Badanie dodatniej i ujemnej selekcji grasicy za pomocą cytometrii przepływowej

Summary

Prezentujemy metodę opartą na cytometrii przepływowej do badania rozwoju limfocytów T in vivo przy użyciu genetycznie zmodyfikowanych myszy na tle transgenicznym typu dzikiego lub receptora limfocytów T.

Abstract

Zdrowy układ odpornościowy wymaga, aby limfocyty T reagowały na obce antygeny, pozostając jednocześnie tolerancyjnymi na własne antygeny. Losowe przegrupowanie receptora limfocytów T (TCR) α i β loci generuje repertuar limfocytów T o ogromnej różnorodności swoistości antygenowej, zarówno dla siebie, jak i obcego. Wybór repertuaru podczas rozwoju w grasicy ma kluczowe znaczenie dla wytworzenia bezpiecznych i użytecznych limfocytów T. Wady selekcji grasiczy przyczyniają się do rozwoju zaburzeń autoimmunologicznych i niedoboru odporności^1-4.

wchodzą do grasicy jako podwójnie ujemne (DN) tymocyty, które nie wykazują ekspresji koreceptorów CD4 lub CD8. Ekspresja αβTCR i obu koreceptorów zachodzi w stadium podwójnie dodatnim (DP). Oddziaływanie αβTCR z samopeptydem MHC (pMHC) prezentowanym przez komórki grasicy determinuje los tymocytu DP. Oddziaływania o wysokim powinowactwie prowadzą do selekcji negatywnej i eliminacji samoreaktywnych tymocytów. Interakcje o niskim powinowactwie skutkują pozytywną selekcją i rozwojem pojedynczych dodatnich (SP) limfocytów T CD4 lub CD8 zdolnych do rozpoznawania obcych antygenów prezentowanych przez samo-MHC⁵.

Selekcja pozytywna może być badana u myszy z poliklonalnym (dzikim) repertuarem TCR, obserwując powstawanie dojrzałych limfocytów T. Nie są one jednak idealne do badania selekcji negatywnej, która polega na usuwaniu małych populacji specyficznych dla antygenu. Do badania selekcji negatywnej wykorzystano wiele systemów modelowych, ale różnią się one zdolnością do rekapitulacji zdarzeń^{fizjologicznych6}. Na przykład stymulacja tymocytów in vitro nie ma środowiska grasicy, które jest ściśle zaangażowane w selekcję, podczas gdy podawanie egzogennego antygenu może prowadzić do niespecyficznej delecji tymocytów^7-9. Obecnie najlepszymi narzędziami do badania selekcji negatywnej in vivo są myszy, które wykazują ekspresję transgenicznego TCR specyficznego dla endogennego autoantygenu. Jednak wiele klasycznych modeli transgenicznych TCR charakteryzuje się przedwczesną ekspresją transgenicznego łańcucha TCRα na etapie DN, co skutkuje przedwczesną selekcją negatywną. Nasze laboratorium opracowało model HY^cd4, w którym transgeniczny HY TCRα ulega warunkowej ekspresji na etapie DP, umożliwiając dokonanie selekcji negatywnej podczas przejścia DP do SP, jak ma to miejsce u myszy typu dzikiego¹⁰.

Tutaj opisujemy protokół oparty na cytometrii przepływowej do badania pozytywnej i ujemnej selekcji grasicy w mysim modelu HY^cd4. Podczas gdy selekcja negatywna u myszy^{HY cd4} jest wysoce fizjologiczna, metody te można również zastosować do innych modeli transgenicznych TCR. Przedstawimy również ogólne strategie analizy selekcji pozytywnej w repertuarze poliklonalnym mające zastosowanie do dowolnych genetycznie manipulowanych myszy.

Protocol

Patrz Rysunek 1, aby zapoznać się z ogólnym schematem protokołu eksperymentalnego.

