Inżynieria tkankowa jelita w modelu mysim

Erik R. Barthel; Allison L. Speer; Daniel E. Levin; Frédéric G. Sala; Xiaogang Hou; Yasuhiro Torashima; Clarence M. Wigfall; Tracy C. Grikscheit

doi:10.3791/4279

Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Inżynieria tkankowa jelita w modelu mysim

15.3K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/4279

⸱

1 grudnia 2012

Erik R. Barthel¹ , Allison L. Speer¹ , Daniel E. Levin¹ , Frédéric G. Sala¹ , Xiaogang Hou¹ , Yasuhiro Torashima¹ , Clarence M. Wigfall¹ , Tracy C. Grikscheit¹

¹Children's Hospital Los Angeles, Division of Pediatric Surgery, Saban Research Institute, Keck School of Medicine of the University of Southern California

W tym artykule

Podsumowanie

Niniejszy artykuł oraz towarzyszący mu film przedstawiają nasz protokół generowania inżynierowanych tkankowo jelit u myszy, z wykorzystaniem podejścia polegającego na rozmieszczeniu jednostek organoidalnych na rusztowaniu.

Streszczenie

Sztucznie wyhodowane jelito cienkie (Tissue-engineered small intestine, TESI) zostało z powodzeniem wykorzystane do ratowania szczurów linii Lewis po rozległej resekcji jelita cienkiego, co doprowadziło do powrotu do masy ciała sprzed operacji w ciągu 40 dni.¹ U ludzi rozległa resekcja jelita cienkiego może prowadzić do zespołu krótkiego jelita – funkcjonalnego stanu zaburzeń wchłaniania, który wiąże się ze znaczną zachorowalnością, śmiertelnością i kosztami opieki zdrowotnej, w tym z zależnością od żywienia pozajelitowego, niewydolnością i marskością wątroby oraz koniecznością wielonarządowego przeszczepu.² W niniejszym artykule opisujemy i dokumentujemy nasz protokół tworzenia sztucznie wyhodowanego jelita w modelu mysim z zastosowaniem podejścia opartego na wielokomórkowych jednostkach organoidowych na rusztowaniu. Jednostki organoidowe są wielokomórkowymi agregatami pochodzącymi z jelita, które zawierają elementy zarówno śluzówkowe, jak i mezenchymalne,³ a relacja między nimi pozwala na zachowanie niszy komórek macierzystych jelita.⁴ W toczących się i przyszłych badaniach przeniesienie naszej techniki na model mysi pozwoli na zbadanie procesów zachodzących podczas formowania TESI z wykorzystaniem narzędzi transgenicznych dostępnych u tego gatunku.⁵ Dostępność szczepów myszy z niedoborem odporności pozwoli nam również zastosować tę technikę do ludzkiej tkanki jelitowej i zoptymalizować tworzenie ludzkiego TESI jako ksenoprzeszczepu mysiego przed jego wdrożeniem u ludzi. Nasza metoda wykorzystuje odczynniki i materiały zgodne z Dobrą Praktyką Wytwarzania (GMP), które zostały już zatwierdzone do stosowania u pacjentów, co stanowi znaczącą przewagę nad podejściami opartymi na decelularyzowanych tkankach zwierzęcych. Ostatecznym celem tej metody jest jej translacja na ludzi jako terapeutyczna strategia medycyny regeneracyjnej w leczeniu zespołu krótkiego jelita.

