TVA. Ponieważ transsynaptyczne rozprzestrzenianie się wirusa jest ograniczone do komórek wykazujących ekspresję TVA, obecność lub brak połączeń z określonymi typami komórek może być badana z wysoką rozdzielczością. Schemat blokowy tych eksperymentów przedstawiono na Rycynie 2. Przedstawiamy tutaj model obwodu – obwód selektywności kierunkowej w siatkówce myszy. Badamy połączenia komórek amacrynych typu starburst (SAC) z komórkami zwojowymi siatkówki (RGC).
Protokół
1. Wytwarzanie wirusa z cDNA: Odzyskiwanie VSV z cDNA przy użyciu systemu Vaccinia-T710
- Na jeden dzień przed eksperymentem przenieść komórki BsrT7 do szalki 60 mm zawierającej DMEM + 10% FBS. Wysiać 2E6 komórek na szalkę. Komórki BsrT7 są pochodną komórek BHK21, czyli komórek nerki młodego chomika.
- Podgrzać bufor PBS z dodatkiem 1 mM magnezu i 1 mM wapnia do 37 °C.
- Pobrać niewielką alikwot vTF7-3, wirusa vaccinia wykazującego ekspresję polimerazy T7, i rozmrozić do temperatury pokojowej. vTF7-3 jest zakaźnym wirusem vaccinia wykazującym ekspresję polimerazy T7.11or należy stosować wyłącznie w warunkach poziomu bezpieczeństwa biologicznego 2 (BSL-2). System ekspresyjny ten służy do generowania maksymalnych poziomów pożądanych transkryptów z plazmidów transfekowanych w kroku 1.9. Wirus mieszać w wstrząsarku wortex przez 30 s z maksymalną prędkością. Poddać sonikacji w sonikatorze stołowemu przez 2 min w kąpieli wodnej w temperaturze pokojowej. Ponownie mieszać w wstrząsarku wortex przez 30 s w celu rozbicia agregatów wirusowych.
- Usunąć pożywkę z komórek BSRT7.
- Dodaj 11.7 μl vTF7-3 do 600 μl PBS z dodatkiem magnezu i wapnia, a następnie naniesienie mieszaniny na komórki.
- Przenieść płytki do 34 °C inkubator z 5% CO22Delikatnie kołysz płytkami raz na 10 min.
- Po upływie 45 min rozpocząć transfekcję. Dodać 20 μl lipofectamine 2 000 na 1 ml DMEM i wymieszać. Odczekać 5 min.
- Dodaj 5.25 μg pN, 2.3 μg pP, 1.2 μg Proszę o przesłanie tekstu źródłowego do tłumaczenia. 1 μg pCAG RABV-G oraz 6 μg cDNA genomowego VSV do 500 μl DMEM. pN, pP i pl to plazmidy sterujące ekspresją genów wirusowych VSV pod promotorem T710, przy czym ilości określono empirycznie w celu optymalnego odzyskania wirusa.
- Połączyć zawartość obu probówek i wymieszać. Odstawić na 15 min w temperaturze pokojowej.
- Usunąć PBS i jednokrotnie wypłukać płytki 1,5 ml DMEM.
- Odssać medium płuczące. Dodać mieszaninę do transfekcji na płytkę. Przenieść płytki do 34 °C inkubator
- Odczekać 5 h, a następnie usunąć medium.
- Wymień pożywkę na 4 ml DMEM + 2% FBS + 1x penicylina-streptomycyna + 10 mM HEPES pH 7,4. Bardzo ważne jest dodanie penicyliny-streptomycyny w celu zapobiegania kontaminacji oraz HEPES w celu utrzymania pH pożywki. Zawartość FBS można zmniejszyć do 2%, ponieważ komórki zostaną zniszczone przez wirusa w ciągu kilku dni i nie wymagają zatem 10% FBS.
- Umieść płytki w 34 °C inkubator przez 48–72 h.
- Należy pobrać pożywkę w 3. i 6. dobie po transfekcji i natychmiast przefiltrować ją za pomocą strzykawki przez 0.20 μm filtr. Filtr o tej wielkości usuwa wirusa vaccinia, ale nie usuwa VSV.
