Method Article

Badanie dodatniej i ujemnej selekcji grasicy za pomocą cytometrii przepływowej

DOI:

10.3791/4269

⸱

October 8th, 2012

 ,  ,  , 
1Department of Medical Microbiology and Immunology, University of Alberta

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Prezentujemy metodę opartą na cytometrii przepływowej do badania rozwoju limfocytów T in vivo przy użyciu genetycznie zmodyfikowanych myszy na tle transgenicznym typu dzikiego lub receptora limfocytów T.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zdrowy układ odpornościowy wymaga, aby limfocyty T reagowały na obce antygeny, pozostając jednocześnie tolerancyjnymi na własne antygeny. Losowe przegrupowanie receptora limfocytów T (TCR) α i β loci generuje repertuar limfocytów T o ogromnej różnorodności swoistości antygenowej, zarówno dla siebie, jak i obcego. Wybór repertuaru podczas rozwoju w grasicy ma kluczowe znaczenie dla wytworzenia bezpiecznych i użytecznych limfocytów T. Wady selekcji grasiczy przyczyniają się do rozwoju zaburzeń autoimmunologicznych i niedoboru odporności1-4.

wchodzą do grasicy jako podwójnie ujemne (DN) tymocyty, które nie wykazują ekspresji koreceptorów CD4 lub CD8. Ekspresja αβTCR i obu koreceptorów zachodzi w stadium podwójnie dodatnim (DP). Oddziaływanie αβTCR z samopeptydem MHC (pMHC) prezentowanym przez komórki grasicy determinuje los tymocytu DP. Oddziaływania o wysokim powinowactwie prowadzą do selekcji negatywnej i eliminacji samoreaktywnych tymocytów. Interakcje o niskim powinowactwie skutkują pozytywną selekcją i rozwojem pojedynczych dodatnich (SP) limfocytów T CD4 lub CD8 zdolnych do rozpoznawania obcych antygenów prezentowanych przez samo-MHC5.

Selekcja pozytywna może być badana u myszy z poliklonalnym (dzikim) repertuarem TCR, obserwując powstawanie dojrzałych limfocytów T. Nie są one jednak idealne do badania selekcji negatywnej, która polega na usuwaniu małych populacji specyficznych dla antygenu. Do badania selekcji negatywnej wykorzystano wiele systemów modelowych, ale różnią się one zdolnością do rekapitulacji zdarzeńfizjologicznych6. Na przykład stymulacja tymocytów in vitro nie ma środowiska grasicy, które jest ściśle zaangażowane w selekcję, podczas gdy podawanie egzogennego antygenu może prowadzić do niespecyficznej delecji tymocytów7-9. Obecnie najlepszymi narzędziami do badania selekcji negatywnej in vivo są myszy, które wykazują ekspresję transgenicznego TCR specyficznego dla endogennego autoantygenu. Jednak wiele klasycznych modeli transgenicznych TCR charakteryzuje się przedwczesną ekspresją transgenicznego łańcucha TCRα na etapie DN, co skutkuje przedwczesną selekcją negatywną. Nasze laboratorium opracowało model HYcd4, w którym transgeniczny HY TCRα ulega warunkowej ekspresji na etapie DP, umożliwiając dokonanie selekcji negatywnej podczas przejścia DP do SP, jak ma to miejsce u myszy typu dzikiego10.

Tutaj opisujemy protokół oparty na cytometrii przepływowej do badania pozytywnej i ujemnej selekcji grasicy w mysim modelu HYcd4. Podczas gdy selekcja negatywna u myszyHY cd4 jest wysoce fizjologiczna, metody te można również zastosować do innych modeli transgenicznych TCR. Przedstawimy również ogólne strategie analizy selekcji pozytywnej w repertuarze poliklonalnym mające zastosowanie do dowolnych genetycznie manipulowanych myszy.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Patrz Rysunek 1, aby zapoznać się z ogólnym schematem protokołu eksperymentalnego.

