Iteracyjna optymalizacja dupleksów DNA pod kątem krystalizacji kompleksów SeqA-DNA

Summary

Struktura krystaliczna kompleksów białkowo-DNA może dostarczyć informacji na temat funkcji białka, mechanizmu, a także natury specyficznej interakcji. W tym miejscu opisujemy, jak zoptymalizować długość, sekwencję i końce dupleksowego DNA pod kątem kokrystalizacji z Escherichia coli SeqA, negatywnym regulatorem inicjacji replikacji.

Abstract

Escherichia coli SeqA jest negatywnym regulatorem replikacji DNA, który zapobiega przedwczesnym reinicjacjom poprzez sekwestrację hemimetylowanych klastrów GATC w obrębie początku replikacji¹. Poza początkiem, SeqA znajduje się w widełkach replikacyjnych, gdzie organizuje nowo zreplikowane DNA w struktury o wyższym porządku². SeqA wiąże się tylko słabo z pojedynczymi sekwencjami GATC, ale tworzy kompleksy o wysokim powinowactwie z dupleksami DNA zawierającymi wiele miejsc GATC. Minimalną jednostką funkcjonalną i strukturalną SeqA jest dimer, co wyjaśnia wymóg co najmniej dwóch sekwencji GATC do utworzenia kompleksu o wysokim powinowactwie z hemimetylonym DNA³. Dodatkowo, architektura SeqA, z domenami oligomeryzacji i wiążącymi DNA oddzielonymi elastycznym łącznikiem, umożliwia wiązanie się z powtórzeniami GATC oddzielonymi maksymalnie trzema spiralnymi zwojami. Dlatego zrozumienie funkcji SeqA na poziomie molekularnym wymaga analizy strukturalnej SeqA związanego z wieloma sekwencjami GATC. W krystalizacji białka-DNA DNA może mieć żaden lub wyjątkowy wpływ na interakcje upakowania, w zależności od względnych rozmiarów i architektury białka i DNA. Jeśli białko jest większe niż DNA lub pokrywa większość DNA, w upakowaniu kryształów pośredniczą przede wszystkim interakcje białko-białko. I odwrotnie, gdy białko jest tej samej wielkości lub mniejsze niż DNA lub obejmuje tylko ułamek DNA, interakcje DNA-DNA i DNA-białko dominują w upakowaniu kryształów. Dlatego krystalizacja kompleksów białko-DNA wymaga systematycznego badania przesiewowego długości DNA⁴ i końców DNA (lub zwisów)^5-7. W tym raporcie opisujemy, jak projektować, optymalizować, oczyszczać i krystalizować dupleksy hemimetylowanego DNA zawierające tandemowe powtórzenia GATC w kompleksie z dimerycznym wariantem SeqA (SeqAΔ(41-59)-A25R) w celu uzyskania kryształów odpowiednich do określenia struktury.

Protocol

1. Oczyszczanie białek

Elastyczny łącznik łączący domeny N- (oligomeryzacja) i C-końcowy (wiązanie DNA) SeqA pomaga w rozpoznawaniu hemimetylowanych powtórzeń GATC oddzielonych od siebie jednym do trzech zwojów DNA. W tym badaniu użyliśmy dimerycznego wariantu SeqA (SeqAΔ(41-59)-A25R) z mutacją punktową w domenie N-końcowej, która zapobiega dalszej oligomeryzacji i skróconym łącznikiem, który ogranicza wiązanie DNA do tandemowych powtórzeń GATC oddzielonych wyłącznie jednym zwojem DNA (Figura 1)^2,8.