- Ponieważ chcemy dostarczyć białko RABV-G do otoczki wirusa, a genom nie koduje genu RABV-G, musi być ono dostarczane w sposób ciągły w tłumaczeniuAby to zrobić, należy przygotować oddzielną płytkę z komórkami 293T TVA800 (TVA800). Są to komórki konstytutywnie eksprimujące receptor TVA, co umożliwia infekcję wirusową za pośrednictwem EnvA.12Przy 80% konfluencji wymienić medium na sam DMEM, a następnie przeprowadzić transfekcję komórek za pomocą 5 μg plazmidu kodującego białko G (t. j. pCAG RABV-G) na płytkę. Stosujemy odczynik do transfekcji PEI, polikationowy polimer, który jest znacznie tańszy niż porównywalne metody oparte na lipidach. Jednakże do tego celu można skutecznie wykorzystać również lipofektaminę. Optymalny stosunek PEI : DNA musi zostać określony empirycznie. Należy to zrobić w osobnym doświadczeniu z użyciem reportera fluorescencyjnego, t. j. pCAG GFP. Stosujemy 10 μl PEI: 4 μg Kwas dezoksyrybonukleinowy (DNA).
- Nanieś nadsącz z etapu 16 na płytkę z transfektowanymi komórkami TVA800.
- Następnego dnia należy sprawdzić tę płytkę pod kątem fluorescencji fluoroforu ekspresowanego przez wirusa. Fluorescencję wirusową obserwuje się najpierw w pojedynczej komórce, a z czasem stopniowo rozprzestrzenia się ona na kolejne komórki (t. j. Rycina 3). Wirus powinien rozprzestrzenić się w ciągu kilku godzin.
2. Pasażowanie i zagęszczanie VSV
- Rozdziel komórki TVA800 do pożywki zawierającej DMEM + 10% FBS w taki sposób, aby następnego dnia uzyskać cztery płytki 10-cm przy konfluencji ok. 80%. Komórki pochodne z linii 293T sprawdzają się dobrze ze względu na ich wysoką podatność na transfekcję, a zastosowanie komórek wykazujących ekspresję TVA zwiększa szybkość infekcji komórek w naczyniu. Inne linie komórkowe o wysokiej podatności na transfekcję również mogą posłużyć do tego celu.
- Przy konfluencji 80% zmienić pożywkę na sam DMEM, a następnie transfektować komórki 5 μg plazmidu kodującego białko G, którego chcesz użyć (np. pCAG RABV-G) na płytkę. Stosujemy PEI, ale FUGENE/Lipofectamine również działają.
- Odczekać jeden dzień po transfekcji do czasu ekspresji i akumulacji glikoproteiny na powierzchni. Zmienić pożywkę (5 ml/płytka) na DMEM + 10% FBS, a następnie zainfekować wirusem rVSV(A/RG) przy wielokrotności zakażenia (MOI) w zakresie 0,01 < x < 0,1.
- Sprawdzić stopień infekcji po 24 h. Powinny być widoczne zainfekowane komórki (zidentyfikowane dzięki fluorescencji GFP), niektóre z nich z otaczającymi je skupiskami zainfekowanych komórek (np. Rysunek 3). Zazwyczaj warto zbierać naddatek tylko wtedy, gdy zainfekowanych jest >50% komórek; w przeciwnym razie miana wirusa uzyskane po koncentracji będą suboptimalne.
- Jeśli zainfekowanych jest >50%, zebrać 5 ml pożywki z płytki i zastąpić ją 5 ml świeżej pożywki. Jeśli zainfekowanych jest zbyt mało komórek, odczekać kolejne 12-24 h i sprawdzić ponownie. Zebrane naddatki zamrozić w temperaturze -80 °C.
- Następnie zbierać naddatek co 24 h przez 3 dni, co daje łącznie 4 dni.
- Łącznie, jeśli rozpoczęto od 4 płytek, powinno się uzyskać 20 ml pożywki z każdego dnia – czyli łącznie 80 ml, co odpowiada zawartości 2 probówek do ultrawirówki. Rozmrozić naddatki w 37 °C i przefiltrować przez filtry 0,45 μm na lodzie. Przenieść 36 ml wirusa do probówek wirówki Beckman.
- Skoncentrować naddatek (21 000K w rotorze SW28 (=80 000 x g) przez 90 min) w temperaturze 4 °C. Odlać naddatek do zlewki zawierającej 10% wybielacza i, trzymając probówkę w pozycji odwróconej, użyć aspiratora, aby usunąć jak najwięcej pożywki ze ścianek probówki.
- W zamkniętych probówkach wstrząsać wirusem w temperaturze 4 °C przez 1 h. Wystarczający jest standardowy wytrząsarka przy prędkości ok. 120 rpm.