1. Sekcja

  1. Umieść sterylne siatkowe siatkowe siatka stalowe na szalce Petriego o wymiarach 60 x 15 mm. Na próbkę tkanki potrzebna jest jedna jednostka.
  2. Dodaj 5 ml zbilansowanego roztworu soli Hanka (HBSS) do każdego dania. Trzymaj naczynia na lodzie.
  3. Eutanazja myszy za pomocą CO2.
  4. Przymocuj mysz do powierzchni preparującej, stroną brzuszną skierowaną do góry. Spryskaj mysz 70% etanolem do sterylizacji i upewnienia się, że futro jest zmatowione.
  5. Za pomocą nożyczek chirurgicznych rozpocznij sekcję od wykonania brzusznego nacięcia w skórze brzucha tuż nad narządami płciowymi. Przedłuż nacięcie w górę do podbródka.
  6. Od linii środkowej przedłuż nacięcie w dół wzdłuż wszystkich kończyn. Odciągnij luźną skórę i przypnij ją do powierzchni rozwarstwienia.
  7. Zbierz grasicę:
    1. Podnieś dolną końcówkę mostka, aby wykonać nacięcie.
    2. Unikając wątroby, przetnij przeponę, aby odłączyć klatkę piersiową, a następnie przetnij klatkę piersiową z każdej strony. Przetnij klatkę piersiową do góry z każdej strony, uważając, aby omijać płuca i serce.
    3. Delikatnie odciągnij klatkę piersiową do tyłu za pomocą kleszczy. Grasica jest białym, dwupłatowym narządem znajdującym się nad sercem. Używając płaskiej krawędzi kleszczy, aby chwycić dolną część płatów, delikatnie pociągnij grasicę i umieść ją na siatkowym ekranie.
  8. Zbierz śledzionę:
    1. Śledziona to czerwony narząd w kształcie deski surfingowej znajdujący się po lewej stronie jamy brzusznej myszy, poniżej wątroby.
    2. Wykonaj nacięcie w jamie brzusznej. Delikatnie wyciągnij śledzionę jedną parą kleszczy, używając drugiej pary do usunięcia tkanki łącznej. Umieść śledzionę na osobnym siatkowym sicie.

2. Przygotowanie komórek

  1. Za pomocą tłoka ze strzykawki o pojemności 3 ml zmielić narządy na siatce, aż pozostanie tylko tkanka łączna i tłuszcz. Trzykrotnie spłucz siatkę HBSS z naczynia. Do każdej próbki tkanki należy użyć nowego tłoka.
    1. Zamiast tej metody można zastosować inne opcje homogenizacji tkanki.
  2. Policz komórki za pomocą hemocytometru.
  3. Granulki przez odwirowanie w temperaturze 335 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C.
  4. Zawiesić splenocyty w 500 μl buforu do lizy ACK (0,15 M NH4Cl, 10 mM KHC03, 0,1 mM Na2EDTA, pH 7,2) przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Zawiesić tymocyty w stężeniu20 x 10 6 komórek/ml w buforze FACS (PBS, 1% FCS, 0,02% azydku sodu) i odstawić na lodzie.
  5. Przywróć splenocyty do izotoniczności, dodając 5 ml HBSS. Osady splenocytów przez odwirowanie i ponowne zawieś w stężeniu 20 x 106 komórek/ml w buforze FACS. Jeśli komórki muszą pozostać sterylne, możesz użyć sterylnego RPMI + 10% FCS.

3. Barwienie komórek do cytometrii przepływowej

Celem tego protokołu jest nakreślenie strategii analizy selekcji pozytywnej i negatywnej przy użyciu myszy typu dzikiego (WT) i HYcd4. W celu zapoznania się z ogólnymi rozważaniami dotyczącymi projektowania, akwizycji i analizy eksperymentalnej cytometrii przepływowej, odsyłamy czytelników do doskonałej recenzji Tunga i wsp.11