1. Transformacja komórek BL21 (DE3) z plazmidem kodującym SeqA pod kontrolą promotora T7,
2. Płytka reakcji przemiany na płytkach LB-agar zawierających 100 μg/ml ampicyliny,
3. Wybrać mieszane kolonie do zaszczepienia hodowli nocnej na małą skalę (pożywka LB ze 100 μg/ml ampicyliny),
4. Następnego ranka zaszczepić 1 l pożywki, stosując rozcieńczenie nocnej kultury w stosunku 1:100,
5. Hodować komórki do OD₆₀₀ ~0,7 i indukować produkcję białka przez dodanie izopropylu β-D-1-tiogalaktopiranozydu (IPTG) do końcowego stężenia 1 mM,
6. Kontynuować inkubację przez 3 godziny w temperaturze 37 °C z wytrząsaniem orbitalnym, a następnie zebrać komórki przez odwirowanie (10 minut w temperaturze 3 300 g),
7. Zawiesić osad komórkowy w buforze oczyszczającym A i poddać lizie za pomocą sonikacji,
8. Oczyścić lizat przez odwirowanie (40 minut przy 39 000 g) i załadować supernatant do kolumny z heparyną zrównoważoną buforem oczyszczającym,
9. Elute SeqA za pomocą gradientu liniowego do 1 M NaCl (SeqA eluuje przy ~0,7 M NaCl),
10. Zebrać razem frakcje zawierające SeqA, rozcieńczyć w celu obniżenia siły jonowej próbki i załadować do kolumny chromatografii kationowymiennej zrównoważonej buforem oczyszczającym,
11. Wykorzystując liniowy gradient soli, czysty SeqA eluuje przy ~0,4 M NaCl,
12. Połączyć ze sobą frakcje zawierające SeqA, skoncentrować (3 mg/ml) i przechowywać w buforze do przechowywania.

2. Oczyszczanie DNA

1. Zamów komplementarne niemetylowane i metylowane oligonukleotydy od swojej ulubionej firmy,
2. Rozpuść 1 μmol każdej liofilizowanej pojedynczej nici DNA w 800 μl autoklawizowanego ddH₂O, odwiruj i pozostaw na 10-20 minut,
3. Dodać 800 μl podgrzanego buforu ładującego 2X do każdego oligonukleotydu,
4. Dla 20-30 nukleotydów długich oligonukleotydów przygotuj duży 10% żel denaturujący (160 x 250 x 1 mm):
   * Dobrze wymieszać 80 ml 10% mieszanki PAGE, 80 μl TEMED i 800 μl nadsiarczanu amonu na żel i wlać,
   * Po polimeryzacji wyjmij grzebień i dokładnie przepłucz studzienki ddH₂O,
   * Zmontuj żele na odlewie żelowym, w tym płycie chłodzącej, a następnie napełnij górny i dolny zbiornik buforem do pracy (1X TBE),
   * Uruchom żel pod napięciem 700-750 V, aby podgrzać żel do 55 °C,
   * Zatrzymaj bieg i dokładnie przepłucz studzienki buforem do pracy.
5. Podgrzewać oligonukleotydy do temperatury 90 °C przez 2 minuty,
6. Odwirować i odwirować próbki i bezpośrednio przed załadowaniem żelu,
7. Uruchom żel pod napięciem ~700 V i zatrzymaj go, gdy oligonukleotyd przeniesie się do połowy. (Należy zauważyć, że na 10% żelu poliakryloamidowym błękit bromofenolowy komigruje z oligonukleotydami o długości ~20 zasad i cyjanolem ksylenu FF o długości ~60 zasad),
8. Zatrzymaj żel, zdemontuj go z pudełka na żel i usuń przekładki,
9. Na płaskiej powierzchni wyjmij jedną szklaną płytkę i przykryj żel folią,
10. Odwróć żel, zdejmij drugą szklaną płytkę i przykryj ją folią,
11. Oznacz prążki za pomocą światła UV i płytki fluorescencyjnej za żelem, aby zobaczyć cień DNA,
12. Pokrój opaskę żyletką na małe kawałki i przenieś je do sterylnej probówki o pojemności 15 ml,
13. Dodać 9 ml buforu elucyjnego i eluować przez noc w temperaturze 37 °C z mieszaniem,
14. Ostrożnie przenieść roztwór do autoklawowanej probówki wirówkowej za pomocą końcówki pipety z żelem, aby uniknąć przenoszenia kawałków akrylamidu i dodać 1 ml 3 M octanu sodu o pH 7 (rozcieńczenie 1:10) plus 25 ml schłodzonego 100% etanolu (2,5 objętości),
15. Inkubować w temperaturze -20 °C przez co najmniej 3 godziny,
16. Odwirować i przenieść supernatant do oddzielnej probówki,
17. Wysuszyć granulat na speed-vac na średnim ogniu,
18. Zawiesić osad w 400 μl autoklawizowanego ddH₂O i przenieść do świeżej probówki,
19. Dodać 40 μl 3 M octanu sodu o pH 7 i 1 ml 100% alkoholu etylowego; dobrze wymieszać (wir) i inkubować przez 30 minut w temperaturze pokojowej, a następnie 30 minut w temperaturze -20 °C,
20. Wirować przez 15 minut w temperaturze 18 000 g i odrzucić supernatant,
21. Wypłucz granulat 100 μl 70% zimnego etanolu, aby usunąć resztki soli z granulki i wiruj przez 6 minut w temperaturze 18 000 g. Wyrzuć etanol i wysusz pellet na speed-vac,
22. Zawiesić osad w sumie w 100 μl autoklawizowanego ddH₂O. Zmierzyć stężenie oligonukleotydu,
23. Aby wyżarzyć dupleksy hemimetylowanego DNA, należy wymieszać równomolowe stężenia komplementarnych pojedynczych nici i podgrzać mieszaniny do 95 °C w łaźni wodnej przez 5 minut, a następnie pozostawić je do powolnego ostygnięcia do temperatury pokojowej wewnątrz łaźni wodnej.