- Delikatnie rozbić pellet w pozostałej pożywce, powoli pipetując w górę i w dół 30 razy. Należy uważać, aby nie wprowadzić pęcherzyków powietrza. Objętość pozostałej pożywki powinna wynosić ok. 30 μl. Rozdzielić tę objętość do wielu probówek, aby uniknąć wielokrotnych cykli zamrażania i rozmrażania dla konkretnego stoku, ponieważ może to prowadzić do spadku miana wirusa. Alikwoty te można zamrozić w temperaturze -80 °C.
- Oznaczyć miano wirusa. Optymalne jest oznaczanie miana ok. 2 dni po infekcji. Początkową infekcję można zaobserwować w ciągu kilku godzin, ale odczekanie tylko jednego dnia skutkuje niedoszacowaniem miana. Aby uzyskać miano wirusa, przeprowadzić eksperyment rozcieńczeń ograniczających skoncentrowanego wirusa na odpowiedniej linii komórkowej (dobrze sprawdzają się komórki 293T) w płytce 24-dołkowej, rozcieńczając wirusa 10-krotnie od 1 do 1 : 1 000 000. Uzyskiwane przez nas miana znajdują się zazwyczaj w zakresie 108-1010 jednostek tworzących ogniska (ffu)/ml.
3. Iniekcja wirusa
- W eksperymentach tych wykorzystujemy myszy, zazwyczaj w wieku od 6 do 10 tygodni. Wystarczający będzie każdy wiek, w którym obwody neuronalne są już ukształtowane. Jako przykład wybierzemy transmisję z komórek zwojowych siatkówki (RGCs) do amakrynowych komórek starburst (SACs). Ten eksperyment, przedstawiony schematycznie na Rysunku 2, wymaga zwierzęcia potrójnie transgenicznego i wykonania tylko jednej iniekcji wirusa. (Wszystkie przedstawione procedury zostały zatwierdzone przez IACUC w Harvard Medical School i były zgodne z wytycznymi instytucjonalnymi).
- W pierwszej kolejności należy wygenerować odpowiednie zwierzęta. Celem jest uzyskanie ekspresji TVA w typie komórek, które chcemy zmapować, za pomocą wirusa (np. wirusa towarzyszącego adenowirusom, AAV) lub poprzez allel transgeniczny. Specyficzność typu komórkowego uzyskuje się zazwyczaj dzięki ekspresji Cre. W tym przypadku skrzyżowano warunkowy allel ekspresji TVA7 z allelem ChAT-Cre (cholina acetylotransferaza)13, tak aby TVA była eksponowana we wszystkich komórkach z historią ekspresji Cre (SACs). Skrzyżowano również warunkowy allel ekspresji tdTomato (R26TdT) w celu wizualizacji komórek wykazujących ekspresję TVA.
- Należy zidentyfikować współrzędne miejsca iniekcji. Współrzędne te można znaleźć w atlasie mózgu, np. w atlasie mózgu myszy Franklina i Paxinosa14. Współrzędne te muszą być zapisane względem określonego punktu orientacyjnego na czaszce myszy. Używamy punktu bregma, ale każdy system współrzędnych jest wystarczający.
- Przygotować aparat stereotaktyczny. Włączyć kontroler mikroiniekcyjny i ustawić tłok oraz uchwyt elektrody na miejscu. Następnie wypełnić igłę iniekcyjną od tyłu olejem mineralnym, aby stworzyć barierę z wirusem. Umieścić igłę na tłoku, upewniając się, że w igle nie pozostały pęcherzyki powietrza.
- Rozmrozić wirusa i umieścić go na lodzie, aby zapobiec spadkowi miana wirusa. Ustawić mikroinjektor w trybie „pobierania” i przesunąć probówkę z wirusem tak, aby stykała się z kapilarą mikroinjektora. Pobrać niezbędną ilość rVSV(A/RG) pseudotypowanego RABV-G do eksperymentu.
- Przed rozpoczęciem operacji zwierzęta otrzymują dawkę przedoperacyjną buprenorfiny (0,05-0,1 mg/kg). Do znieczulenia zwierzęcia wystarczająca jest inhalacja izofluranu lub iniekcja domięśniowa mieszaniny ketaminy (40-80 mg/kg) i ksylazyny (5-10 mg/kg). Wybór środka znieczulającego zależy od użytkownika. Następnie wykonuje się uciśnięcie palca stopy, aby upewnić się, że zwierzęta są w pełni znieczulone; jeśli zwierzę nie reaguje, można przejść do procedury. Przed użyciem tych leków należy uzyskać odpowiednie zezwolenia.