  1. Podwielokrotność 4 x 106 tymocytów na próbkę cytometrii przepływowej do każdej studzienki 96-dołkowej płytki, a także 1 x 106 WT splenocytów na kontrolę kompensacyjną. Jeśli używasz myszy transgenicznych, powinieneś uwzględnić mysz WT jako kontrolę w swoim eksperymencie.
  2. Zablokuj receptory Fc poprzez inkubację komórek z anty-CD16/32 (klon 2,4G2) przez 10 minut na lodzie.
  3. Obracać talerz w temperaturze 335 x g w temperaturze 4 °C przez 5 minut. Zdejmij pokrywkę i rozlej płyn z studzienek, przesuwając płytkę raz w dół, do zlewu. Zawiesić każdą studzienkę w 200 μl buforu FACS. Powtórz pranie.
  4. Przygotować koktajle przeciwciał zgodnie z poniższą listą, stosując optymalne stężenie każdego przeciwciała na podstawie rozcieńczenia w 200 μl buforu FACS na studzienkę. Optymalne stężenie każdego przeciwciała definiuje się jako najniższe stężenie potrzebne do uzyskania największej separacji populacji dodatnich i ujemnych. Jeżeli nie ma populacji ujemnej dla danego przeciwciała, należy włączyć przeciwciało izotypowe. W razie potrzeby całkowitą objętość na studzienkę można zmniejszyć (np. do 100 μl na studzienkę).
    1. Grasica WT: anty-TCRβ, anty-CD4, anty-CD8, anty-CD69 lub anty-CD5, anty-CD24
    2. HYcd4 grasica: anty-HY TCR (T3.70), anty-CD4, anty-CD8, anty-CD69 lub anty-CD5, anty-CD24
      Aby uzyskać lepszą separację populacji CD69lo i CD69hi w tymocytach, zaleca się stosowanie biotynylowanego przeciwciała pierwotnego anty-CD69, a następnie wtórnego barwienia zawierającego streptawidynę sprzężoną z fluorochromem. Tę samą strategię stosujemy do barwienia CD5.
  5. Inkubować komórki z 200 μl koktajlu przeciwciał w buforze FACS przez 30 minut na lodzie w ciemności.
  6. Równolegle z barwieniem koktajlem przeciwciał, wybarwić każdą kontrolę kompensacyjną pojedynczym przeciwciałem sprzężonym z fluorochromem. W idealnej sytuacji barwienie kompensacyjne obejmuje te same przeciwciała, które są stosowane w koktajlu przeciwciał. Jednak barwienie dla każdego pojedynczego antygenu może nie być wykonalne w przypadku większych eksperymentów, gdy testowanych jest wiele antygenów. Dlatego zaleca się barwienie anty-CD4 lub anty-CD8 ze względu na wysoką ekspresję tych antygenów lub użycie kulek kompensacyjnych. Plamić w buforze FACS przez 30 minut na lodzie w ciemności. Pozostaw jedną kontrolkę kompensacyjną niepoplamioną.
  7. Umyj komórki dwukrotnie buforem FACS.
  8. Zawieś komórki w buforze FACS i przenieś do probówek FACS.
  9. Pobrać próbki na cytometrze przepływowym. Uwzględnienie nabycia FSC-A i FSC-W, aby umożliwić dyskryminację dubletową.

4. Analiza danych cytometrii przepływowej - myszy transgeniczne bez TCR

Używamy FlowJo do analizy danych cytometrii przepływowej. Patrz rysunek 2A, aby zapoznać się ze strategią bramkowania dla myszy transgenicznych innych niż TCR.

  1. Używając FSC-A firmy SSC, elektronicznie bramkuje populację "limfocytów".
  2. W populacji "limfocytów" użyj FSC-A przez FSC-W do elektronicznego bramowania populacjilo FSC-W w celu wykluczenia dubletów i agregatów komórkowych. To jest brama "singletowa".
  3. Korzystając ze zdarzeń w bramce "singletowej", wykreśl CD8 po CD4. Narysuj bramki dla populacji DN, DPmatowych, DPjasnych, CD4+CD8lo, CD4SP i CD8SP, jak pokazano na rysunku 2B.
  4. Pod bramkami CD4SP i CD8SP utwórz wykresy TCRβ przez CD24. Użyj narzędzia do bramkowania kwadrantowego, aby narysować bramki, jak pokazano na rysunku 2C.
  5. Utwórz nową działkę z bramki "singletowej": TCRβ firmy CD69. Bramy narysowane A, B, C, D, jak pokazano na rysunku 2D.
  6. Utwórz kolejny wykres z bramki "singletowej": TCRβ firmy CD5. Bramy zremisowane i, ii, iii, iv jak pokazano na rysunku 2E. Jest to kolejna strategia badania selekcji pozytywnej.
  7. Zastosować bramki DN,DP dull, DPbright, CD4int, CD4SP i CD8SP spod "singletu" do bramek i, ii, iii, iv, A, B, C, D (rysunek 2D, E).
  8. Oblicz liczbę komórek w określonym podzbiorze, mnożąc komórkowość narządów przez częstotliwość każdej kolejnej bramki, aż dotrzesz do populacji docelowej. Na przykład liczba tymocytów TCRβhiCD69-CD8SP byłaby określona na podstawie komórkowości grasicy x %TCRbhi CD69- (frakcja D) x %CD8SP.
    1. Liczenie uwzględnia już żywe i martwe komórki, więc nie uwzględniaj bramki "limfocytów" w swoich obliczeniach.