3. Tworzenie i analiza kompleksu białko-DNA

1. Zmieszać równe objętości oczyszczonego SeqAΔ(41-59)-A25 (81 μM) i hemimetylowanego DNA (81 μM),
2. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 15 minut i przechowywać w temperaturze 4 °C, aż będziesz gotowy do użycia,
3. Ekran do warunków krystalizacji z wykorzystaniem komercyjnych ekranów o rzadkiej matrycy,
4. Po zidentyfikowaniu początkowych przewodów krystalizacji zoptymalizuj warunki do wzrostu kryształów o jakości dyfrakcyjnej,
5. Kriochronić powstałe kryształy SeqA-DNA poprzez zwiększenie ilości PEG 400 obecnego w roztworze krystalizacyjnym do końcowego stężenia 25% (v/v) lub dodanie 20% glicerolu (v/v) do roztworu krystalizacyjnego,
6. Zgarnij pojedyncze kryształy za pomocą nylonowej pętli i błyskawicznie zamroź je w ciekłym azocie,
7. Przetestuj granicę dyfrakcji każdego kryształu w temperaturze 100 K.

4. Reprezentatywne wyniki

Aby uzyskać strukturę krystaliczną SeqAΔ(41-59)-A25R związaną z hemimetylowanym DNA, kolejno zoptymalizowaliśmy trzy parametry DNA: (i) separację między hemimetylowanymi sekwencjami GATC; (ii) długość dupleksu; oraz (iii) brak/obecność zwisów 5'.

Testy przesunięcia elektromobilności wskazują, że SeqAΔ(41-59)-A25R preferencyjnie wiąże powtórzenia GATC oddzielone 9-10 parami zasad (Rysunek 1). Dlatego początkowo przesiewaliśmy dupleksy o długości 23-24 par zasad (bps) zawierające dwie hemimetylowane sekwencje GATC oddalone od siebie o 9 lub 10 bps. Trzy dupleksy dały ładnie ukształtowane kryształy (ryc. 2). Chociaż żaden z kryształów nie uległ dyfrakcji do wysokiej rozdzielczości, dupleks o długości 23 bps z dwoma miejscami GATC oddzielonymi o 9 bps dyfrakcyjny promieniami rentgenowskimi lepiej niż reszta, co wskazuje, że separacja GATC o wartości 9 bps była preferowana do krystalizacji. W związku z tym poprawiliśmy odstępy między GATC do 9 punktów bazowych dla wszystkich kolejnych ekranów.

Generalnie, krystalizacja DNA jest preferowana dla długości dupleksu odpowiadających dokładnym spiralnym zwojom, ponieważ wiele cząsteczek DNA może układać się w stos od głowy do ogona, tworząc ciągłe B-DNA wewnątrz kryształu⁹. W związku z tym skróciliśmy całkowitą długość dupleksów do 21 punktów bazowych (czyli dwóch spiralnych zwojów). Podczas gdy dupleks 21 bps z końcami nie dawał kryształów o jakości dyfrakcyjnej (dane nie pokazane), duplex 21 bps z pojedynczym nukleotydem 5' zwisu na każdym końcu dał kryształy, które dyfrakcjonowały do 5 A w naszym domowym źródle. Poprawa limitu dyfrakcji sugerowała, że asocjacja dupleksowa typu end-to-end rzeczywiście faworyzowała upakowanie kryształów.