Protokół

1. Przygotowanie jednostek organoidalnych

Narzędzia odpowiednie do sekcji myszy (nożyczki i pęsety) należy wysterylizować w autoklawie.
Przeprowadź humanitarną eutanazję myszy dawcy zgodnie z lokalnymi protokołami IACUC. Przed kontynuowaniem upewnij się, że zwierzę nie żyje.
Wykonaj nacięcie w linii środkowej, aby uzyskać dostęp do jamy otrzewnej. W razie potrzeby można odchylić płaty skóry, aby poprawić widoczność.
Wyciśnij jelito cienkie i przetnij je tuż za więzadłem Treitza. Oddziel jelito cienkie od jego krezki, stosując ostrą i delikatną rozdzielczą technikę tępego rozdzielania. Zidentyfikuj połączenie kątniczo-jądrzowe i przetnij jelito cienkie 5 mm proksymalnie od tego miejsca.
Za pomocą nożyczek otwórz jelito wzdłuż krawędzi antykrezkowej w szalce Petriego zawierającej 10 ml sterylnego, schłodzonego do 4 °C roztworu soli Hanksa (HBSS, Invitrogen, Carlsbad CA) / 1X roztworu antybiotyków i przeciwgrzybicznych (Anti-Anti, Invitrogen). Usuń masę kałową z otwartego jelita poprzez delikatne wstrząsanie, a następnie przenieś otwarte jelito do probówki wirówkowej o pojemności 15 ml z 10 ml sterylnego HBSS / 1X anti-anti w temperaturze 4 °C.
Umyj otwarte jelito trzykrotnie w 10 ml sterylnego HBSS / 1X anti-anti w temperaturze 4 °C w probówce. Każde płukanie można przeprowadzić, delikatnie wstrząsając probówką 15 ml przez 30 s. Po wstrząsaniu tkanka jelitowa opada na dno probówki. Usuń pływający materiał, który stanowi resztki mezenchymy. Ostrożnie odessij roztwór płuczący za pomocą pipety.
Posiekaj wypłukane jelito w szalce Petriego z 10 ml sterylnego HBSS / 1X anti-anti w temperaturze 4 °C na kawałki o wielkości mniejszej niż 1 mm² za pomocą nożyczek. Zbierz posiekany materiał automatyczną pipetą i umieść go w probówce.
Wirować probówkę przy 500 rpm przez 8 min. Odlej nadsącz, który zawiera tłuszcz i mezenchymę.
Przetraw posiekany i wypłukany materiał w 10 ml sterylnego HBSS / 1X anti-anti z dodatkiem 0,125 mg/ml dyspazy (Invitrogen) i 800 jednostek/ml kolagenazy typu 1 (Worthington, Lakewood NJ). Aby przygotować 40 ml roztworu trawiennego, odważ 5 mg dyspazy, 142 mg kolagenazy i dodaj sterylny HBSS do uzyskania objętości 40 ml. Roztwór ten należy przygotowywać świeżo przy każdym przygotowywaniu jednostek organoidów i przechowywać w temperaturze 4 °C do momentu użycia. Dodaj roztwór trawienny bezpośrednio do osadu z kroku 1.8.
Inkubuj probówkę zawierającą posiekany i wypłukany materiał z roztworem trawiennym w temperaturze 37 °C przez 20 min.
Wyjmij probówkę i dalej rozdrabniaj przetrawioną tkankę poprzez tryturację pipetą 10 ml. Powtarzaj czynność od 20 do 50 razy, aż do uzyskania jednorodnego wyglądu.
Wirować probówkę przez 5 min przy 800 rpm. Odlej nadsącz, który zawiera pojedyncze komórki.
Zatrzymaj reakcję trawienia, dodając 10 ml sterylnego, schłodzonego do 4 °C podłoża DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium, Invitrogen) z dodatkiem 10% v/v inaktywowanej termicznie płodowej surowicy bydlęcej (HI-FBS, Invitrogen). Resuspenduj osad i wstrząśnij probówką.
Wirować probówkę przez 5 min przy 800 rpm. Ostrożnie usuń nadsącz automatyczną pipetą, aż do ostatnich kilku kropli. Do usunięcia ostatnich kilku kropli użyj jednorazowej plastikowej pipety, aby uniknąć ponownego zawieszenia osadu.