5. Analiza danych cytometrii przepływowej - Myszy transgeniczne TCR

Patrz Rysunek 3A, aby zapoznać się ze strategią bramkowania dla transgenicznych myszy TCR.

  1. Wykonaj kroki 4.1 i 4.2, jak w poprzedniej sekcji.
  2. Pod bramką "singletową" utwórz T3.70 za pomocą wykresu SSC i bramki na populacji komórek T3.70 +, aby przeanalizować limfocyty T specyficzne dla antygenu (Figura 3B). W pewnych okolicznościach interesujące może być porównanie tej populacji z populacją limfocytów T niespecyficznych dla antygenu (T3.70-).
  3. W populacji T3.70+ narysuj bramki DN, DP, CD4SP i CD8SP (ryc. 3C).
    1. W przypadku próbek kontrolnych WT narysuj te bramki pod bramką "singletową" lub utwórz bramkę T3.70-, ponieważ komórek T3.70+ będzie bardzo mało.
  4. Pod bramką CD8SP utwórz wykres T3.70 by CD24. Użyj narzędzia do bramkowania kwadrantowego, aby podzielić komórki na cztery populacje (ryc. 3F).
  5. Utwórz nałożony histogram przedstawiający ekspresję CD69 w przedziale DP myszy WT i przedziale T3.70+ DP myszy HYcd4 (Figura 4A). Powtórz czynność, aby zbadać ekspresję CD5 (Figura 4B).
  6. Oblicz bezwzględną liczbę komórek w każdym podzbiorze zainteresowania, jak w 4.8.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W fizjologicznych modelach transgenicznych TCR i myszach WT, selekcja pozytywna rozpoczyna się w faziejasności DP, a następnie przechodzi w fazęotępienia DP po spotkaniu z antygenem. tymocyty DP wchodzą następnie w przejściowy etaplo CD4 + CD8, zanim staną się tymocytami CD4SP lub CD8SP (Figura 2B). Dojrzałe tymocyty SP charakteryzują się wysoką ekspresją TCR i utratą CD24 (ryc. 2C). Podczas gdy profil CD8 przez CD4 może ujawnić de...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Przedstawiony tutaj protokół może być wykorzystany do zbadania selekcji pozytywnej i negatywnej u myszy transgenicznych innych niż TCR i transgenicznych TCR. Protokół ten opisuje barwienie antygenów powierzchniowych. Do dalszej analizy mechanizmów molekularnych często konieczne jest wykonanie barwienia wewnątrzkomórkowego. Używamy BD Biosciences Cytofix/Cytoperm Kit do większości białek wewnątrzkomórkowych oraz BD Biosciences Foxp3 Staining Kit do czynników transkrypcyjnych. Próbki pozyskujemy zazwyczaj natychmiast po ba...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nie stwierdzono konfliktu interesów.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy chcieliby podziękować Bing Zhangowi za jego pomoc techniczną. Praca ta została sfinansowana przez Kanadyjski Instytut Badań nad Zdrowiem (MOP-86595). T.A.B jest nowym badaczem CIHR i stypendystą AHFMR. Q.H. jest wspierany przez stypendium CIHR Canada Graduate Scholarship - Doctoral oraz stypendium AIHS w pełnym wymiarze godzin. S.A.N. jest wspierany przez stypendium dla absolwentów Królowej Elżbiety II. A.Y.W.S. jest wspierany przez stypendium podyplomowe NSERC - doktoranckie.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Zbilansowany roztwór soli HyClone HankaThermo ScientificSH30030.02
Sita z siatki metalowejCedarlaneCX-0080-E-01
Szalki Petriego (60 x 15 mm)Strzykawki Fisher Scientific877221
(3 ml)BD Biosciences309657
Probówki stożkowe (15 ml)Sarstedt62.554.205
MikroskopZeiss - Primo Star415500-00XX-000
Hemocytometr Hausser Scientific3110
96-dołkowa płytkaSarstedt82.1582.001
Pipeta wielokanałowaFisherbrand21-377-829
Surowica cielęca płoduPAAA15-701
Sól fizjologiczna buforowana fosforanamiFisher Scientific
Azydek soduIT Baker Chemical Co.V015-05
blokujący FcRKlon 2.4G2
Przeciw myszom HY TCR eBioscienceXX-9930-YY*Klon T3.70
Anty-mysz CD4eBioscienceXX-0042-YY*Klon RM4-5
Anty-mysz CD8&alfa; eBioscienceXX-0081-YY*Klon 53-6.7
Anty-mysz CD24eBioscienceXX-0242-YY*KlonM1/69
Anty-mysz TCRβ eBioscienceXX-5961-YY*Klon H57-597
Anty-mysz CD69 BiotynylowanyeBioscience13-0691-YY*Klon H1.2F3
Anty-mysz CD5 BiotynylowanyeBioscience13-0051-YY*Klon 53-7.3
StreptawidynaeBioscienceXX-4217-YY*
Cytometr przepływowyBD Biosciences - FACS Canto 338962
Probówki FACSBD Biosciences352052
Oprogramowanie do analizy cytometrii przepływowejTreeStar - FlowjoFlowJo v7/9
HyClone RPMI - 1640 mediumThermo ScientificSH30027.01