Ponieważ SeqA oddziałuje z sekwencjami GATC, które znajdują się na tej samej stronie DNA, przeciwna strona dupleksu DNA powinna być wystawiona na działanie rozpuszczalnika. Aby jeszcze bardziej ulepszyć kryształy kompleksu, zmodyfikowaliśmy sekwencję dupleksu, aby uwzględnić dinukleotyd CG między dwoma miejscami GATC, aby promować interakcje rowkowo-szkieletowe z sąsiednimi cząsteczkami DNA w krysztale przez przeciwną powierzchnię dupleksu, metoda, która została użyta do zwiększenia krystalizacji DNA w ciągu ostatnich¹⁰. Jednak granica dyfrakcji kryształów wyhodowanych z dupleksem zawierającym CG była identyczna z tymi wyhodowanymi z podobnym dupleksem DNA, który nie zawierał dinukleotydu CG (ryc. 3). Wynik ten wskazuje, że interakcje rowek-szkielet nie były w tym przypadku istotne. Następnie zoptymalizowaliśmy długość zwisów, porównując kryształy wyhodowane z dupleksem DNA, który miał dwa dodatkowe nukleotydy na każdym końcu 5 stóp. Zmiana ta miała drastyczny wpływ na morfologię kryształów, a także na granicę dyfrakcji wskazującą, że dodatkowy nukleotyd radykalnie zmienił kontakty molekularne i poprawił organizację kryształów (ryc. 3).

Struktura krystaliczna SeqAΔ(41-59)-A25R związana z tym ostatnim dupleksem DNA potwierdziła, że wolna powierzchnia dupleksu DNA nie wchodzi w kontakty kryształów, jak można się spodziewać po ograniczonym efekcie wprowadzenia dinukleotydu CG. Pomimo względnej wielkości białka i DNA, większość interakcji między partnerami symetrii odbywa się za pośrednictwem interakcji białko-białko i białko-DNA (ryc. 4). Co ciekawe, w tym konkretnym przypadku korzystny wpływ zwisu dinukleotydu 5' nie wynika z tworzenia pseudociągłego DNA. Zamiast tego koniec 5' metylowanej nici wystaje z osi DNA i oddziałuje z proksymalną cząsteczką SeqA kompleksu, co wyjaśnia, dlaczego dwa nukleotydy były ściśle wymagane do zmiany upakowania kryształów^8,11.

Rysunek 1. Wiązanie SeqAΔ(41-59)-A25R z hemimetylowanym DNA. (A) Schemat ideowy domen SeqA, które pośredniczą w oligomeryzacji białek i wiązaniu DNA. (B) Test przesunięcia ruchliwości elektroforetycznej SeqAΔ (41-59)-A25R z DNA zawierającymi dwie hemimetylowane sekwencje GATC oddzielone rosnącą liczbą par zasad (X). Skrajny lewy pas (oznaczony jako pusty) zawiera równomolową mieszaninę DNA z 5, 7, 12, 21, 25 i 34 parami zasad między dwiema sekwencjami GATC pod nieobecność SeqAΔ (41-59)-A25R. (C) Diagram przedstawiający trzy zmienne zoptymalizowane na dupleksach DNA w celu uzyskania kryształów o jakości dyfrakcyjnej.

Rysunek 2. Wpływ różnicowania odległości między GATC. Podsumowanie zastosowanych oligonukleotydów i kryształów otrzymanych za pomocą dupleksów o długości 23-24 pz zawierających dwie hemimetylowane miejsca GATC oddzielone 9 lub 10 parami zasad. Wszystkie zdjęcia kryształów zostały wykonane w tym samym powiększeniu, a podziałka wskazuje 100 μm. Granica rozdzielczości każdego kryształu SeqAΔ(41-59)-A25R-DNA opiera się na obrazach dyfrakcyjnych zebranych na systemie generatora promieniowania rentgenowskiego Rigaku RU-300. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą postać.

Rysunek 3. Efekt różnicowania DNA kończy się. Podsumowanie użytych oligonukleotydów i kryształów otrzymanych za pomocą dupleksów o długości 21 bps zawierających dwie hemezylowane miejsca GATC oddzielone 9 parami zasad i zawierające 0, 1 lub 2 nukleotydowe zwisy końcowe 5'. Wszystkie zdjęcia kryształów zostały wykonane w tym samym powiększeniu, a podziałka wskazuje 100 μm. Granica rozdzielczości każdego kryształu SeqAΔ(41-59)-A25R-DNA opiera się na obrazach dyfrakcyjnych zebranych na liniach badawczych X12C i X29 (NSLS, BNL). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą postać.