2. Obciążanie rusztowania z kwasu poliglikolowego

Przygotować cylindryczne rusztowania o długości 2 mm i średnicy zewnętrznej 5 mm z niewiązanego kwasu poliglikolowego (grubość arkusza 2 mm, gęstość objętościowa 60 mg cm-3; porowatość > 95%, Concordia Fibers, Coventry RI) zgodnie z opisem w Ref. 4.
Odciąć nożyczkami, zdezynfekowanymi 70% etanolem w wodzie destylowanej, końcowe 2 mm jednorazowego końcówki do pipety o pojemności 1000 microliter.
Umieścić rusztowanie w 4-dołkowej płytce hodowlanej. Za pomocą pipety o pojemności 1000 microliter nanieść jednostki organoidów na rusztowanie, najpierw do światła, a następnie na powierzchnię zewnętrzną. Użyć pęsety, aby zapewnić pokrycie światła. Nie naruszać ani nie rozrywać cylindrycznego kształtu polimeru.

3. Implantacja do myszy biorcy

W razie możliwości należy użyć syngenicznego myszego gospodarza o tym samym tle genetycznym co dawca. W przeciwnym razie należy zastosować zwierzę z niedoborem odporności typu NOD/SCID (nonobese diabetic / severe combined immunodeficient) (Jackson Laboratories, Sacramento CA).
Zastosować znieczulenie ogólne izofluranem. Ogolić, przygotować i obłożyć sterylną ściereczką brzuch myszy.
Wyonać nacięcie w linii środkowej o długości 5 mm, aby uzyskać dostęp do jamy otrzewnej. Zlokalizować i ostrożnie wyciągnąć sieciówkę większą. Umieścić załadowany polimer na sieciówce i owinąć go tkanką. Należy unikać przerwania ciągłości sieciówki.
Przymocować polimer do sieciówki szwem monocryl 5-0. Delikatnie umieścić sieciówkę z owiniętym polimerem w jej anatomicznej pozycji.
Zamknąć nacięcie brzuszne warstwowo, używając szwów vicryl 4-0. Przeszyć mięśnie, dbając o to, aby nie uszkodzić narządów jamy brzusznej poniżej nacięcia. Do zamknięcia skóry należy użyć szwów przerywanych.
Podać przeciwbólowo po operacji 2 mg/kg ketoprofenu (Ketofen, Fort Dodge Animal Health) w wodzie sterylnej w formie podskórnej guli w sąsiedztwie nacięcia. Stan zwierząt należy oceniać codziennie; jeśli zwierzę wykazuje objawy bólu lub stresu, w 2. dobie pooperacyjnej można podać dodatkową dawkę ketoprofenu. Do trzeciej doby po operacji zwierzę powinno całkowicie dojść do siebie, bez oznak bólu lub stresu. Jeśli ból lub stres utrzymują się w 3. dobie pooperacyjnej, uznaje się to za stan nieprawidłowy i należy podjąć działania zgodnie z protokołami IACUC oraz placówki opieki nad zwierzętami.
Pozostawić mysz do rekonwalescencji i pozwolić na wzrost inżynieryjnie wytworzonemu jelitu przez cztery tygodnie. Zapewnić zwierzęciu dostęp ad libitum do karmy dla gryzoni (Lab Diet 5001, PMI Nutrition, St. Louis MO) oraz wody z dodatkiem Septry (200 mg / 40 mg na 5 ml, Hi-Tech Pharmacal, Amityville NY) w rozcieńczeniu 1:100.

4. Zbiór

Humanitarnie uśmierć zwierzę gospodarza cztery tygodnie po implantacji.
Ponownie otwórz pierwotne cięcie i odsunąłem skórę w kierunku głowowym, aby ułatwić dostęp do jamy otrzewnej.
Rozetnij warstwę mięśniową i zidentyfikuj konstrukt inżynierii tkankowej w postaci kuli tkanki.
Usuń zrosty konstruktu z narządów wewnątrzbrzusznych za pomocą dyssekcji ostrej.
Utrwal konstrukt w formalinie do późniejszego z embeddingu w parafinie lub wykorzystaj świeżą tkankę do analiz biochemicznych, takich jak real-time PCR lub izolacja białek.