- Zwierzęta umieszcza się na podgrzewanej podkładce, która spoczywa na ruchomym statywie służącym do pozycjonowania myszy. Zwierzę pozostaje tam przez cały czas trwania procedury chirurgicznej. Należy zastosować maść do oczu, aby zapobiec wysuszeniu rogówki podczas znieczulenia zwierzęcia.
- Następnie głowę myszy należy ustabilizować w aparacie stereotaktycznym. Użyć prętów usznych aparatu stereotaktycznego, aby upewnić się, że głowa jest solidnie zabezpieczona, równolegle do podłoża i nie obraca się bocznie. Po zakończeniu tej czynności należy wyregulować pręt gryzienia, aby pomóc w stabilizacji głowy.
- Sierść zwierzęcia zostaje ogolona w miejscu nacięcia na szczycie głowy. Obszar ten jest następnie przemywany trzykrotnie etanolem, a następnie trzykrotnie jodyną. Następnie za pomocą skalpela wykonuje się nacięcie skóry, odsłaniając czaszkę.
- Po przygotowaniu myszy i zestawu do iniekcji należy zlokalizować punkt bregma. Jest to obszar w centrum głowy, w którym spotykają się szwy strzałkowe i dwa czołowe. Po zlokalizowaniu tego obszaru można użyć pokręteł aparatu stereotaktycznego, aby ustawić mikroinjektor na odpowiednie współrzędne. W tym przypadku wstrzykujemy do ciała kolankowatego bocznego (LGN), używając współrzędnych A/P -2,46 od bregma, L/M 2, D/V 2,75.
- Po ustawieniu współrzędnych należy złożyć wiertarkę. Włożyć wiertło do wiertarki, a następnie ją uruchomić. W miejscu zidentyfikowanym jako miejsce iniekcji należy wywiercić mały otwór. Należy operować wiertarką bardzo delikatnie, aby nie uszkodzić miąższu mózgu. Gdy kość stanie się bardzo cienka, widoczne stają się naczynia krwionośne na oponie twardej. W tym momencie należy ostrożnie przebić krawędzie kraniotomii małą igłą (30G) i precyzyjną pęsetą (#5), aby usunąć pozostałości kości.
- Ustawić kapilarę w pozycji tuż nad powierzchnią mózgu, w miejscu wykonanego otworu. Igła powinna być na tyle ostra, aby z łatwością przebić oponę twardą. Następnie opuścić igłę na pożądaną głębokość i rozpocząć iniekcję. Wirus jest wstrzykiwany z prędkością 100 nl/min.
- Procedura iniekcji do tego momentu trwa około dziesięciu minut. Po wstrzyknięciu igła pozostaje w mózgu przez około siedem minut. Jest to kluczowe, ponieważ pozwala na dyfuzję wirusa z miejsca iniekcji. Szybkie usunięcie igły z miejsca wtrysku skutkuje zmniejszoną wydajnością infekcji w miejscu iniekcji oraz infekcją wzdłuż toru przebiegu igły.
- Igłę podnosi się bardzo powoli z miejsca iniekcji w czasie około dwóch minut. Ma to na celu ponowne zminimalizowanie infekcji wzdłuż toru przebiegu igły.
- Po usunięciu igły skórę zszywa się. Zwierzęta są monitorowane w sposób ciągły aż do wybudzenia z narkozy. Buprenorfinę (0,05-0,1 mg/kg) podaje się co 12 h przez 2 dni.
4. Pobieranie tkanki/Przygotowanie tkanki
- W przypadku pobierania interesującej tkanki optymalny czas zależy od celu eksperymentu. Zazwyczaj transsynaptyczne rozprzestrzenianie się VSV można zaobserwować w czasie krótszym niż 24 hr po iniekcji. Jednak dłuższy czas oczekiwania doprowadzi do większego rozprzestrzenienia wirusa.
- Aby pobrać siatkówkę, zwierzęta są najpierw uśpione poprzez inhalację dwutlenkiem węgla, a następnie przeprowadza się zwichnięcie stawów karkowych. Gałkę oczną usuwa się i umieszcza w probówce zawierającej 4% formaldehyd w PBS na 1 hr w temperaturze pokojowej.
- Następnie gałkę oczną umieszcza się w czarce Petriego z PBS. Siatkówkę oddziela się następnie od pozostałych tkanek.