*XX różni się w zależności od fluorochromu, a YY różni się w zależności od wielkości fiolki.

SH3025802Odczynnik

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Liston, A., Lesage, S., Wilson, J., Peltonen, L., Goodnow, C. C. Aire regulates negative selection of organ-specific T cells. Nat. Immunol. 4, 350-354 (2003).
  2. Liston, A. Gene dosage--limiting role of Aire in thymic expression, clonal deletion, and organ-specific autoimmunity. J. Exp. Med. 200, 1015-1026 (2004).
  3. Hogquist, K. A., Baldwin, T. A., Jameson, S. C. Central tolerance: learning self-control in the thymus. Nat. Rev. Immunol. 5, 772-782 (2005).
  4. Liston, A., Enders, A., Siggs, O. M. Unravelling the association of partial T-cell immunodeficiency and immune dysregulation. Nat. Rev. Immunol. 8, 545-558 (2008).
  5. Starr, T. K., Jameson, S. C., Hogquist, K. A. Positive and negative selection of T cells. Annu. Rev. Immunol. 21, 139-176 (2003).
  6. McCaughtry, T. M., Hogquist, K. A. Central tolerance: what have we learned from mice. Seminars in immunopathology. 30, 399-409 (2008).
  7. Zhan, Y. Without peripheral interference, thymic deletion is mediated in a cohort of double-positive cells without classical activation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100, 1197-1202 (2003).
  8. Brewer, J. A., Kanagawa, O., Sleckman, B. P., Muglia, L. J. Thymocyte apoptosis induced by T cell activation is mediated by glucocorticoids in vivo. J. Immunol. 169, 1837-1843 (2002).
  9. Martin, S., Bevan, M. J. Antigen-specific and nonspecific deletion of immature cortical thymocytes caused by antigen injection. European journal of immunology. 27, 2726-2736 (1997).
  10. Baldwin, T. A., Sandau, M. M., Jameson, S. C., Hogquist, K. A. The timing of TCR alpha expression critically influences T cell development and selection. J. Exp. Med. 202, 111-121 (2005).
  11. Tung, J. W. Modern flow cytometry: a practical approach. Clinics in laboratory medicine. 27, 453-468 (2007).
  12. Aliahmad, P., Kaye, J. Development of all CD4 T lineages requires nuclear factor TOX. J. Exp. Med. 205, 245-256 (2008).
  13. Kastner, P. Bcl11b represses a mature T-cell gene expression program in immature CD4(+)CD8(+) thymocytes. Eur. J. Immunol. 40, 2143-2154 (2010).
  14. Albu, D. I. BCL11B is required for positive selection and survival of double-positive thymocytes. J. Exp. Med. 204, 3003-3015 (2007).
  15. Van De Wiele, C. J. Thymocytes between the beta-selection and positive selection checkpoints are nonresponsive to IL-7 as assessed by STAT-5 phosphorylation. J. Immunol. 172, 4235-4244 (2004).
  16. Ueno, T. CCR7 signals are essential for cortex-medulla migration of developing thymocytes. J. Exp. Med. 200, 493-505 (2004).
  17. Saini, M. Regulation of Zap70 expression during thymocyte development enables temporal separation of CD4 and CD8 repertoire selection at different signaling thresholds. Science signaling. 3, ra23(2010).