1. Sekcja

1. Umieść sterylne siatkowe siatkowe siatka stalowe na szalce Petriego o wymiarach 60 x 15 mm. Na próbkę tkanki potrzebna jest jedna jednostka.
2. Dodaj 5 ml zbilansowanego roztworu soli Hanka (HBSS) do każdego dania. Trzymaj naczynia na lodzie.
3. Eutanazja myszy za pomocą CO₂.
4. Przymocuj mysz do powierzchni preparującej, stroną brzuszną skierowaną do góry. Spryskaj mysz 70% etanolem do sterylizacji i upewnienia się, że futro jest zmatowione.
5. Za pomocą nożyczek chirurgi....

Results

W fizjologicznych modelach transgenicznych TCR i myszach WT, selekcja pozytywna rozpoczyna się w fazie^jasności DP, a następnie przechodzi w fazę^otępienia DP po spotkaniu z antygenem. tymocyty DP wchodzą następnie w przejściowy etap^lo CD4 ⁺ CD8, zanim staną się tymocytami CD4SP lub CD8SP (Figura 2B). Dojrzałe tymocyty SP charakteryzują się wysoką ekspresją TCR i utratą CD24 (ryc. 2C). Podczas gdy profil CD8 przez CD4 może ujawnić de.......

Discussion

Przedstawiony tutaj protokół może być wykorzystany do zbadania selekcji pozytywnej i negatywnej u myszy transgenicznych innych niż TCR i transgenicznych TCR. Protokół ten opisuje barwienie antygenów powierzchniowych. Do dalszej analizy mechanizmów molekularnych często konieczne jest wykonanie barwienia wewnątrzkomórkowego. Używamy BD Biosciences Cytofix/Cytoperm Kit do większości białek wewnątrzkomórkowych oraz BD Biosciences Foxp3 Staining Kit do czynników transkrypcyjnych. Próbki pozyskujemy zazwyczaj natychmiast po ba.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Zbilansowany roztwór soli HyClone Hanka	Thermo Scientific	SH30030.02
Sita z siatki metalowej	Cedarlane	CX-0080-E-01
Szalki Petriego (60 x 15 mm)	Strzykawki Fisher Scientific	877221
(3 ml)	BD Biosciences	309657
Probówki stożkowe (15 ml)	Sarstedt	62.554.205
Mikroskop	Zeiss - Primo Star	415500-00XX-000
Hemocytometr	Hausser Scientific	3110
96-dołkowa płytka	Sarstedt	82.1582.001
Pipeta wielokanałowa	Fisherbrand	21-377-829
Surowica cielęca płodu	PAA	A15-701
Sól fizjologiczna buforowana fosforanami	Fisher Scientific
Azydek sodu	IT Baker Chemical Co.	V015-05
		blokujący FcR	Klon 2.4G2
Przeciw myszom HY TCR	eBioscience	XX-9930-YY*	Klon T3.70
Anty-mysz CD4	eBioscience	XX-0042-YY*	Klon RM4-5
Anty-mysz CD8&alfa;	eBioscience	XX-0081-YY*	Klon 53-6.7
Anty-mysz CD24	eBioscience	XX-0242-YY*Klon	M1/69
Anty-mysz TCRβ	eBioscience	XX-5961-YY*	Klon H57-597
Anty-mysz CD69 Biotynylowany	eBioscience	13-0691-YY*	Klon H1.2F3
Anty-mysz CD5 Biotynylowany	eBioscience	13-0051-YY*	Klon 53-7.3
Streptawidyna	eBioscience	XX-4217-YY*
Cytometr przepływowy	BD Biosciences - FACS Canto 338962
Probówki FACS	BD Biosciences	352052
Oprogramowanie do analizy cytometrii przepływowej	TreeStar - Flowjo	FlowJo v7/9
HyClone RPMI - 1640 medium	Thermo Scientific	SH30027.01
*XX różni się w zależności od fluorochromu, a YY różni się w zależności od wielkości fiolki.