- Do analizy w preparatach całych (whole mount) siatkówki są rozcinane tak, aby mogły leżeć płasko, umieszczane na szkiełku przedmiotowym, a następnie montowane przy użyciu medium Prolong Gold i przykrywane szkiełkiem nakrywnym o zerowej grubości. Pomiędzy szkiełkiem przedmiotowym a nakrywką umieszcza się silikonowe dystanse, aby zminimalizować siły nacisku na siatkówkę. Do analizy seryjnych przekrojów siatkówkę umieszcza się w 30% sacharozie w PBS aż do momentu zatonięcia tkanki. Następnie umieszcza się ją w mieszaninie 50% OCT i 50% roztworu 30% sacharozy na 3 hr. Po tym czasie próbkę zamraża się gwałtownie i przechowuje w temperaturze -80 °C do momentu krojenia.
5. Reprezentatywne wyniki
Wirus odzyskany z cDNA powinien być zdolny do zakażenia komórek TVA800, ale nie komórek 293T (Rysunek 3). Dostarczenie RABV-G umożliwia zakażenie wielu typów komórek, w tym 293T. Jednak ponieważ genom A/RG jest zakodowany w genomie, rozprzestrzenianie się między komórkami zachodzi znacznie szybciej w komórkach wykazujących ekspresję TVA.
Po skoncentrowaniu wirusa typowe miana wynoszą od 108 ffu/ml do 1010 ffu/ml. Miana te są odpowiednie do zastosowania in vivo.
Podczas wstrzykiwania wirusa do LGN myszy nie rozróżniamy grzbietowej części LGN (dLGN) od brzusznej części LGN (vLGN), ponieważ zazwyczaj obie ulegają zakażeniu. W konsekwencji znakowanych jest wiele typów RGC (Rycina 4), w tym te, które projektują do vLGN, takie jak RGC zawierające melanopsynę (Rycina 4D) i ON-DSGC (Rycina 4E), oraz te, które projektują do dLGN, takie jak RGC o małym rozgałęzieniu (small-arbor RGCs) (Rycina 4C) i ON-OFF-DSGC (Rycina 4F). Chociaż wirusa do SAC przekazywało więcej niż jeden typ RGC, jak zgłoszono w innych publikacjach (Beier et al., w recenzji), w niniejszej pracy skupiamy się wyłącznie na dobrze przebadanych połączeniach ON-OFF-DSGC z SAC.
W przypadku iniekcji u myszy o genotypie cTVA(+)/ChAT-Cre(-), w których nie powinna być ekspresjonowana TVA, znakowane są wyłącznie komórki zwoju siatkówkowego (RGCs) (t.j. Rycina 4). Wynika to z pierwotnego pobrania wirusa pseudotypowanego RABV-G przez RGCs, przy czym nie dochodzi do rozprzestrzeniania się wirusa. Żadne RGCs nie ulegają zakażeniu podczas iniekcji wirusa rVSV(A/RG) niepseudotypowanego RABV-G do ciała kolankowatego bocznego (LGN), ze względu na niezdolność tych wirionów do przemieszczania się wzdłuż długich aksonów RGCs. Jednakże przy iniekcji do LGN u myszy cTVA(+)/ChATCre(+) (oraz R26TdT(+)) dochodzi do rozprzestrzeniania się wirusa, ale tylko do komórek czerwonych, które wykazują ekspresję reportera Cre (t.j. Rycina 5). Komórki te ulegają również współznakowaniu z przeciwciałem anty-ChAT i warstwują się wyłącznie w dwóch laminach ChAT, co potwierdza ich tożsamość jako komórek amacrynowych STAR (SACs) (Ryciny 5B', C'). Liczba wirusowo znakowanych SACs na jedną komórkę zwoju siatkówkowego (DSGC) wynosiła od jednej do dziewięciu.
Rycina 1. Nasz system retrogradowego śledzenia transsynaptycznego w porównaniu z pierwotnie opracowaną metodą. (A) (i) W metodzie opracowanej przez Wickershama i współpracowników „komórki startowe” są transfekowane trzema genami: receptorem TVA, służącym do umożliwienia infekcji specyficznie transfekowanych komórek; RABV-G, służącym do komplementacji RABV, w którym sam gen G został usunięty; oraz czerwonym białkiem fluorescencyjnym w celu identyfikacji transfekowanych komórek. (ii) RABV pseudotypowany białkiem A/RG infekuje komórki wykazujące ekspresję TVA, zabarwiając je na żółto. (iii) Do neuronów znajdujących się powyżej (upstream) dochodzi do retrogradowej transmisji transsynaptycznej. (B) (i) W naszej metodzie komórki wykazujące ekspresję TVA są definiowane genetycznie i znakowane warunkowym czerwonym białkiem fluorescencyjnym. (ii) „Komórkami startowymi” są te zainfekowane przez VSV kodujący gen A/RG w genomie wirusa. Te komórki startowe nie wykazują ekspresji receptora TVA. (iii) Retrogradowa transmisja transsynaptyczna do neuronów wykazujących ekspresję TVA zachodzi tylko wtedy, gdy komórki te dostarczają wkład synaptyczny do neuronów startowych. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą rycinę.