  18. Hu, Q., Sader, A., Parkman, J. C., Baldwin, T. A. Bim-mediated apoptosis is not necessary for thymic negative selection to ubiquitous self-antigens. J. Immunol. 183, 7761-7767 (2009).
  19. Kisielow, P., Bluthmann, H., Staerz, U. D., Steinmetz, M., von Boehmer, H. Tolerance in T-cell-receptor transgenic mice involves deletion of nonmature CD4+8+ thymocytes. Nature. 333, 742-746 (1988).
  20. McCaughtry, T. M., Baldwin, T. A., Wilken, M. S., Hogquist, K. A. Clonal deletion of thymocytes can occur in the cortex with no involvement of the medulla. J. Exp. Med. 205, 2575-2584 (2008).
  21. Derbinski, J., Schulte, A., Kyewski, B., Klein, L. Promiscuous gene expression in medullary thymic epithelial cells mirrors the peripheral self. Nat. Immunol. 2, 1032-1039 (2001).
  22. Anderson, M. S. Projection of an immunological self shadow within the thymus by the aire protein. Science. 298, 1395-1401 (2002).
  23. Kurts, C. Constitutive class I-restricted exogenous presentation of self antigens in vivo. J. Exp. Med. 184, 923-930 (1996).
  24. Nitta, T., Nitta, S., Lei, Y., Lipp, M., Takahama, Y. CCR7-mediated migration of developing thymocytes to the medulla is essential for negative selection to tissue-restricted antigens. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106, 17129-17133 (2009).
  25. Bouneaud, C., Kourilsky, P., Bousso, P. Impact of negative selection on the T cell repertoire reactive to a self-peptide: a large fraction of T cell clones escapes clonal deletion. Immunity. 13, 829-840 (2000).
  26. Gallegos, A. M., Bevan, M. J. Central tolerance to tissue-specific antigens mediated by direct and indirect antigen presentation. J. Exp. Med. 200, 1039-1049 (2004).
  27. Moon, J. J. Naive CD4(+) T cell frequency varies for different epitopes and predicts repertoire diversity and response magnitude. Immunity. 27, 203-213 (2007).
  28. Bouillet, P. BH3-only Bcl-2 family member Bim is required for apoptosis of autoreactive thymocytes. Nature. 415, 922-926 (2002).
  29. Suen, A. Y., Baldwin, T. A. Proapoptotic protein Bim is differentially required during thymic clonal deletion to ubiquitous versus tissue-restricted antigens. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. , (2012).
  30. Calnan, B. J., Szychowski, S., Chan, F. K., Cado, D., Winoto, A. A role for the orphan steroid receptor Nur77 in apoptosis accompanying antigen-induced negative selection. Immunity. 3, 273-282 (1995).
  31. Zhou, T. Inhibition of Nur77/Nurr1 leads to inefficient clonal deletion of self-reactive T cells. J. Exp. Med. 183, 1879-1892 (1996).
  32. Baldwin, T. A., Hogquist, K. A. Transcriptional analysis of clonal deletion in vivo. J. Immunol. 179, 837-844 (2007).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Thymic SelectionFlow CytometryT Cell DevelopmentPositive SelectionNegative SelectionDouble Positive ThymocytesSingle Positive T CellsTCR Transgenic ModelsAntibody Cocktail StainingHYcd4 Mouse Model

Related Articles