Rysunek 4. Upakowanie kryształów SeqAΔ (41-59)-A25R związane z DNA z nawisem dinukleotydowym: Oglądane od góry (A) i z boku (B). Jednostka asymetryczna zawiera dwa kompleksy SeqAΔ(41-59)-A25R-DNA, w których białko jest pokazane na szaro, podczas gdy DNA jest pokazane na pomarańczowo. Cząsteczki SeqAΔ(41-59)-A25R-DNA związane z symetrią są pokazane na biało dla białka i na żółto dla DNA. Figura ta została przygotowana przy użyciu PyMOL¹². Ta liczba jest związana z filmem 1. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą postać.

Film 1. Kliknij tutaj, aby obejrzeć film.

Discussion

Jednym z największych wyzwań w makromolekularnej krystalografii rentgenowskiej jest uzyskanie kryształów o jakości dyfrakcyjnej. W przypadku kompleksów białkowych lub białko-DNA wyzwanie to nasila się ze względu na dodatkowe zmienne, które należy zoptymalizować. Powszechnie uważa się, że długość DNA i obecność lepkich nawisów w celu zwiększenia asocjacji sąsiednich cząsteczek DNA w dłuższym pseudo-dupleksie są głównymi parametrami do optymalizacji. Wykazaliśmy jednak, że charakter i długość tych zwisów może mieć dodatkow...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
TRIS	Bioshop	TRS003.5
Kwas etylenodiaminotetraoctowy (EDTA)	Fisher Scientific	E478-500
Ditioteitrol (DTT)	Bio Basic Inc.	DB0058
NaCl	Bioshop	SOD002.10
Glicerol	Caledon	5350-1
Sacharoza	Sigma-Aldrich	S5016-500G
Dodecylosiarczan sodu (SDS)	Bioshop	SDS001.500
Mocznik		Bioshop URE001.5
40% 29:1 Bis/akryloamid	Bio Basic Inc.	A0007-500ml	Przechowywać w temperaturze 4 stopni; C
Kwas borowy	EMD	BX0865-1
Cyjanol ksylenowy FF	Bio-Rad	161-0423
Niebieski bromofenol	Bioshop	BR0222
Podwójny regulowany pionowy system żelowy	CBC Scientific Company Inc.	DASG-250
Ekran krystalizacji indeksu	Hampton Research	HR2-144	Przechowywać pod kątem 4 stopni; C
Wizard I ekran krystalizacji	Emerald BioSystems	EBS-WIZ-1	Sklep pod adresem 4 ° C
Ekran krystalizacji Wizard II	Emerald BioSystems	EBS-WIZ-2	Sklep pod adresem 4 & st.; C
Klasyczny ekran krystalizacji	Qiagen	130701	Sklep pod kątem 4 stopni; C
Tace Intelliplate	Art Robbins Instruments	102-0001-00
Solutions Bufor do oczyszczania białek: 100 mM TRIS pH 8, 2 mM EDTA, 2 mM DTT i 5% glicerol. Bufor do przechowywania białka: 20 mM TRIS pH 8, 150 mM NaCl, 5 mM DTT, 0,5 mM EDTA i 5% glicerolu. Gel Mieszanka ładująca: Dodać 20 g sacharozy, 25 mg błękitu bromofenolowego, 25 mg cyjanolu ksylenu FF, 1 ml 10% w/v SDS i 10 ml 10X TBE do 70 ml autoklawizowanego ddH2O. Mieszać z łagodnym ogrzewaniem, aż sacharoza się i dostosować końcową objętość do 100 ml za pomocą autoklawowanego ddH2O. Przechowywać w temperaturze 4 stopni C. 2X Bufor załadowczy: Dodać 11 g mocznika do 10 ml żelowej mieszanki ładującej. Mieszaj na gorącej płycie, aż mocznik się rozpuści. Podwielokrotność porcji w probówkach o pojemności 2 ml i przechowywać w temperaturze 4 stopni Celsjusza. 10X PAGE mix: Wymieszaj 420,4 g mocznika, 100 ml 10X TBE (autoklawowanego), 250 ml 40% 29:1 Bis/Akrylamid w ddH2O. Mieszaj do całkowitego rozpuszczenia i dostosuj objętość do 1 litra. Przechowywać w ciemnych butelkach w temperaturze 4 stopni Celsjusza 10X TBE: Dissolve 108 g TRIS, 55 g kwasu borowego i 9,3 g EDTA w 1 litrze ddH2O. Autoklaw i przechowywać w temperaturze pokojowej. Bufor elucyjny: Rozcieńczyć 8 ml 5 M NaCl, 2 ml 1 M TRIS pH 7,5, 0,4 ml 0,5 M EDTA pH 8 na 200 ml ddH2O. Autoklaw i przechowywać w temperaturze pokojowej.