Rycina 2. Schemat procedury eksperymentalnej. (A) Najpierw wirus jest odzyskiwany z cDNA. Następnie jest on pasażowany i pseudotypowany za pomocą RABV-G, a potem zagęszczany i mianowany. Wirus ten jest następnie wstrzykiwany do mózgu, gdzie inkubuje się go przez pożądany okres czasu. Po tym czasie pobiera się oko, a siatkówkę wycina się i analizuje. (B) Schemat pseudotypowania wirusa za pomocą RABV-G. Jest to niezbędne do zainfekowania komórek zwojowych siatkówki po wstrzyknięciu do mózgu. Gen RABV-G jest najpierw transfektowany do komórek hodowli tkankowych wykazujących ekspresję receptora TVA. Komórki te są następnie infekowane wirusem rVSV(A/RG). Uwolnione wiriony będą posiadać RABV-G w otoczce wirusowej, ale nie będą posiadać genu RABV-G w genomie wirusowym. (C) Schemat krzyżowań myszy niezbędnych do uzyskania zwierząt potrójnie transgenicznych. Warunkowe allele TVA i tdTomato są krzyżowane z wybranym driverem Cre, tak aby zarówno TVA, jak i tdTomato były ekspresowane tylko w komórkach z historią ekspresji Cre. W tym przykładzie zastosowano ChAT-Cre. (D) Schemat infekcji siatkówki w celu śledzenia obwodów DSGC-SAC. Komórki ChAT są modyfikowane tak, aby ekspresowały TVA i tdTomato, jak pokazano w (C). RGC są infekowane poprzez wstrzyknięcie do LGN wirusa otrzymanego w (B). Ponieważ wirus wykazuje ekspresję GFP, te RGC będą zielone. Wirus rozprzestrzeni się następnie tylko do wykazujących ekspresję TVA komórek amakrynowych ChAT, jeśli są one połączone z oznakowaną komórką RGC. Komórki te będą jednocześnie czerwone i zielone, czyli żółte. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną rycinę.
Rysunek 3. Zachowanie wirusa rVSV(A/RG) w komórkach 293T i TVA800. Komórki te zostały zainfekowane niskim mianem rVSV(A/RG) pseudotypowanego z RABV-G. Wirus rozprzestrzenia się między komórkami wykazującymi ekspresję TVA w ciągu kilku godzin, co pokazano w 6 godzinach po infekcji (HPI) oraz 1 i 2 dniach po infekcji (DPI). Natomiast rozprzestrzenianie się w komórkach 293T, które nie wykazują ekspresji receptora TVA, choć występuje, przebiega znacznie wolniej. Pasek skali = 100 μm.
Rysunek 4. Reprezentatywne zakażenia RGC myszy niewyrażających TVA. Zwierzęta otrzymały wstrzyknięcia wirusa rVSV(A/RG) pseudotypowanego białkiem RABV-G do LGN, a tkankę pobrano 2 dpi. W zależności od miana wirusa i jakości wstrzyknięcia można uzyskać zakażenia rzadkie (A, RGC wskazane żółtymi grotami strzałek) lub (B) gęste. Na podstawie morfologii można zidentyfikować wiele różnych typów RGC, w tym m.in. (C) RGC o małym drzewieniu, (D) RGC typu 1 z melanopsyną, (E) ON-DSGC oraz (F) ON-OFF-DSGC. Paski skali = 50 μm.
Rycina 5. Transmisja rVSV(A/RG) z ON-OFF-DSGC do SAC przebiega zgodnie z oczekiwanym wzorcem. (A) ON-OFF-DSGC (biała grot strzałki z zielonym wypełnieniem) przekazuje wirusa do wielu SAC (żółte groty strzałek). (A'). Wszystkie zielone komórki, które nie są DSGC, kolokują się z reporterem Cre, co wskazuje, że są to SAC wykazujące ekspresję TVA. (B-C) DSGC (biała grot strzałki z zielonym wypełnieniem) oraz SAC (żółte groty strzałek) warstwują się w odpowiednich warstwach ChAT wewnętrznej warstwy splotowej (IPL) siatkówki. Komórki, do których transmitowany jest wirus, obejmują zarówno ON-SAC, jak i OFF-SAC. Liczby na panelach B' i C' wskazują blaszki IPL. Położenie somy DSGC jest zaznaczone jedynie grotem strzałki, ale nie jest pokazane na panelu C, aby uwypuklić SAC. Paski skali = 50 μm.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Wykorzystanie wirusów do badania obwodów neuronalnych jest stosunkowo wydajną metodą analizy połączonych neuronów. Jednak generowanie wirionów zarówno VSV, jak i RABV nie jest zadaniem trywialnym. Mimo przedstawionego powyżej protokołu odzyskiwania wirusa z cDNA, jest to wciąż zdarzenie o niskim prawdopodobieństwie. Poziomy każdego z plazmidów N, P i L muszą być precyzyjnie dostosowane, a w celu zapewnienia odzyskania wirusa konieczne jest przeprowadzenie wielu prób i powtórzeń. Formowanie cząsteczki rybonukleoproteinowe...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Nie zgłoszono żadnych konfliktów interesów.
Podziękowania
Chcielibyśmy podziękować Seanowi Whelanowi za pomoc w odzyskiwaniu rekombinowanych wariantów VSV, a Didem Goz i Ryanowi Chrenekowi za pomoc techniczną. Praca ta była wspierana przez HHMI (CLC) oraz grant nr #NS068012-01 (KTB).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Hodowla tkanek | |||
| komórki nerki chomika (BSRT7) | dostępne na zapytanie | ||
| vaccinia (vTF7-3) | dostępne na zapytanie | ||
| plazmidy pN, pP, pl | dostępne na zapytanie | ||
| chlorek wapnia | Sigma | C1016 | |
| chlorek magnezu | Sigma | M8266 | |
| komórki HEK 293T | Open Biosystems | HCL4517 | |
| 60 mm szalka hodowlana traktowana TC | Corning | 430166 | |
| 75 cm2 prostokątna kolba do hodowli komórkowej z ukośnym szyjką i nakrętką z filtrem | Corning | 430641 | |
| Pożywka : DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium) | Invitrogen | 12491-015 | |
| 1 M HEPES pH 7.4 | Gibo | 15630-080 | |
| FBS: płodowa surowica bydlęca | Gibco | 10437-028 | |
| PKS | Invitrogen | 15140-163 | |
| odczynnik do transfekcji Lipofectamine 2,000 | Invitrogen | 11668-019 | |
| strzykawka: strzykawka 5 ml Luer-Lock | Sigma | Z248010-1PAK | |
| filtry strzykawkowe | Nalgene | 190-2520 | |
| PEI: wysokopotencjalny liniowy PEI | Polysciences | 23966 | |
| Wirowanie wirusów | |||
| system filtracji próżniowej na górze probówki Corning 150 ml, pory 0,45 μm | Corning | 430314 | |
| cienkościenne, ultra-przejrzyste probówki do ultrawirowania 38,5 ml, 25 x 89 mm | Beckman-Coulter | 344058 | |
| ultrawirowarka | Beckman-Coulter | optima XL-80K | |
| rotor do ultrawirowarki SW28 | Beckman-Coulter | 342207 | |
| Iniekcje u myszy | |||
| kapilarne mikropipety | Drummond | 5-000-2005 | |
| stereotaks | Narishige | SR-5M | |
| mikromanipulator | Narishige | SM-15 | |
| injektor Ump | World Precision Instruments | Sys-Micro4 | |
| czterokanałowy mikrokontroler | World Precision Instruments | UMP3 | |
| silnik warsztatowy M.TXB z pokrętłem sterującym C.EMX-1, 115 V | Foredom | M.TXB-EM | |
| szybkozmienny uchwyt H.10 | Foredom | H.10 | |
| wiertło stopniowe, 0,5 mm | Foredom | A-58005P | |
| uchwyt mikr–elektrody | World Precision Instruments | MEH2S | |
| ketamina | Henry Schein | 995-2949 | |
| ksylazyna | Henry Schein | 4015809TV | |
| buprenorfina | Henry Schein | 1118217 | |
| strzykawka 1 ml | Becton-Dickinson | 309628 | |
| igła do iniekcji G 30 | Becton-Dickinson | 305106 | |
| ochronna maść okulistyczna | Doctors Foster and Smith | 9N-014748 | |
| etanol | Sigma | 493511 | |
| jod | Sigma | PVP1 | |
| Narzędzia chirurgiczne i do sekcji | |||
| nożyczki | Fine Science Tools | 91402-12 | |
| pinceta standardowa | Fine Science Tools | 11000-12 | |
| pinceta precyzyjna | Fine Science Tools | 11255-20 | |
| sprężynowe nożyczki Vannasa | Fine Science Tools | 15000-00 | |
| rękojeść skalpela | Fine Science Tools | 10003-12 | |
| ostrza skalpela | Fine Science Tools | 10015-00 | |
| szwy | Robbins Instruments | 20.SK640 | |
| Sekcja i barwienie przeciwciałami | |||
| paraformaldehyd | Sigma | P6148 | |
| bufor fosforanowy (PBS) | Sigma | P4417 | |
| Triton X-100 | Sigma | T9284 | |
| surowica osła | Jackson Immunoresearch | 017-000-121 | |
| Przeciwciała | |||
| przeciwciała | millipore | AB144P | |
| anty-gfp | Abcam | ab13970 | |
| przeciwciała osie anty-kurczak Dylight 488 | Jackson immunoresearch | 703-545-155 | |
| przeciwciała osie anty-kurczak Alexa Fluor 647 | Jackson immunoresearch | 705-605-147 | |
| DAPI | Invitrogen | D1306 | |
| Montowanie tkanek | |||
| szkiełka mikroskopowe Superfrost plus | Fisher | 12-550-100 | |
| szkiełka zakrywkowe 22 x 22, grubość 0 | Electron Microscopy Sciences | 72198-10 | |
| elastomer silikonowy | Rogers Corp | HT-6220 | |
| przezroczysty lakier do paznokci | Electron Microscopy Sciences | 72180 | |
| odczynnik antyblaknący Prolong Gold | Invitrogen | P36930 | |
|
Bibliografia
- Wickersham, I. R. Monosynaptic restriction of transsynaptic tracing from single, genetically targeted neurons. Neuron. 53, 639-647 (2007).
- Marshel, J. H., Mori, T., Nielsen, K. J., Callaway, E. M. Targeting single neuronal networks for gene expression and cell labeling in vivo. Neuron. 67, 562-574 (2010).
- Wall, N. R., Wickersham, I. R., Cetin, A., De La Parra, M., Callaway, E. M. Monosynaptic circuit tracing in vivo through Cre-dependent targeting and complementation of modified rabies virus. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 21848-21853 (2010).
- Wickersham, I. R. Monosynaptic restriction of transsynaptic tracing from single, genetically targeted neurons. Neuron. 53, 639-647 (2007).
- Yonehara, K. Spatially asymmetric reorganization of inhibition establishes a motion-sensitive circuit. Nature. 469, 407-410 (2011).
- Stepien, A. E., Tripodi, M., Arber, S. Monosynaptic rabies virus reveals premotor network organization and synaptic specificity of cholinergic partition cells. Neuron. 68, 456-472 (2010).
- Beier, K. T., Samson, M. E. S., Matsuda, T., Cepko, C. L. Conditional expression of the TVA receptor allows clonal analysis of descendents from Cre-expressing progenitor cells. Dev. Biol. 353, 309-320 (2011).
- Seidler, B. A Cre-loxP-based mouse model for conditional somatic gene expression and knockdown in vivo by using avian retroviral vectors. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 10137-10142 (2008).
- Beier, K. T. Anterograde or retrograde transsynaptic labeling of CNS neurons with vesicular stomatitis virus vectors. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108, 15414-15419 (2011).
- Whelan, S. P., Ball, L. A., Barr, J. N., Wertz, G. T. Efficient recovery of infectious vesicular stomatitis virus entirely from cDNA clones. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 92, 8388-8392 (1995).
- Fuerst, T. R., Niles, E. G., Studier, F. W., Moss, B. Eukaryotic Transient-Expression System Based on Recombinant Vaccinia Virus That Synthesizes Bacteriophage T7 RNA Polymerase. PNAS. 83, 8122-8126 (1986).
- Young, J. A., Bates, P., Varmus, H. E. Isolation of a chicken gene that confers susceptibility to infection by subgroup A avian leukosis and sarcoma viruses. J. Virol. 67, 1811-1816 (1993).
- Madisen, L. A robust and high-throughput Cre reporting and characterization system for the whole mouse brain. Nat Neurosci. 13, 133-140 (2010).
- Franklin, K., Paxinos, G. The Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates. , Academic Press. San Diego, CA. (1997).
- van den Pol, A. N. Viral strategies for studying the brain, including a replication-restricted self-amplifying delta-G vesicular stomatis virus that rapidly expresses transgenes in brain and can generate a multicolor golgi-like expression. J. Comp. Neurol. 516, 456-481 (2009).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
